短短芽胞杆菌 FJAT-0809-GLX 胞内物质分离鉴定及 SOD 基因克隆表达

研 究 生：马桂美导 师：刘 波 博士、研究员 关 雄 博士、教 授 车建美 博士、副研究员

福建农林大学、福建省农业科学院2013 年 5 月 30 日

主要内容 研究背景与意义一

技术路线二

研究内容三

结论与展望四

发表论文五

致谢六

一、研究背景与意义1 、短短芽胞杆菌形态学特性

菌落形态 菌体形态 电镜形态

菌体：菌体杆状、革兰氏阳性、产芽孢、周生鞭毛、菌体约为0.8μm-2.2μm；

菌落： NA培养基上，菌落浅黄色、无光泽、不透明、电镜下菌落呈放射状褶皱。

Europe Asia

短短芽胞杆菌 NBRC100599

短短芽胞杆菌 FJAT-0809-GLX

2 、短短芽胞杆菌基因组研究

短短芽胞杆菌 FJAT-0809-GLX ：序列总长 6Mb, 预测得到 5666 个基因 , GC 含量47.30%

短短芽胞杆菌 NBRC100599 ：序列总长 6.3Mb, 预测得到 6121 个基因 , GC 含量47.30%

一、研究背景与意义

一、研究背景与意义3 、部分功能基因研究现状

aldB 基因

已研究的部分基因

xylB 基因

bdb 基因

tycA、 tycB、 t

ycC

Add Your Text细胞壁蛋白合成基因

α- 乙酰乳酸脱羧酶的基因 二硫化物氧化

还原酶基因

木聚糖酶基因短杆菌酪肽合成酶基因

防治白菜灰霉病菌（ S.G. Edwards et.al. ， 2001

） 抑制重金属吸收，促生长（ A.Vivas et.al.， 200

6 ）防治青枯雷尔氏菌（易有金等， 2007 ）防治棉花立枯病、枯萎病（陈莉等， 2008 ）

生物防治 工业生产 环境治理 蛋白表达受体

人类表皮生长因子（ Ukara S.,1976)

植物的 α- 淀粉酶（ Takagi H et.al.,198

9 ） 产气夹膜杆菌的 α- 毒素 （Masahiro

Nagahama et.al.,1996 ）

石油开采（郭万奎等， 2007 ）

降解苯酚（ V.Arutchelvan

et.al.， 2006 ） 降解六氯甲烷（ Archna

Gupta et.al.,2000 ）

一、研究背景与意义4 、短短芽胞杆菌应用

www.themegallery.com

筛选得到短短芽胞杆菌 FJAT-

0809-GLX菌株的鉴定生物学特性研究具有抑菌保鲜功能

一、研究背景与意义5 、本实验室相关的研究现状

FJAT-0809-GLX

羟苯乙酯

邻苯二甲酸单 (2-乙基己基 ) 酯

硫酸链霉素

邻苯二甲酸二丁酯

清水对照

55 、、本实验室相关的研究现状 - 短短芽胞杆菌胞外物质的分析

一、研究背景与意义

一、研究背景与意义6 、胞内物质分析研究现状胞内物质包括脂溶性和大分子物质；脂溶性物质经有机溶剂萃取， GC-MS

进行分析。大分子物质主要为有活性的蛋白类物质，主要采用分子克隆表达方法进行分析研究。

胞内物质包括脂溶性和大分子物质；脂溶性物质经有机溶剂萃取， GC-MS

进行分析。大分子物质主要为有活性的蛋白类物质，主要采用分子克隆表达方法进行分析研究。

克隆克隆 表达表达 发酵生产发酵生产

GC-MS 分析GC-MS 分析 单品单品

超声波细胞破碎

微波细胞破碎

反复冻融

微生物与植物细胞胞内物质提取

方法

6 、胞内物质分析研究现状

有机溶剂萃取

一、研究背景与意义

短短芽胞杆菌胞内物质分析暂无文献可考

一、研究背景与意义6 、胞内物质分析研究现状SOD 普遍存在于动物、植物和微生物中；作用：清除体内多余自由基；优点：无毒、无副作用；用途：作为食品、化妆品、保健品添加剂，医学中也有应用， SOD在植物中的过量表达可提高植株环境耐受力。

