1

ENA ViraStripe® IgG Диагностический набор для определения IgGИммунодиагностический метод для качественного обнаружения IgG-специфичных антител к ENA в человеческой сыворотке.ENA ViraStripe® IgG использует ENA-специфичные экстрагируемые антигены клеточного ядра: Sm, Sm/RNP, SSA (ro), SSB (La), Scl-70 и Jo-1.Каждая полоска имеет интегрированную систему контроля, включающую контроль сыворотки, контроль конъюгата и пороговый контроль.Диагностический набор для определения IgG 50 тестов: № продукта: V-ENSGOKОбразец для тестирования: 20 мкл сывороткиВремя тестирования: 90 минутХранение/Стабильность: около 12 месяцев при 2-8 °CКомпоненты диагностического набора50 полосок Полоски с антигенами, полоски из нитроцеллюлозы с системой контроля и ENA-специфичными антигенами ваналитической секции; код полоски: EN, пронумерованны от 1-50 (№ продукта: V-ENSGAS)9 мл Конъюгат щелочной фосфатазы против IgG человека, 10-кратный концентрат (№ продукта: V-UVNGKI)100 мл Буфер для разведения/промывки, 10-кратный концентрат

(№ продукта: V-UVNUWP)1 уп. Порошок для разведения/промывки (№ продукта: V-UVNUMP)90 мл Раствор хромоген/субстрата, готовый к использованию (№ продукта: V-UVNUCS)1 шт. Инструкция по применению диагностического набора ENA ViraStripe® IgG для определения IgG2 шт. Протокол оценки диагностического набора ENA ViraStripe® IgG для определения IgG, с изображением полоски положительного

контрольного образца (PC EN)Буфер для разведения/промывки, порошок для разведения/промывки и раствор хромоген/субстрата взаимозаменяемы междуразличными ViraStripe ® и ViraBlot ® диагностическими наборами.Доступны дополнительно:0,33 мл ENA IgG Положительный контрольный образец, человеческая сыворотка, готовая к использованию (№ продукта: V- ENSGPK)0,33 мл ENA IgG отрицательный контрольный образец, человеческая сыворотка, готовая к использованию (№ продукта: V- ENSGNK)9 мл Конъюгат щелочной фосфатазы с антителами против IgМ человека, 10-кратный концентрат, жидкий (№ продукта: V- UVNMKI)9 мл Конъюгат щелочной фосфатазы с антителами против IgА человека, 10-кратный концентрат, жидкий (№ продукта: V- UVNAKI)Хранение и стабильность реактивовПолоски с антигенами: полоски в закрытых упаковках устойчивы до истечения срока годности, если хранятся при температуре 2-8 °C. Плотнозакрывайте пакеты с не использованными полосками.Конъюгат, 10-кратный концентрат: устойчив до истечения срока годности, если хранится при при температуре 2-8 °CРабочий раствор: использовать немедленно.Буфер для разведения/промывки: концентрат и порошок: устойчив до истечения срока годности, если хранится при температуре 2-8 °CРабочий раствор буфера: 2 недели годен к использованию если хранится при температуре 2-8 °C.Рабочий раствор буфера может быть сохранен в необходимых количествах в течение более длительного времени в замороженном состоянии.Раствор хромоген/субстрата: устойчив до истечения срока годности, если хранится температуре 2-8 °C. Хранить в темном месте!Подготовка реактивов и исследуемого образцаПеред использованием доведите все компоненты теста до комнатной температуры (20-25°C).Полоски с антигенами:Тщательно отделите требуемое число полосок при помощи пинцета. Касайтесь полосок пинцетом только в области маркировки.Буфер для разведения/промывки (рабочий раствор):Чтобы подготовить рабочий раствор буфера, разведите 10-кратный концентрат в пропорции1:10 дистиллированной водой (100 мл концентрата + 900мл дистиллированной воды), добавьте порошок для разведения/промывки до полного растворения. Поместите рабочий раствор буфера на 10 - 15минут на магнитную мешалку, pH = 7,5 ± 0,1.Конъюгат (рабочий раствор):Растворите необходимое количество 10-кратного концентрата согласно таблице (1): Раствор всегда готовится свежий во время процедурыпромывания (пункт 7 проведения теста).Другие реактивы: готовы к использованию.Образцы пациента:Используйте 20 мкл неразведенной сыворотки на один тестДополнительно доступные контроли:Используйте 100 мкл каждого положительного, порогового и отрицательного контроля, в неразведенном виде, на серию тестов.

