流式细胞术（ Flow Cytometry,FCM)

作者：笛风

1 、流式细胞仪 (Flow Cytometer): 是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。2 、流式细胞术 (Flow Cytometry): 利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达 1000-10000 个）的定量分析和分选（纯度可达 99% 以上）的技术。

基本概念

流式细胞仪结构 • 激光光源及光束形成系统• 流动室及液流驱动系统• 光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源， 收集不同波长的荧光信号。• 信号检测与分析：光电倍增管（ PMT ）、补偿 电路。荧光信号转换为电信号，并将信号放大。• 存储、显示、分析系统：计算机。• 细胞分选系统

流式免疫分型技术要点标本的获取和运输标本的制备和染色仪器的校准和质控流式细胞仪数据获取与储存

FCM 的主要测定指标FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4)其中：

FSC ：反映细胞的大小SSC ：反映细胞内颗粒性

FCM 标记方法单标：一种单抗 /tube: FL1, FSC, SSC （三参数）双标：（两种单抗 /tube ）： FL1, FL1, FSC, SSC （四参数）三 / 四标：（三种单抗 /tube ）（四种单抗 /tube ）：

FL1-FL3/4, FSC, SSC

荧光素种类FITC( 异硫氰酸荧光素）：绿色 530nmPE （藻红蛋白）：橙黄色 575nmPerCP( 多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色675nmPI( 碘化丙啶）：橙红色 620nm 488nm 波长的氩离子激光激发

APC( 别藻兰蛋白）：红色 660nm 630nm 波长的氦氖激光或红色二极管激光激发

PE 最强，适用于弱表达抗原 FITC 最便宜，适用于强表达抗原，适用范围广 biotin-avidin 不适合 弱抗原的检测

抗体的选择

数据显示方式单参数直方图双参数二维点图等高图二维密度图三维图

流式常见图形 (Histogram Plot)

流式细胞的主要信息 :FluorescenceFL1FL2FL3FL4

最常用的标记方法是荧光素分子标记的抗体与细胞抗原结合

流式常见图形 (Histogram Plot)

适用于：单参数分析

流式常见图形 (Dot Plot)

适用于：多参数分析

第二节 流式细胞术的科研应用分析群体细胞所需时间短多参数分析定性或定量

流式应用常见范围细胞大小细胞的颗粒度细胞表面分子： CD 系列细胞浆内分子：胞内细胞因子细胞核内分子： P53细胞功能检测：细胞周期、凋亡

抗体标记的方法

抗体的选择首选直接标记抗体荧光分子 PE 最强，适用于弱表达抗原

FITC 最便宜，适用于强表达抗原间接标记：适用范围广 , biotin-avidin 不适合弱抗原的检测

实验对照的设计空白对照： ALL阴性对照：常用同型抗体对照

单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）阳性对照：检测阴性时

空白对照和阴性对照的比较：

实验标本的处理单细胞悬液的制备：胰酶消化抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应非特异结合的去除：洗涤和封闭

封闭：血清和同型抗体

流式检测应用实例凋亡细胞内分子检测

凋亡检测 - 每一步都有检测试剂盒

细胞周期

G1

MG2

S

Quiescent cells

G0

细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞 Sub-G0/G1 peaks --- PI staining

Caspases

Annexin V Assay 建议用于悬浮细胞

Annexin V Assay 能够区分死亡与凋亡

流式“ TUNEL”

Intracellular Cytokine-Protocol

SORTING （细胞分选）

DIMER X antigen specific T cell assay method for monitoring cellular response

CBA(Cytometric Bead Array)

Traditional Analysis -- Percent positive

a

CD3 FITC

104

103

102

101

100

100 101 102 103 104

Traditional Analysis — Percent Positives

CDX PE

PositiveCell

NegativeCell

Determination of the CD4 PE ABC on lymphocytes

1

10

100

1000

10000

Line

ar F

luor

esce

nce

in F

L2

102

103 104

cell and bead neg

lymph FL2;(49,000 ABC)

Molecules PE per Bead105

第三节 流式细胞术的临床应用白血病免疫分型HLA-B27: 强直性脊柱炎淋巴细胞亚群造血干细胞计数：造血干细胞移植网织红细胞PNH诊断（ CD55 、 CD59）血小板活化试验