SOD 普遍存在于动物、植物和微生物中；作用：清除体内多余自由基；优点：无毒、无副作用；用途：作为食品、化妆品、保健品添加剂，医学中也有应用， SOD在植物中的过量表达可提高植株环境耐受力。

一、研究背景与意义

短短芽胞杆菌胞内物质研究尚未见报道，胞内物质种类丰富，可分离得到活性物质，以此拓宽短短芽胞杆菌 FJAT-0809-GLX应用范围。

短短芽胞杆菌 SOD酶为胞内蛋白，不易获得，采用原核克隆表达技术，将其基因导入大肠杆菌，并在其细胞内进行蛋白表达，为SOD酶大规模生产提供可能，该方法体系的建立为短短芽胞杆菌其他功能基因研究和应用奠定基础。

研究意义研究意义

二、技术路线

条件优化

胞内物质分析

SOD 基因克隆与表达有机溶剂萃取

气质色谱鉴定

获得胞内活性物质

蛋白理化性质分析 蛋白表达条件优化

短短芽胞杆菌 FJA7-0809-GLX

胞内脂溶性物质分析 分子生物学方法研究胞内蛋白

三、研究内容

1

2

3

4

胞内物质提取条件的响应面法优化

胞内物质分离鉴定

SOD 基因的克隆与表达

SOD 原核表达条件优化

处理 均值 5% 显著水平

1:25 0.410 a

1:15 0.353 b

1:20 0.342 b

1:05 0.300 b

1:10 0.250 c

处理 均值 5% 显著水平

100w 0.281 a

700w 0.273 a

300w 0.263 a

500w 0.254 a

900w 0.247 a

超声时间 料液比 超声功率

处理 均值 5%显著水 平

30min 0.377 a

40min 0.292 b

50min 0.291 b

10min 0.276 b

20min 0.281 b

（ 2 ） 超声波细胞破碎单因素条件摸索

三、研究内容1 、胞内物质提取条件的响应面法优化

三、研究内容1 、胞内物质提取条件的响应面法优化

（ 3 ）响应面的试验

二次多项回归方程如下： Y=11.30-1.33A-1.52B-1.86C-4.85A2-3.20B-0.34C-0.89AB+4.05AC+3.29BC

方差分析显示： R2=0.9724,即该模型拟合程度较好，可用于之后响应面的研究。

三、研究内容1 、胞内物质提取条件的响应面法优化（ 3 ）响应面的试验

料液比与超声波功率的交互作用明显。超声时间与料液比的交互作用显著。超声时间与超声波功率的交互作用较

小，可忽略。 料液比与超声波功率等高线与立体分析图

超声时间与超声波功率等高线与立体分析图超声时间与料液比等高线与立体分析图

三、研究内容1 、胞内物质提取条件的响应面法优化（ 3 ）响应面的试验

设置胞内物质提取条件 获得最优胞内物质提取条件

最优条件是：超声功率318.78 w ，超声时间14.64 min ，料液比为0.04 ，得率为 15.7527 。

三、研究内容2 、胞内物质分析

不同提取条件，物质种类和含量都会有所差异，如超声波功率为 100w时，匹配率高于 95% 的仅有 7种，而超声功率为 500 w时，有 20 种。而超声功率500 w ，超声 40 min时获得物质种类最多— 25种，并获得抗氧剂 1076 ，出峰时间为 45.729 ，峰面积达到 13.65 。

三、研究内容3、 SOD 基因的克隆与表达（ 1） SOD 基因 PCR扩增及割胶回收

编号 OD（ ng/μL）

260/280 260/230

1 76.5 1.94 0.18

2 75.2 2.00 0.10

3 74.8 1.94 0.11

以基因组为模版扩增SOD 基因

PCR 产物经割胶回收，去除 PCR 产物中的杂质，用于基因克隆 SOD 基因 PCR扩增

割胶回收

三、研究内容3、 SOD 基因的克隆与表达（ 2 ）阳性克隆子验证

随机挑选 2 株阳性克隆子和 2 株对照，通用引物分别进行菌落 PCR 验证，阳性克隆子获得 750 bp片段，对照菌株获得 650 bp片段，初步判断已成功克隆得到 SOD 基因