2

Таблица 1: Разбавление конъюгатного рабочего раствора

Кол-вополосок

Разбавитель /буферныйрабочийраствор

Концентратконъюгата

Конечныйобъем

Кол-вополосок

Разбавитель /буферный

рабочий раствор

Концентратконъюгата

Конечныйобъем

1 1,35 мл + 0,15 мл 1,5 мл 26 35,10 мл + 3,90 мл 39,0 мл

2 2,70 мл + 0,30 мл 3,0 мл 27 36,45 мл + 4,05 мл 40,5 мл

3 4,05 мл + 0,45 мл 4,5 мл 28 37,80 мл + 4,20 мл 42,0 мл

4 5,40 мл + 0,60 мл 6,0 мл 29 39,15 мл + 4,35 мл 43,5 мл

5 6,75 мл + 0,75 мл 7,5 мл 30 40,50 мл + 4,50 мл 45,0 мл

6 8,10 мл + 0,90 мл 9,0 мл 31 41,85 мл + 4,65 мл 46,5 мл

7 9,45 мл + 1,05 мл 10,5 мл 32 43,20 мл + 4,80 мл 48,0 мл

8 10,80 мл + 1,20 мл 12,0 мл 33 44,55 мл + 4,95 мл 49,5 мл

9 12,15 мл + 1,35 мл 13,5 мл 34 45,90 мл + 5,10 мл 51,0 мл

10 13,50 мл + 1,50 мл 15,0 мл 35 47,25 мл + 5,25 мл 52,5 мл

11 14,85 мл + 1,65 мл 16,5 мл 36 48,60 мл + 5,40 мл 54,0 мл

12 16,20 мл + 1,80 мл 18,0 мл 37 49,95 мл + 5,55 мл 55,5 мл

13 17,55 мл + 1,95 мл 19,5 мл 38 51,30 мл + 5,70 мл 57,0 мл

14 18,90 мл + 2,10 мл 21,0 мл 39 52,65 мл + 5,85 мл 58,5 мл

15 20,25 мл + 2,25 мл 22,5 мл 40 54,00 мл + 6,00 мл 60,0 мл

16 21,60 мл + 2,40 мл 24,0 мл 41 55,35 мл + 6,15 мл 61,5 мл

17 22,95 мл + 2,55 мл 25,5 мл 42 56,70 мл + 6,30 мл 63,0 мл

18 24,30 мл + 2,70 мл 27,0 мл 43 58,05 мл + 6,45 мл 64,5 мл

19 25,65 мл + 2,85 мл 28,5 мл 44 59,40 мл + 6,60 мл 66,0 мл

20 27,00 мл + 3,00 мл 30,0 мл 45 60,75 мл + 6,75 мл 67,5 мл

21 28,35 мл + 3,15 мл 31,5 мл 46 62,10 мл + 6,90 мл 69,0 мл

22 29,70 мл + 3,30 мл 33,0 мл 47 63,45 мл + 7,05 мл 70,5 мл

23 31,05 мл + 3,45 мл 34,5 мл 48 64,80 мл + 7,20 мл 72,0 мл

24 32,40 мл + 3,60 мл 36,0 мл 49 66,15 мл + 7,35 мл 73,5 мл

25 33,75 мл + 3,75 мл 37,5 мл 50 67,50 мл + 7,50 мл 75,0 мл

Проведение теста:

1.Ополоснуть инкубационную ванну буфером дляразведения/промывки и удалить раствор.

