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第二节 噬菌体或病毒 DNA

组成组成：：蛋白质、核酸蛋白质、核酸 ..

结构：结构：蛋白质外壳、尾巴蛋白质外壳、尾巴

尾巴上的尾巴上的微丝微丝可以把噬菌可以把噬菌体的体的 DNADNA 注入细菌内。注入细菌内。

是比细菌还小得多的微生是比细菌还小得多的微生物，噬菌体侵犯细菌，可以物，噬菌体侵犯细菌，可以认为它是细菌里的认为它是细菌里的“寄生“寄生虫”虫”。。

Bacteriophage(phage)

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一、大肠杆菌的 λ- 噬菌体 DNA

（ 1 ）线状双链 DNA ，两端各有一个 12bp 的互补单链（粘性末端， cohesive-end site ），称 λcos site ，粘性末端粘连接变成环状 DNA 。

（一） λ- 噬菌体的生物学特性1 、由外壳包装蛋白和 λ-DNA 组成

λcos 位点是噬菌体包装必需序列。

2 、 λ-DNA 的物理图谱

48.5kb

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（ 2 ）功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少 61 种，一半为必需基因

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λ 噬菌体基因大致分为 4 个区：

• 裂解区： O-R 基因 •调控区：启动子、终止子和 N 、 CI 基因

•重组区： att（ attachment ）、 int（ intagrate ）及 xis（ excision ）

•结构区： A ～ J19 个基因，编码头、 尾部蛋白质

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3 、感染周期（溶菌循环）

•λDNA 复制早期：一个 ori ，双向复制•晚期：滚环复制 -- 多个 λDNA 分子形成线状多联体

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头部包装蛋白首先结合在 cos 区的附近，形成包装启动复合物， A 蛋白切割 cos 位点。

包装

EE

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44 、溶源状态的建立、溶源状态的建立 噬菌体感染大肠杆菌后， DNA 直接整合到宿主细胞染色体 DNA 上，并不裂解细胞，这种情况称为溶源状态。

DNA 重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。

整合主要由 cI和 int基因的产物所激活，这两个基因的开放与关闭取决于宿主细胞本身的性质。cI 基因：编码阻遏蛋白，是感染了 λ 噬菌体的寄主细胞进入溶源化的必要条件。 cI 基因失活或缺失的 λ 噬菌体无法使寄主细胞发生溶源化效应。

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噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌染色体 DNA 上，成为原噬菌体。

适当条件下，原噬菌体又可以脱离寄主染色体，重新变成独立的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。

超感染免疫性

λ 噬菌体 DNA 的整合与删除：

溶源性细菌，由于含有原噬菌体，故不能再次被同种噬菌体感染。溶源性细菌所具有的这种抗御同种噬菌体再感染的特性叫做超感染免疫性。

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噬菌体的溶源和裂解

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插入型载体、取代型载体

（二） λ-DNA 载体的构建

根据切除的多少，将 λ-DNA 分为两大类载体：

1 、缩短长度野生型 : 上限 51kb λ-DNA ： 48.5kb ，外源基因 2.5kbλ-DNA 上有 40-50% 的 DNA 是复制，裂解所不必需的，切除便提高装载量。左侧区包括使噬菌体 DNA 成为一个成熟的、有外壳的病毒颗粒所需的全部基因，全长约 20kb 右侧区内包含所有的调控因子、与 DNA 复制及裂解宿主菌有关的基因，这个区域约长 12kb 。中间区域约长 18kb ，这一段DNA 可以被外源置换而不会影响噬菌体 λ 裂解生长的能力。

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插入型载体（ insertion vector ）

经改造后只具有一个可供外源 DNA 插入的克隆位点 , 长度为 37kb ，为包装的下限，它本身也能被包装，允许插入片段最大为 14kb.