阳性克隆子测序结果显示，SOD 基因克隆较完整

在线比对结果显示，相似度为 99% ，仅个别碱基发生了错配

ATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTCGCGGATCCATGGCACATCAACTTCCTGCATTGCCTTATGCACACAACGCTTTGGAACCACATATCGACGCGCAAACCATGGAAATCTATCACGGACGCCACCATGCTACTTATGTTAACAACCTGAATGCAGCTCTGGAAGCACACGCTGACCTGCAAGGTAAAGGCGTTGAAGAGCTGATCAGCAATCTGGATGCTCTGCCTGAGTCCATCCGCACTGCTGTTCGCAACAACGGTGGAGGCCATGCTAACCACACACTGTTCTGGGAAATCATGAGCCCGAATGGCGGCGGTGCACCAACTGGTGAACTGGCTGACGCAATCAACGCGGCTTTCGGAAGCTTTGACAACTTCAAAGCAGAATTCGCAAAAGCAGCTACTACTCGTTTCGGTTCCGGATGGGCTTGGCTGACTGCAGAAGGCGGAAAAGTAGCAATCAGCTCTACGCCTAACCAAGACAGCCCAATCATGGAAGGTAAAACACCTATCCTTGGTCAGGATGTTTGGGAGCATGCATACTACCTGAACTACCAAAACAAACGCCCCGACTACATCGGTGCGTTCTGGAACGTAGTAAACTGGGATGAAGTTAGCAAGCGTTTCGCAGCAGCGAAGTAACTCGAGCGGAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTC

3000 bp--3000 bp--

1000 bp--1000 bp--

500 bp--500 bp--

阳性克隆子阳性克隆子

对照对照

三、研究内容3、 SOD 基因的克隆与表达（ 3 ） SOD 基因在线比对及理化分析

SOD 基因在线比对结果显示，仅第 98 个碱基发生错配

SOD 蛋白序列在线比对相似度100% ，个别碱基的错配不影响蛋白翻译。

SOD由 202 个氨基酸构成，其分子量约为 22 kD

SOD 基因在线比对结果显示，仅第 98 个碱基发生错配

SOD 蛋白序列在线比对相似度100% ，个别碱基的错配不影响蛋白翻译。

SOD由 202 个氨基酸构成，其分子量约为 22 kD

unnamed protein productLength=202 Score = 416 bits (1070), Expect = 6e-154, Method: Compositional matrix adjust. Identities = 202/202 (100%), Positives = 202/202 (100%), Gaps = 0/202 (0%)Query 1 MAHQLPALPYAHNALEPHIDAQTMEIHHGRHHATYVNNLNAALEAHADLQGKSVEELISN 60 MAHQLPALPYAHNALEPHIDAQTMEIHHGRHHATYVNNLNAALEAHADLQGKSVEELISNSbjct 1 MAHQLPALPYAHNALEPHIDAQTMEIHHGRHHATYVNNLNAALEAHADLQGKSVEELISN 60Query 61 LDALPESIRTAVRNNGGGHANHTLFWEIMSPNGGGAPTGELADAINAAFGSFDNFKAEFA 120 LDALPESIRTAVRNNGGGHANHTLFWEIMSPNGGGAPTGELADAINAAFGSFDNFKAEFASbjct 61 LDALPESIRTAVRNNGGGHANHTLFWEIMSPNGGGAPTGELADAINAAFGSFDNFKAEFA 120Query 121 KAATTRFGSGWAWLTAEGGKVAISSTPNQDSPIMEGKTPILGLDVWEHAYYLNYQNKRPD 180 KAATTRFGSGWAWLTAEGGKVAISSTPNQDSPIMEGKTPILGLDVWEHAYYLNYQNKRPDSbjct 121 KAATTRFGSGWAWLTAEGGKVAISSTPNQDSPIMEGKTPILGLDVWEHAYYLNYQNKRPD 180Query 181 YIGAFWNVVNWDEVSKRFAAAK 202 YIGAFWNVVNWDEVSKRFAAAKSbjct 181 YIGAFWNVVNWDEVSKRFAAAK 202