流式细胞白血病免疫分型

流式细胞的免疫分型是白血病分型的重要指标

FAB 标准，形态学和免疫表型结合适合于白血病的分型诊断，但不适合用于确诊是不是白血病。Minimal residual diseases (MRD)

FCM 应用1 、细胞增殖周期测定和 DNA 倍体分析2 、凋亡检测3 、免疫功能的检测4 、血液学应用5 、 HLA-B27 的检测：用于诊断强直性脊柱炎。6 、其他：溶液中细胞因子的测量。7 、细胞分选

细胞增殖周期测定和 DNA 倍体分析1 ）细胞增殖周期：分为 G0 、 G1 、 S 、 G2 、 M 期。 S 期是 DNA 合成期，在S 期内， DNA 进行复制，使细胞的 DNA 含量由 2 倍体（ 2C 46 条染色体）变为 4倍体（ 4C ）。 G1 和 G2 期为 DNA 合成前、后间期，此期无 DNA 的合成，但 RNA 和蛋白质进行合成。 M 期为有丝分裂期，在此期一个细胞分裂为 2 个细胞。细胞内的 92 条染色体分裂成 2 组 46 条染色体，使每个细胞内具有 46 条染色体。在 M 期分裂成两个子细胞之前， G2 和 M 期细胞的 DNA 含量均为恒定的 4C。 M 期以后部分细胞进入 G1 期，继续进行增殖，部分细胞进入 G0 期，即静止期，不再继续增殖。因此， FCM 分析一个群体细胞峰 DNA 倍体与细胞周期时，将 DNA 含量直方图分为三部分，即 G0/G1,S,G2/M 期三个细胞峰。G0/G1 和 G2/M 细胞峰 DNA 的含量成正态分布， S 期细胞峰则是一个加宽的正态分布。

2 ）利用 DNA 的荧光染料，如 PI （ Propidium iodide 碘化丙啶），与细胞内的DNA 结合，可反映细胞内 DNA 含量。采用 DNA 直方图显示。具有 2C DNA 含量细胞为 G0/G1 期细胞， 4C DNA 含量细胞为 G2/M 期细胞， DNA 含量介于两者之间的细胞为 S 期细胞。

3 ） DNA 倍体：主要比较 G0/G1 期细胞 DNA含量的变化。用 DNA 指数（ DI ）表示。DNA 指数 = 测量样本 G0/G1 期 DNA 含量 / 正常人淋巴细胞 G0/G1 期 DNA 含量 以正常人淋巴细胞作为对照。正常细胞 DNA 指数为 1.00 ， DNA 指数＞ 1 ，为超 2 倍体，＜ 1 为亚 2 倍体，两者可统称为非整倍体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，实体肿瘤中出现频率较高。

第四节 凋亡检测1 ） FCM-DNA 检测（ DNA 亚 G1 峰的检测）：利用 PI 染色，检测具有亚 G1 期 DNA 含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。其原理为在凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将 DNA 降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的 DNA 片段从细胞内流出，造成总体 DNA 含量减少，成为亚 2 倍体。注：检测的凋亡细胞数代表晚期的凋亡细胞比例，且易受标本中的死细胞和碎片的干扰，影响结果的准确性。可参看文章：http://www.biox.cn/content/cell/20040914791.htmhttp://www.biox.cn/content/cell/20040914792.htm

2 ） DNA 链损伤“ TUNEL” 法 3 ） Annexin-V-FITC/PI 双染法 4 ）线粒体细胞膜电位的检测 5 ）凋亡相关基因的检测——免疫标记法检测基因

第五节 免疫功能的检测（ 1 ）利用多参数流式细胞术，对 PB 中淋巴细胞比例，及淋巴细胞中 T 、 B 、 NK 细胞的比例，及 T 细胞亚群进行检测。如 CD3+ （总 T 细胞）； CD19+ （总 B 细胞）， CD3-/ （ CD16+5 （ NK 细胞）。 3+/CD4+ （ Th/Ti ）：辅助 / 诱导； CD3+/CD4+/CD5RA+ ： naïve 辅助 / 诱导 T 细胞； CD3+/CD4+/CD45R0+ ：记忆性辅助 / 诱导 T 细胞；D3+/CD8+ （ Ts/Tc ）：抑制 / 杀伤； CD3+/CD8/45RA+ ：naïve 抑制 / 杀伤 T 细胞； CD3+/CD8+/CD45R0+ ：记忆性抑制 / 杀伤 T 细胞。胞内细胞因子的检测： CD4+/IL-4+ ，Th1 细胞， CD4+/IFN-γ+ 。（ 2 ）临床应用：原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判断、移植免疫检测等。