Маркировать ванну водостойким маркером. Ополаскивание буфером удаляетзагрязнения.

2. Разместить по одной полоске в каждый канал. Разместите по одной полоске для каждого контроля и образца пациента, в

отдельный канал инкубационной ванны пинцетом. Маркировка полосок должнанаходиться лицевой стороной вверх.

3. Добавить в каждый канал по 1.5 мл буфера и инкубировать втечение 5 минут при комнатной температуре на шейкере.

Визуально удостоверьтесь, что полоски полностью смочены и не плаваютчастично на поверхности буфера. Используйте шейкер с частотой колебаний 40циклов/мин.

4.Добавить 20 мкл каждого образца пациента или 100 мклкаждого контроля соответственно.

Наносите при помощи пипетки контроль и образцы непосредственно на ярлыкистрипов, во время колебаний шейкера.

5.Инкубировать на шейкере в течение 30 минут при комнатнойтемпературе.

6. Удалить жидкость Полоски прилипают к дну каналов инкубационной ванны. Тщательно удалите

оставшуюся жидкость на фильтровальную бумагу.

7.Промывка: 3 раза по 5 минут: добавьте 1.5 мл буфера дляразведения/промывки, инкубируйте в течение 5 минут,полностью удалите жидкость.

При промывке приготовьте раствор конъюгата согласно таблице 1. Тщательноудалите оставшуюся жидкость на фильтровальную бумагу.

8.Пипеткой нанести 1.5 мл свежего рабочего раствораконъюгата в каждый канал

Визуально удостоверьтесь, что полоски полностью покрыты растворомконъюгата..

9.Инкубировать в течение 15 минут, на шейкере, при комнатнойтемпературе

10.Удалить жидкость

11.Промывка: 3 раза по 5 минут, как описано в пункте 7. Тщательно удалите оставшуюся жидкость на фильтровальную бумагу.

12.Добавить дистиллированную воду 1.5 мл

13.Инкубировать в течение 1 минуты, на шейкере, прикомнатной температуре

14.Удалить жидкость Тщательно удалите оставшуюся жидкость на фильтровальную бумагу.

15.Добавить 1.5 мл раствора хромоген/субстрата Визуально удостоверьтесь, что полоски полностью покрыты раствором

хромоген/субстрата.

16.Инкубировать на шейкере:ENA IgG: 5 - 15 минут

Остановите реакцию, как только полоса порогового контроля (cut off)станет четко видима. Внимание:Превышение срока инкубации приводит кпоявлению фоновых пятен.полоса контроля для IgG, соотв. IgM в секции контроля.

17.Остановить реакцию, удалить жидкость. Тщательно удалите оставшуюся жидкость на фильтровальную бумагу

18.Промыть три раза с 1.5 мл. дистиллированной воды Не инкубировать.

19. Высушить полоски для интерпретации результатов теста Изъять влажные полоски из каналов, используя пинцет. Разместите влажные

полоски на фильтровальной бумаге и высушите на воздухе перединтерпретацией результатов теста.

3

Принцип тестаПри помощи ENA ViraStripe® могут быть определены ENA-специфические антитела в человеческой сыворотке.Специфические антитела связываются с закрепленным на полоске антигеном в течение инкубации с сывороткой. Конъюгат щелочной фосфатазысвязывается с комплексом антиген-антитело в течение инкубации с конъюгатом. Щелочная фосфатаза конвертирует хромоген/субстрат и окрашиваеткомплекс антиген-антитело на полоске в фиолетовый цвет.. Процедуры промывки между инкубацией с сывороткой, конъюгатом - и хромоген/субстратомудаляют не прореагировавшие реактивы.Иммунодиагностический метод с интегрированной системой контроля:Зеленая разделительная линия делит полоску на секцию контроля и секцию анализа. Секция контроля включает контроль сыворотки и три контроляконъюгата (IgG, IgA, IgM). Секция анализа включает в себя ENA - специфичные антигены.Оценка

Подготовить протокол оценки: Регистрируйте данные в протоколе оценки. Приклейте полоски в протокол илиприкрепите их липкой лентой. Разместите зеленую линию разделения точно нанапечатанную линию разделения в протоколе.