阳性克隆子与原始菌株的 SOD蛋白质一级结构比对阳性克隆子与原始菌株的 SOD蛋白质一级结构比对

MAHQLPALPYAHNALEPHIDAQTMEIHHGRHHATYVNNLNAALEAHADLQGKSVEELISNLDALPESIRTAVRNNGGGHANHTLFWEIMSPNGGGAPTGELADAINAAFGSFDNFKAEFAKAATTRFGSGWAWLTAEGGKVAISSTPNQDSPIMEGKTPILGLDVWEHAYYLNYQNKRPDYIGAFWNVVNWDEVSKRFAAAK

三、研究内容3、 SOD 基因的克隆与表达（ 3 ） SOD 基因在线比对及理化分析

疏水性分析疏水性分析

信号肽预测信号肽预测

二级结构分析二级结构分析

等电点 pI 为 5.71 ，其最大疏水值 1.267 ，最低疏水值 -2.956 ，无信号肽序列。

ScanProsite 分析显示，其为 MnSOD，具有锰离子和铁离子结合区。

二级结构分析显示，该蛋白有两个保守区。

等电点 pI 为 5.71 ，其最大疏水值 1.267 ，最低疏水值 -2.956 ，无信号肽序列。

ScanProsite 分析显示，其为 MnSOD，具有锰离子和铁离子结合区。

二级结构分析显示，该蛋白有两个保守区。

三、研究内容3、 SOD 基因的克隆与表达

（ 4 ） pET/SOD 重组质粒构建和重组载体的获得

双酶切验证双酶切验证

PCR 验证PCR 验证

重组质粒重组质粒阳性转化子阳性转化子 重组质粒重组质粒

经验证后的 SOD 基因重组至 pET-28a质粒上，热激转化至 DH-5α中，获得重组质粒，经 PCR 验证和双酶切验证可知，已成功获得重组质粒

提取重组质粒，热激转化至 BL-21中，获得阳性转化子。

经验证后的 SOD 基因重组至 pET-28a质粒上，热激转化至 DH-5α中，获得重组质粒，经 PCR 验证和双酶切验证可知，已成功获得重组质粒

提取重组质粒，热激转化至 BL-21中，获得阳性转化子。

三、研究内容3、 SOD 基因的克隆与表达

（ 5 ） SOD 蛋白诱导表达

25KD-25KD-

软件预测可知 SOD 蛋白分子质量为 22 kD ，诱导表达后经 SDS-PAGE 电泳也获得约 22 kD的蛋白，即短短芽胞杆菌 FJAT-0809-GLX中的 SOD酶基因在大肠杆菌 BL-21 中顺利表达；

菌体及菌液上清中均含有 SOD 蛋白，即 SOD 蛋白进行了可溶性表达。

软件预测可知 SOD 蛋白分子质量为 22 kD ，诱导表达后经 SDS-PAGE 电泳也获得约 22 kD的蛋白，即短短芽胞杆菌 FJAT-0809-GLX中的 SOD酶基因在大肠杆菌 BL-21 中顺利表达；

菌体及菌液上清中均含有 SOD 蛋白，即 SOD 蛋白进行了可溶性表达。

22 Kd22 Kd

胞内SOD胞内SOD

胞外SOD胞外SOD

对照对照

22kD22kD

0. 000

200. 000

400. 000

600. 000

800. 000

1000. 000

OD0. 2 OD0. 6 OD1. 0 OD1. 4

菌液上清中酶比活 菌体中酶比活

三、研究内容4、 SOD 蛋白表达条件优化

（ 1 ）单因素条件优化

酶比活折线图显示：诱导温度 10 ℃时菌液中酶比活最高； IPTG浓度为0.5 mmol/L时，菌液中酶比活最高；诱导前菌体 OD600 为 0.8时菌液中酶比活最高。