第六节 FCM在血液学中的应用1 ）白血病和淋巴瘤的免疫分型，目前对白血病和淋巴瘤的诊断，国际上提出 MIC 分型，即通过形态（ M ）、免疫分型（ I ）、细胞遗传学（ C ）检测，对白血病和淋巴瘤进行综合诊断，免疫分型是重要的检测项目之一。现在多应用多参数的流式细胞术，不同抗体分别被几种荧光素标记：第一荧光（ FL1 ）：FITC （异硫氰酸荧光素， Fluorescein isothiocyanate ）， FL2 ： PE （藻红蛋白， Phycoerythrin ） FL3 ：PerCP （多甲藻黄素叶绿素蛋白， peridinin chlorophyll protein ）， FL4 ： APC （别藻兰蛋白 allophycocyanin, ）

2 ） CD34+ 造血干 / 祖细胞的检测。主要用于干细胞移植及基因治疗方面的检测。3 ）活化血小板及网织血小板的检测，在栓塞性疾病，如脑血管和心肌梗塞的患者，可出现活化的血小板增多。而血小板减少的患者，如果出现网织血小板增多，则说明血小板减少的原因为血小板破坏过多所致。

4 ）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（ PNH ）的发病机制为 X 染色体上的 PIG-A基因发生突变，引起糖化肌醇脂（ GPI ）锚合成障碍，使 GPI 锚连蛋白缺乏，已证实的 GPI 锚连蛋白有 10 余种，用于PNH 诊断的主要为 CD55 和 CD59 两种，如果在红细胞或 WBC 上出现 CD55 或 /和 CD59 的减少，可诊断为 PNH 。

5 ）网织红细胞计数6 ）白细胞分类计数

第七节 其他应用溶液中细胞因子的测量 : 利用吸附有特异性抗体的微球，与溶液中的细胞因子结合，而检测溶液中是否存在该种因子HLA-B27 的检测：用于诊断强直性脊柱炎。

第八节 细胞分选 FCM 可将样本中所需要的细胞亚群从群体细胞中分离出来，即所谓分选 (Sorting) 。被测细胞的任何参数均可作为分选的依据。分选的方式一般有静电分选和捕获管分选，分选方式不同则决定分选的速度，分选纯度一般可达 99%以上。除细胞分选外还可进行染色体分选。 分选的细胞可用于克隆化培养、原位杂交、分子生物学研究等。从孕妇外周血中分离富集胎儿有核红细胞用于产前诊断，染色体分选可用于基因诊断。

淋巴 20-25%: T: 70%, B: 20%, NK:10%;

单核 2-6%+粒细胞 :40-60%有核红 :20-25%

正常 BM 各系细胞比率

是白细胞（包括血小板、血管内皮细胞等）在正常分化成熟的不同阶段以及活化过程中在这些不同谱系（ lineage ）细胞胞浆或细胞膜表面出现或消失的标记，参与机体重要的生理和病理过程。八十年代在WHO 和国际免疫学联合会 (IUIS)组织下，将识别同一分化抗原的来自不同实验室的单克隆抗体归为一个分化群CD: cluster of differentiation/ cluster designation

白细胞分化抗原

1. 系列交叉 (cross-lineage):

AML 表达 CD2,CD19

2. 表达不同步 (asynchronous):

早期与晚期抗原同时表达3. 表达量异常 (over- or under-expression):

4. 与细胞大小不匹配 (abnormal light scatter profile):如大 CD2+ 细胞或小 CD13+ 细胞

AL 免疫表型特点 : 紊乱表型

鉴别淋髓系列 区分亚型 双表型、杂合型 Mo 、 M7 、 AUL 提示细胞遗传学异常 部分与预后相关 MDR监测

AL 免疫表型检测意义

Gating

FCM 设门法FSC/SSC: 不能将淋巴、单核及幼稚细胞区分开CD45/SSC:CD45 是 WBC 抗原 ,RBC.PLT为阴性。 CD45 在成熟细胞表达强，幼稚细胞表达弱。在淋巴，单核及粒细胞表达强度不同。 优点：能将淋巴单核及幼稚细胞区分开，特异分析白血病细胞免疫表型。