必须携带标记基因λgt10 ，可以携带 8kb 的 DNA 分子，插入位于 cI 基因内的单一的酶切位点 EcoRI 。插入失活导致裂解循环，从而很容易识别重组子。λZAPII ，含有多聚接头，可以使用六种不同的限制性内切酶插入约 10kb 的新的 DNA 分子，通过 lacZ’ 基因的插入失活鉴定重组子，不能形成蓝色的噬菌斑。

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取代型载体（ substitution vector ）

具有成对的克隆位点 ,空载的载体 DNA 只 26kb ，不能被包装，无法进入受体细胞中去 , 不需要标记基因 .

该类载体经改造后的长度约为 40kb ，但在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如EcoRI 、 HindIII 、或 saλI ），两者间的距离为 14kb 长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb 长的 DNA片段，然后用外源 DNA片段取代之。

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1) Charon 系列 设计克隆外源 DNA 大片段的 取代型载体2) EMBL 系列 设计克隆外源 DNA 大片段 的 取代型载体。 优点：便于将外源 DNA片段从重组体分子上切下。

3) 入 -DASH 系列

含有 方向互为相反 的两套多 克隆位点接头序列，

优点 : 便于多种 外源 DNA 大片段的 取代重组。

4) 入 -gt 系列

插入型表达 载体可用来克隆表达外源 c-DNA ，

优点 : 载体上温度敏感型阻遏物 , 用来控制复制

及融合蛋白的表达。

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插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb 以内）的外源 DNA片段的插入，广泛应用于 cDNA及小片段DNA 的克隆。

应用：应用：

替换型载体可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体 DNA 。

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删除重复的酶切位点 :野生型 λDNA 链上有5 个 EcoRI 位点和 7 个 HindIII 位点，不利于

重组操作，必须删除至 1-2 个 .

为了便于各种来源的 DNA 片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点 .

2 、酶切位点的删除或增加

采用定点突变技术或甲基化酶处理必需区内的酶识别序列使其失活。

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33 、灭活某些与裂解周期有关的基因、灭活某些与裂解周期有关的基因 将无义突变引入噬菌体裂解周期所需的基因，如将头部包装蛋白基因的 CAG突变成 UAG 。这些噬菌体只能在具有特异校正基因编码产物的菌株内繁殖。 当这种 λDNA 进入一般大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，可阻止有害重组体的生物污染及扩散。基因工程实验中使用的受体是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。

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4 、加装选择标记

野生型 λ-DNA 上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是 λ-DNA克隆载体构建的重要内容。

选择标记主要有两类：免疫功能类标记颜色反应类标记

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(1)(1) 免疫功能失活标记 (cIcI 筛选筛选 )

加装选择标记 cI基因cI基因编码一种阻止 λ- 噬菌体

进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的 λ- 载体进入

受体细胞后，建立溶源状态，细菌生长缓慢，形成混浊斑；

•当外源 DNA 插入到标记基因中，基因灭活， λ- 重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。

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(2)(2)加装选择标记加装选择标记 lacZlacZ （（蓝白斑筛蓝白斑筛选）选） lacZ 基因编码 β- 半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal 生成蓝色化合物。当外源基因插入到 lacZ

基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体 λ-DNA则产生蓝色透明斑。

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5、建立 -噬菌体的体外包装系统体外包装原理： λ 噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。•头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部和头部蛋白所需的蛋白因子；

将这两种突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。

•尾部基因发生了突变的噬菌体则只能形成头部和尾部蛋白所需的蛋白因子。

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不具有琥珀型突变体校正功能的菌株

λDNA 的体外包装作用，在离体条件下，将重组体 DNA包入噬菌体等病毒颗粒中的过程，以形成有功能的病毒

载体

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（三）（三） λ-DNAλ-DNA 作为载体的优点作为载体的优点• 可在体外包装成噬菌体颗粒，高效转染大肠杆菌λ-DNA 载体的装载能力为 25 kb ，远远大于质粒的装载量重组 λ-DNA 分子的筛选较为方便重组 λ-DNA 分子的提取比质粒容易 .