对菌体中酶比活影响较小。

酶比活折线图显示：诱导温度 10 ℃时菌液中酶比活最高； IPTG浓度为0.5 mmol/L时，菌液中酶比活最高；诱导前菌体 OD600 为 0.8时菌液中酶比活最高。

对菌体中酶比活影响较小。

0. 000

100. 000

200. 000

300. 000

400. 000

500. 000

10℃ 20℃ 30℃ 37℃

菌液上清中酶比活 菌体中酶比活

温度的影响温度的影响0

50

100

150

200

250

I PTG 0. 5 I PTG 1. 0 I PTG 1. 5 I PTG 2. 0

菌液上清中酶比活 菌体中酶比活

IPTG影响IPTG影响

诱导前菌体浓度影响诱导前菌体浓度影响0. 000

200. 000

400. 000

600. 000

800. 000

1000. 000

OD0. 2 OD0. 6 OD1. 0 OD1. 4

菌液上清中酶比活 菌体中酶比活

诱导前菌体浓度影响诱导前菌体浓度影响

三、研究内容4、 SOD 蛋白表达条件优化

（ 1 ）单因素条件优化

酶比活折线图显示： Fe 离子浓度为1.5 mmol/L时菌液中酶比活最高；Mn 离子浓度为 1.0 mmol/L时，菌液中酶比活最高；诱导时间为 12 h菌液中酶比活最高。

对菌体中酶比活影响较小。

酶比活折线图显示： Fe 离子浓度为1.5 mmol/L时菌液中酶比活最高；Mn 离子浓度为 1.0 mmol/L时，菌液中酶比活最高；诱导时间为 12 h菌液中酶比活最高。

对菌体中酶比活影响较小。

0. 000

200. 000

400. 000

600. 000

800. 000

1000. 000

Fe0. 5 Fe1. 0 Fe1. 5 Fe2. 0 Fe2. 5 Fe3. 0

菌液上清中酶比活 菌体中酶比活

Fe 离子影响Fe 离子影响0

200400

600800

10001200

14001600

Mn0. 5 Mn1. 0 Mn1. 5 Mn2. 0 Mn2. 5 Mn3. 0

菌液上清中酶比活 菌体中酶比活

Mn 离子影响Mn 离子影响

0. 000

100. 000

200. 000

300. 000

400. 000

500. 000

600. 000

700. 000

6h 12h 18h 24h 30h

菌液上清中酶比活 菌体中酶比活

诱导时间影响诱导时间影响

三、研究内容4、 SOD 蛋白表达条件优化

（ 2 ）最陡爬坡实验

以单因素实验结果为基础，选择各因素实验水平，采用 Mintab软件分析试验数据

Mn离子浓度对其比活影响较显著；诱导时间和诱导前菌体浓度影响显著；诱导温度对比活影响较小；IPTG 浓度对比活影响呈负相关。

以单因素实验结果为基础，选择各因素实验水平，采用 Mintab软件分析试验数据

Mn离子浓度对其比活影响较显著；诱导时间和诱导前菌体浓度影响显著；诱导温度对比活影响较小；IPTG 浓度对比活影响呈负相关。

三、研究内容4、 SOD 蛋白表达条件优化

（ 3 ）响应面优化

二次多项回归方程如下：　　 Y=-4112.07731+3089.23125A+3835.58900B+4448.55700C-1667.73594A2-1580.65100B2-2482.00100C2+1507.88750AB-2525.27500AC+1650.22000BC