正常血细胞分化发育过程中免疫标志变化特点以及白血病细胞免疫标志特点常用各系血细胞 CD 抗原1 、 T 系： CD1-CD8 （ CD6 不用）2 、 B 系： CD10, CD19-CD24, FMC73 、髓系： CD11b,CD13-CD16,CD33,CD644 、干祖： CD34, CD117, CD38, HLA-DR

正常 B 细胞标志CD19 CD22 TdT Cd34 CD10 CD20 FMC7 CD23 DRI 期 + + + + + +

II 期 + + - - + -/+ +III 期 + + - - - + +IV 期 + + - - - + + + + 泛 B 标志： CD19,HLA-DR,cCD79a/CD22幼稚 B 标志： CD34,TdT,CD10成熟 B 标志： CD23,FMC7

B-ALL 的分型亚型 CD1

9CD34 TdT CD1

0Cylg SmIg

急性早期 B 前体细胞白血病Early B-precursor ALL

+ + + + - -

急性前 B 细胞白血病Pre B-ALL

+ -/+ + + + -急性 B 细胞白血病B-ALL

+ - - - -/+ +

正常 T 细胞标志：根据在胸腺内发育阶段分类CD7 CD2 CD5 CD34 CD1a CD3c/m CD4 CD8I 期 + + + + +/-

II 期 + + + - + +/-III期 + + + - + +/+ + +IV期 + + + - - +/+ +/- +/-泛 T:CD2,CD5,CD7,cCD3幼稚 T:CD34,TdT,CD1a,CD4/8成熟 T:CD3,CD4,CD8

T-ALL 的分类分型 CD7 CD2 TdT CD3c/m急性早期 T 前体细胞白血病Early T precursor ALL

+ - + +/-急性 T 细胞白血病T-ALL

+ + - +/+T-ALL 特点：1 ，幼稚 T 细胞数量增多： CD34+,TdT+↑2 ，泛 T 标志丢失3 ， CD4/8 双阳或 CD4/8 单阳

正常单核细胞标志

全单核细胞标志： CD33,CD13,HLA-DR幼稚单核细胞标志： CD34,CD117成熟单核细胞标志： CD14,CD64

HLA-DR

CD33 CD13 CD34 CD117

CD14 CD64

幼稚单 + + + + + - -成熟单 + + + - - + +

正常粒细胞标志cMPO CD1

3CD34

CD117

HLA-DR

CD33

CD11b

CD15

CD64

CD10

幼稚粒 + + + + + + + - - - -成熟粒 + + - - - + + + + +

全粒细胞标志： CD13,CD33,Cmpo幼稚粒细胞标志： CD34,CD117,HLA-DR成熟粒细胞标志： CD15,CD11b,CD10,CD64

成熟粒、单核细胞主要区别成熟粒细胞：CD33+ HLA-DR- CD14- CD64+dim成熟单核细胞：CD33++ HLA-DR+ CD14+ CD64++

干祖细胞标志 T 祖细胞 B 祖细胞 髓祖细胞CD34 + + +TdT + + -CD117 -/+ - +HLA-DR +/- + +CD38 + +/- +

诊断白血病主要标志：B-ALL: CD34, HLA-DR, CD19, CD10+/-, cCD79aT-ALL: CD34, CD38, CD7, CD2+/-, CD5+/-, cCD3AML: CD34, CD117, CD33, CD13, cMPO

M3: CD34-, HLA-DR-M2: CD19+: t(8, 21)M4/M5: CD14+M6: GlyA+, CD71+M7: IIb/IIIa(CD41, CD61)+

双表型急性白血病诊断的积分系统(EGIL,1998)分值 B 系 T 系 髓系2 CD79a CD3 MPO ** cCD22 anti-TCRα/β cIgM anti-TCRγ/δ1 CD19 CD2 CD117 CD20 CD5 CD13 CD10 CD8 CD33 CD10 CD650.5 TdT TdT CD14 CD24 CD7 CD15 CD1a CD64

Diagnosis CD5

CD10

CD19

CD20

CD23 CD79b

FCM-7 CD25 CD11c CD103

SLL/CLL + - + + + - - -/+ +/- -Mantal cell lymphoma + - + + - + + - - -Follicle center lym - + + + -/+ +/- +/- - - -Marginal zone lym - - + + - +/- +/- -/+ + -HCL - - + + - +/- +/- +/- + +

Common phenotyes of B-cell lymphoproliferative disorders