Действительность теста: Тест считается действительным если полосы функционального контроля и полосыконтроля конъюгата и полосы порогового контроля для каждой полоски четкоопределяются.В случае, если нет реакции хотя бы одного из этих контролей, тест считаетсянедействительным и должен быть повторен с соблюдением всех необходимыхусловий, описанных в инструкции.Не оценивайте недействительные полоски.

Оценка образцов пациента Протокол оценки включает в себя отпечатанную полоску положительного контроля(с маркировкой PC EN). Выровняйте разделительные линии полосок пациента иполоски положительного контрольного образца. Положение полосы показано наполосках положительного контроля. Оцените полосы на полосках пациента, иотметьте их в протоколе.Не определенные полосы не должны оцениваться.

Оценка полосы при помощи пороговогоконтроля:

В соответствии с лабораторными качественными методиками, пороговый контрольдолжен использоваться для каждой серии испытаний (11).Полоса пороговогоконтроля интегрирована в контрольной секции каждой диагностическойполоскиИнтенсивность контрольной полосы устанавливает границу оценки полос.Полосу считается реактивной, если ее интенсивность равна или выше чеминтенсивность полосы порогового контроля. Реактивные полосы отмечаютсязнаком X в протоколе.

4

Оценка исследуемых образцов пациентовПолосы нужно рассматривать как симптомы заболевния. Для заключительного клинического диагноза все результаты этого и других испытаний должныбыть коррелированы с историей болезни, эпидемиологическими данными и другими данными, доступными лечащему врачу..Антигены Sm, Sm/RNP, SSA (Ro), SSB (La), Scl-70, Jo-1 характеризуются как специфичные для ENA. Дополнительные нехарактерные полосы могутпоявляться, но они не оцениваются. IgG ENA ViraStripe®:

Идентифицированные полосы / kD Результат Интерпретация

Нет полос Отрицательный Специфических антител против ENA не обнаружено

Одна четкая полоса или болееПоложительный

Обнаружены IgG-антитела к соответствующему антигену.Признак аутоиммунного заболевания, связанного ссоответствующим ENA-антителом.

Клиническая корреляция ENA - антител1. Sm: Обнаруживается примерно у 25-30% пациентов с системной Lupus erythematodes (SLE) (17).2. Sm/RNP: Обнаруживается примерно у 30-40% пациентов с системной Lupus erythematodes (SLE) соотв. у 95% пациентов со смешанным коллагенозом(MCTD) (17). Примечание: Sm-положительные пробы могут дополнительно реагировать с полосой Sm/RNP. Эта полоса включает оставшиеся эпитопыSm, дополнительного к основному антигену RNP.3. SSA (Ro): Обнаруживается примерно у 90-95% пациентов с Sjögren-Syndrom (SS), у 25-60% пациентов с системной Lupus erythematodes (SLE), соотв.у 3-10% пациентов с ревматоидным артритом (РА) (17), у 4% пациентов с PBC, у 1% клинически здоровых пациентов.4. SSB (La): Обнаруживается примерно у 60% пациентов с Sjögren-Syndrom (SS), соотв. у 9-35% пациентов с системной Lupus erythematodes (SLE) (17).5. Scl-70: Обнаруживается примерно у 40% пациентов с прогрессивной системной склеродермией (PSS) (17).6. Jo-1: Обнаруживается примерно у 60% пациентов с полимиозитом (PM), у 13% пациентов с дерматомиозитом (DM), соотв. у 43% пациентов ссовмещенным PM / DM-синдромом (17).Параметры выполненияВсеобъемлющие накопленные данные для аналитической и диагностической чувствительности и специфичности, воспроизводимости анализируемогообразца, могут быть предоставлены по запросу.Предупреждения и предосторожности1. Все компоненты человеческой сыворотки в наших продуктах были протестированы и оказались отрицательными к ВИЧ-антителам и Hepаtitis C-