•λ-DNA 载体适合克隆和扩增外源 DNA片段，常用于 构建基因文库缺点：缺点：(1)(1) 需要包装比较麻烦，包装率又不稳定，购买包装蛋需要包装比较麻烦，包装率又不稳定，购买包装蛋白的费用又高；白的费用又高；(2)(2) 没有质粒的用途广泛。没有质粒的用途广泛。

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（一）柯斯质粒的构建考斯质粒：一类人工构建的含有 λDNA 两端 cos 序列和质粒复制子的特殊类型的载体。

二、柯斯质粒（ cosmid ）

组成：抗性标记、质粒复制起始部位、限制型内切酶切位点、 cos 粘性末端

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（二）柯斯质粒的特点1 、具有 λ 噬菌体的特性。 具有 cos 位点，能像λ-DNA 一样体外包装，并高效导入受体细胞。2 、具有质粒载体的持性。可以在受体细胞内 自由复制。3 、 具有高容量的克隆能力。可以装载比质粒或λ-DNA 大得多的外源 DNA片段， 40kb 。4 、 便于筛选：携带质粒的选择标记 。5 、便于克隆：有质粒上的多种单一酶切位点。6 、不能体内包装，不裂解受体细胞

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““柯斯克隆”柯斯克隆”（（ cosmid cloningcosmid cloning ））

利用C

os

质粒进行克

隆

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（一）生物结构 外形呈丝状由外壳包装蛋白和正链DNA 组成；不裂解宿主细胞，但抑制其生长。DNA全长 6407 个核苷酸约有 10 个基因

三、大肠杆菌的 M13单链噬菌体 DNA

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• 单链 DNA，由 6407碱基组成。• 90%以上的序列可编码蛋白质，共有 11个编码基因• 基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因Ⅷ和基因Ⅲ以及基因Ⅱ和基因Ⅳ之间，其间有调节基因表达和 DNA合成的元件。

M13噬菌体的基因组

• 编码3 类蛋白质：①复制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ和Ⅹ）②形态发生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ和Ⅺ）

③结构蛋白（基因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ）

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( 二 ) 感染周期

θ 复制

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（三） M13 DNA 载体的构建

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M13噬菌体作为载体具有几个重要的特点：

①M13噬菌体的感染与释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主菌生长缓慢；

②M13噬菌体 DNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链，通过感染或转化的方法能将 M13噬菌体 DNA导人宿主菌中；

③M13噬菌体的包装不受 DNA大小的限制，其噬菌体颗粒的大小可随 DNA的大小而改变，即使 DNA的大小比本身 DNA的大小超出 6 倍，仍能进行包装。

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⑤M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的 RF DNA：单链 DNA的酶切和连接是比较困难的。

⑥外源片段插入位点在基因Ⅱ和基因Ⅳ之间的 508bp间隔区 ----M13不像 λ 噬菌体基因组那样含有较大的可替代区。它的基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源 DNA（基因Ⅱ /Ⅳ和基因Ⅷ /Ⅲ之间）。

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4 、缺点：包装能力有限，仅包装克隆DNA 为1.5kb 。

（四） M13DNA 载体的特点1 、克隆的 DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，在 DNA 定向突变中非常有用 .

2 、 M13 重组体筛选简便可以利用菌落的蓝白斑筛选转染的转化子

3 、制备的单链 DNA 、双链 RF-DNA M13 噬菌体，不经体外包装，可以转染大肠杆菌受体。

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噬菌粒是一类人工构建的含有噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、单链噬菌体包装序列、复制子复制子以及以及质粒复制子、克隆位点、标记基因质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊的特殊类型的载体。类型的载体。

四、噬菌粒（噬菌粒（ phagemid or phasmidphagemid or phasmid ））

能像能像 M13M13 DNADNA那样体外包装，并高效转染那样体外包装，并高效转染受体细胞，制备受体细胞，制备单链单链 DNADNA

像像质粒质粒那样在受体细胞中自主复制，那样在受体细胞中自主复制，克隆双链克隆双链 DNADNA

重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易

装载量装载量比比 M13M13系列要系列要大大很多（很多（ 10 kb10 kb ））

组成特点：组成特点：

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• 含有一个质粒的复制起点，因此在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规方法，复制形成大量的双链 DNA 分子；

