实验四 进行性肌营养不良症（实验四 进行性肌营养不良症（ DMDDMD ））基因检测基因检测

• 进行性肌营养不良症 (Duchenne muscular dystrophy ， DMD) 是肌肉组织的遗传病，特点是进行性加重的肌肉萎缩和无力。

• 本病呈 X 连锁隐性遗传，一般男性儿童发病。

Genetics of DMD OMIM# 310200Genetics of DMD OMIM# 310200

• occurring in about 1 in 3500 males, • X-linked recessive, lethal in males, • 1/3 of patients are new mutants;• 2/3 have carrier mothers, • Gene location Xp21, • large gene (more than 2000 kb), 79 exons. • High mutation rate, 60% to 65% of the

mutations are deletions, and about 6% are duplications ,

• Allelic mutations in the same gene cause a milder disorder, Becker muscular dystrophy.

Duchenne Muscular Dystrophy, DMD

• DMD 基因定位于 Xq21.2-21.3 之间， 79 个外

显子组成，编码 3685 个氨基酸、分子量为 42

7 kD 的蛋白质一抗肌营养不良蛋白

(dystrophin) ，这种蛋白具有稳定细胞膜和细

胞内钙调节的功能。

• 抗肌营养不良蛋白的编码基因有多种突变形式， 60 ％是外显子缺失突变，通常选择DMD 基因中 9 个缺失热点的外显子扩增，可检出缺失突变中的 90% 。

• 本实验设计为扩增 DMD 基因中 4 个外显子，其中外显子 45 和 48 在中国患者中的检出率分别为 26% 和 48% 。

DMD 基因 4 个外显子的引物顺序见表：

外显子 PCR 产物大小 引物 F 引物 R

8 360 gtcctttacacactttacctgttgag ggcctcattctcatgttctaattag

19 459 ttctaccacatcccattttcttcca gatggcaaaagtgttgagaaaaagtc

45 547 aaacatggaacatccttgtggggac cattcctattagatctgtcgccctac

48 506 ttgaatacattggttaaatcccaacatg cctgaataaagtcttccttaccacac

聚合酶链反应（ polymerase chain reaction, PCR ）是一种体外由引物介导的特定 DNA 序列的酶扩增方法，由于此方法对样本要求的微量性以及它特异、敏感、高速的特性，近年来得到广泛应用。全过程是基于一套“三步曲”的若干轮次的循环组合而成的。依次为 DNA 模板热变性，双链 DNA 解链成单链；在低温下与引物退火，引物与单链 DNA 互补配对；在适宜温度下 Taq DNA 聚合酶催化引物延伸。以上三步为一个循环，循环 25-35 次，模板DNA 可扩增 100 万倍左右，整个反应可在 2 到 3 小时内完成。

PCR操作如下：

每一个薄壁离心管中加入试剂的量为：（反应总体积为 25l ）：

双蒸水 17.8 l

10XBuffer 2.5 l

MgCl2 2 l

dNTPs 0.5 l

Primer R+F ( 混合 ) 1.4 l

DNA 模板 0.5 l

Taq-DNA 聚合酶 0.3 l

石蜡油 1滴

放置在 PCR循环仪上，循环参数设置为：

Step 1 (1个循环 ) 94C 5分钟

Step 2 (30个循环 ) 94C 30秒

56C 30秒

72C 30秒

Step 3 (1个循环 ) 72C 7分钟

琼脂糖凝胶电泳 (agarose gel electrophoresis ):

①   配制 2% 的琼脂糖凝胶

配制 1×TBE 电泳缓冲液 70ml 于三角烧瓶中，称取 1.4 克的琼脂 糖粉放入后，微波炉加热熔化 , 冷却至 60℃，加入溴乙锭 (EB) ，倒入电泳槽中，插入梳子，待凝固。

②    向电泳槽中倒入 1×TBE ，没过胶面 2mm ，小心移去梳子。

③    取 PCR 扩增样品 15l 加入 3l 的 6× 载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内。

④ 接通电源，一般红色为正，极黑色为负极，切记 DNA 样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负 )。 140V ，电泳 2 小时左右。

⑤ 卸下凝胶，于紫外仪上观察电泳条带，并与核酸分子量标准PUC19/Msp (marker)Ⅰ 比较。

10l PCR 产物

混匀

加样

电泳(140V,2hr)

紫外灯下观察

2 l 6*loading buffer

注意事项：

1 、引物设计时长度 15～ 30 个碱基为宜， G+C含量一般为 40%～ 60% 。

2 、退火温度决定 PCR 反应的特异性，退火温度高 PCR 反应的特异性好；温度低，有时会有非特异性条带。

3 、 Mg2+浓度对扩增产物的特异性及产量有显著影响， Mg2+浓度低，扩增产物的特异性好，但有时产量低； Mg2+浓度高，扩增产物的特异性差，有非特异性条带。

4 、 PCR 循环的次数主要取决于模板 DNA 的浓度。理论上 25-30 次循环后， PCR 产物积累即可达到最大值。在满足产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。