各因素对酶比活影响大小如下： IPTG浓度 >Mn离子浓度 > 诱导前菌体浓度

三、研究内容4、 SOD 蛋白表达条件优化

（ 3 ）响应面优化

Mn 离子浓度与 IPTG 浓度交互作用Mn 离子浓度与 IPTG 浓度交互作用

诱导前菌体浓度与 Mn 离子浓度交互作用诱导前菌体浓度与 Mn 离子浓度交互作用

诱导前菌体浓度与 IPTG 浓度交互作用诱导前菌体浓度与 IPTG 浓度交互作用

诱导前菌体浓度与 Mn 离子浓度交互作用不显著，诱导前菌体浓度与 IPTG浓度交互作用显著， Mn 离子浓度与 IPTG浓度交互作用显著。

最优诱导条件：诱导前菌体浓度为0.68，Mn 离子浓度为 1.65， IPTG浓度0.84 ，并且得到理论预测值，其值为3761.68 U/mg 。

诱导前菌体浓度与 Mn 离子浓度交互作用不显著，诱导前菌体浓度与 IPTG浓度交互作用显著， Mn 离子浓度与 IPTG浓度交互作用显著。

最优诱导条件：诱导前菌体浓度为0.68，Mn 离子浓度为 1.65， IPTG浓度0.84 ，并且得到理论预测值，其值为3761.68 U/mg 。

1. 建立了短短芽胞杆菌 FJAT-0809-GLX 细胞破碎方法。采用有机溶剂萃取胞内物质， GC-MS 分析显示，超声功率 500 w 、超声破碎条件为 40 min时，获得物质种类最多，并获得抗氧剂 1076，其为塑料工业中不可或缺的抗氧剂，目前抗氧剂主要采用化学合成，流程复杂、收率低等，短短芽胞杆菌中 FJAT-0809-GLX 中抗氧剂的发现，为其合成提供新途径。

1. 建立了短短芽胞杆菌 FJAT-0809-GLX 细胞破碎方法。采用有机溶剂萃取胞内物质， GC-MS 分析显示，超声功率 500 w 、超声破碎条件为 40 min时，获得物质种类最多，并获得抗氧剂 1076，其为塑料工业中不可或缺的抗氧剂，目前抗氧剂主要采用化学合成，流程复杂、收率低等，短短芽胞杆菌中 FJAT-0809-GLX 中抗氧剂的发现，为其合成提供新途径。

2. 首次克隆获得短短芽胞杆菌 FJAT-0809-GLX 中的 SOD 基因。基因分析显示其为胞内蛋白，不利于蛋白分离纯化及生产应用。实验结果表明，其可在大肠杆菌中进行可溶性表达，菌液上清中即可分离得到 SOD 蛋白，为其大规模生产及广泛应用奠定基础。

2. 首次克隆获得短短芽胞杆菌 FJAT-0809-GLX 中的 SOD 基因。基因分析显示其为胞内蛋白，不利于蛋白分离纯化及生产应用。实验结果表明，其可在大肠杆菌中进行可溶性表达，菌液上清中即可分离得到 SOD 蛋白，为其大规模生产及广泛应用奠定基础。

四、结论与展望

马桂美，车建美，刘波，史怀，陈峥 . 短短芽胞杆菌功能基因的研究及其应用 . 生物技术进展， 2012， 2（ 2）： 92-97.

车建美，马桂美，刘波，郑雪芳，唐建阳 . 青枯雷尔氏菌 Tn5转座子无致病力突变株插入位点的鉴定与分析 .

福建农业学报， 2012， 27（ 11）： 1231-1236.

撰写实验报告 70余篇。

五、发表论文

六、致谢 首先向导师刘波研究员及关雄教授致以崇高的敬意和由衷的感谢！在研究生三年

的学习生涯中，导师们的渊博知识、求实作风、严谨态度和大胆创新，让我受益匪浅。

由衷感谢车建美副研究员在本试验过程中给予的很大帮助。在与车老师讨论过程中，她对试验过程提出了很多建设性的意见，使得论文顺利完成。同时，很感谢唐唯其师兄在本试验过程中给予的帮助。

感谢实验室工作人员朱育菁、蓝江林、阮传清、陈峥、葛慈斌等老师们对试验以及论文写作的指导，他们为论文完成提供了巨大的帮助。感谢林海云、刘国红、陈建力等师兄师姐们的倾囊相授，同时要感谢福建省农业科学院全体同学们的帮助，使得论文顺利完成。

最后，特别感谢我的家人在研究生三年中给予的支持和鼓励。在他们的支持和鼓励下，让我得以顺利走完这三年学习生涯。。