• 具有小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA ，可克隆高达 10kb 的外源 DNA 片段，并易于进行体外分离与操作；

• 编码有一个 ampr 基因作为选择记号，因此只有携带着 pUCll8 或 pUCll9 噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨千青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择；

• 拷贝数含量高，每个寄主细胞可高达 500 个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体 DNA ；

载体特点：载体特点：

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• 存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA 限制片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；

• 由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌 lacZ 基因的 5′- 端编码区，故可按照 Xgal-IPTG 组织化学显色反应试验，筛选重组体分子；

• lacZ 基因是置于 lac 启动子的控制之下，这样插入的外源基因（当其读码结构没有发生改变的情况下）便会以融合蛋白质形式表达，即产生出 β 半乳糖管酶与外源蛋白质的融合产物；

• 带有一个 M13 噬菌体的复制起点，所以在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单链 DNA 拷贝，并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中；

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五、人工染色体克隆载体（ artificial chromosome vector ）

基本元件：含有质粒克隆载体所必需的第一受体（大肠杆菌）的质粒复制起始点；第二受体（如酵母菌）染色体 DNA着丝点、端粒和复制起始点的序列 .合适的选择标记基因。

利用染色体的复制元件来驱动外源 DNA片段复制的载体。

酵母人工染色体（ YAC ）细菌人工染色体（ BAC ）

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（一）酵母人工染色体（ YAC ） 把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使酵母 chr的转录功能和复制功能。

装载量为 350-400kb

含有的元件：酵母 4号染色体的复制起点和着丝粒序列

四膜虫大核 rDNA 分子末端端粒重复序列

质粒复制起点质粒选择标记

酵母系统的选择标记

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克隆位点：位于 sup4 基因内• SuP4 是一个赭石突变（ UAA ）抑制基因。• 宿主酵母菌的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突

变 ade2 。•在赭石突变宿主中，没有外源基因插入时， sup4

基因抑制赭石突变，则形成正常白色菌落；

•有外源基因插入时， sup4 基因遭破坏，则 形成红色菌落，十分容易挑选出有 DNA 插入片段的红色菌落，建成 YAC文库。

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酵母人工染色体的使用

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酵母人工染色体（ YAC ）缺点

1 、插入片段大，稳定性差2 、内部存在重组和嵌合现象3 、 YAC 染色体与宿主细胞的染色体大小

相近，影响了 YAC 载体的广泛应用

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（二）细菌人工染色体（ BAC ）

在大肠杆菌性因子 F 质粒的基础上构建的，在大肠杆菌受体菌维持单一拷贝，装载量范围在 50-300kb之间。用于：克隆大型基因簇结构 构建动植物基因文库

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Structure of a bacterial artificial chromosome (BAC), used for cloning large fragments of donor DNA. CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance. oriS, repE, parA, and parB are F genes for replication and regulation of copy number. cosN is the cos site from l phage. HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted. The two promoters are for transcribing the inserted fragment. The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment.

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（三）人工染色体克隆载体的应用（三）人工染色体克隆载体的应用

1 、构建基因组文库2 、基因治疗3 、基因功能鉴定

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练习题练习题1. 列举质粒载体必须具备的基本特性。 2.某一质粒载体具有 Tetr和 Kanr的表型，在 Kan抗性基因内有一 Bgl I的切点。现用 Bgl I切割该载体进行基因克隆，问（ 1）涂皿时应加什么样的抗生素 ?(2) 培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型 ?(3) 如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体 ?3.YAC 载体具有什么样的功能性 DNA 序列 ? 为什么在克隆

大片段时， YAC 具有优越性 ?4.如何将野生型的 λ- 噬菌体改造成为一个理想的载体 ?5. 什么是蓝白斑筛选法和 c I 筛选法 ?