антителам и Hbs-антигенам. Однако все компоненты человеческого комплекта, а также пробы пациентов, нужно считать потенциальноинфекционными, и соответственно аккуратно обращаться с ними.

2. Не капать из пипетки с использованием рта.3. Носите при работе одноразовые перчатки.4. Не ешьте, не пейте и не курите в рабочей области.5. Конъюгаты содержат азид натрия 0,1%, контрольные группы и разбавителя / буфер для промывки содержат 0,02% тимеросал: Внимание: вреден для

здоровья. Промойте большим количеством воды после контакта с кожей или глазами. Ядовит при глотании! (см. спецификации по безопасности).6. Раствор хромогена/субстрата содержит BCIP и NBT. Избегите контакта с кожей и глазами. В случае контакта с кожей и глазами, промойте большим

количеством воды.7. Образец для тестирования и все потенциально загрязненные материалы должен быть очищен от загрязнений, используя установленные

лабораторные методы, например, обработку в течение 20 минут в автоклаве при 121,5°C. Жидкие отходы могут быть смешаны с гипохлоритомнатрия, до получения конечной концентрации 1%-ого гипохлорита натрия. Выдержать 30 минут для окончательной дезинфекции.

Литература:1. Eng М. Tan „Антиядерные Антитела: ... „; Acad. Press Inc (1989). 2. Berg A. „AutoAk bei chron. Lebererkrankungen: .. „; Klin. Lab. (09/93). 3. Thomas L.,Labor и Diagnose, TH- TH-Books Verlagsges. Frankfurt, 5. Auflage (1998). 4. Ngujen Bao T., Markovits, „ Атлас ANA “, Forlab sa (1991). 5. Bzzi Pierluigi E.,Morris Reichlin „Системный автоиммунитет“, Деккер (1991). 6. Peter „Klinische Immunologie“, Urban и Schwarzenberg (1991). 7. Sönnichsen, E. Apostoloff„Autoimmunkrankheiten“, Gustav Fischer Verlag (1992). 8. Storch, „Immunfluoreszenzfibel“, G Gustav Fischer Verlag Jena (1979). 9. Dhillon B. „Различнаясверхэкспрессия hsp и ... „, Annals of the Rheum. Diseases, 52 (1993). 10. Lee и др „Anticentromere antibodies ... „, Annals of the Rheum. Diseases, 52 (1993). 11.Reimer „Immunolocalization 7-2 Ribonucleoprotein.. “ Acad. Press, Inc (1988). 12. Swaak J. G. .„Antinuclear antib. in routine analysis ...“, Annals of the Rheum.Diseases, 52 (1993). 13. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Rheumatologie 28.09.-01.10.94 14. Mühlen C., E. Tan: „Autoantib ... “, Семинары по артритуи ревматизму, 24 (1995). 15. ARAD-DANN H., Автоантитела ... “, Журнал по иммунологии, издание 138, 8 (1987). 16. Klein, Berg, Лаборатория. Медиана13 p 220-226 (1989). 17. Mühlen C.A., E.M. Tan, Автоантитела при диагнозе системных ревматизмов, Семинары по артриту и ревматизму, Том 24, Номер5, стр. 323-358 (1995). 18. ABEL Die Bewertung diagnostischer Tests; Stuttgart: Hippokrates-Verl., (1993). 19. RILI-BÄK: Bäk-Richtlinie zur Qualitätssicherungquantitativer laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen (1.1.2001)www.bundesaerztekammer.de.