姓名：王连连

导师：梁建生

报 告 内 容

实验计划

研究意义

初步结果

研究方法

研究内容

一、研究意义 异三聚体 GTP结合蛋白 (heterotrimeric GTP-binding proteins, G蛋白 ) ，是活细胞内一类具有重要生理调节功能的蛋白质。 G 蛋白在动物和简单真核生物细胞中的功能研究较早，已积累了非常丰富的资料，植物 G 蛋白的研究起步较晚，虽然近年来也取得了不少进展，但不够深入。（图 1 ）

目前对于拟南芥 G 蛋白的结构以及α亚基的功能研究比较全面。有研究表明，拟南芥 G 蛋白在跨膜信号转导途径中与多种偶联信号和效应分子发生作用，但具体的作用方式，作用部位和作用机理还不是很清楚 。

图 1 G 蛋白介导的信号转导模式图 （ Temple 和 Jones,2007,Annu Rev Plant Biol

58:249-266 ）

活性激酶 C 的受体（ Receptor for Activated

C Kin － ase1， RACK1）是一种色氨酸 - 天冬氨酸结构域（ WD40）重复蛋白，在哺乳动物中， RACK1是一种多功能的支架蛋白，能与不少信号分子相互作用。（图 2 ）

研究结果表明， RACK1可能与植物细胞分裂及生长发育相关。比较拟南芥 G 蛋白 β亚基和 RACK1A缺失突变体agb1-2、 rack1a与野生型 Col对干旱胁迫响应的差异，发现 rack1a有很强的抗旱性。

图 2

拟南芥是一种重要的模式植物，对拟南芥 G 蛋白的结构与功能的研究将有助于了解和推测其他植物中 G 蛋白的功能，以及发现在植物的生长、发育和分化过程中与G 蛋白有相互作用的一些重要的信号分子和效应器，从而达到对植物生长进行调控的目的。

本实验室通过研究表明，拟南芥 G 蛋白在跨膜信号转导途径中与多种偶联信号和效应分子发生作用，但具体的作用方式，作用部位和作用机理还不是很清楚，因此对 G 蛋白 β亚基的功能作进一步研究具有重要的科学意义和实践意义。

从蛋白质水平研究 RACK1与其它信号蛋白相互作用的结构域及位点，鉴定拟南 RACK1蛋白和 G 蛋白 β亚基的相互作用具有重要的意义。

二、研究内容

制备纯化的带有 GST的拟南芥 G 蛋白 β

亚基和带 HIS-TAG 的 RACK1蛋白 利用制得的纯化蛋白研究其相互作用

三、实验方法

采用 pull-down融合蛋白技术。其基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上 ( 如Sepharose),当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收。然后采用SDS-PAGE电泳检测是否存在相互作用。

回收纯化目的条带 回收纯化目的条带

TA 克隆 TA 克隆

筛 选 筛 选

MarkerMarker

20002000

10001000750750

500500250250

pMD18-TpMD18-T

PCR

100100

阳性克隆－ PCR 鉴定 阳性克隆－ PCR 鉴定

送样测序 送样测序

1 2 3 4 51 2 3 4 5MarkerMarker

20002000

10001000750750500500

250250

100100

A T C G ……A T C G ……

GENEBANK 比对 GENEBANK 比对 功能解释（验证） 功能解释（验证）

PMD18-T /PCR 产物 表达载体

双酶切

连接

转化宿主菌

鉴定、诱导、提纯

四、 初步结果 G 蛋白 β 亚基由 AGB1基因编码，其全长编码区为 241 － 1372 ，共 1134bp241atgtctgtct ccgagctcaaagaacgccac gccgtcgcta cggagaccgt taataacctc cgtgaccagc

ttagacagag acgcctccag ctcctcgataccgatgtggcgaggtattca gcggcgcaag gacgtactcg ggtgagcttc ggagcaacgg atctggtttg ttgtcgtact cttcagggacacaccggaaa ggtttattca ttagattgga caccggagag gaaccggatt gtcagtgcat ctcaagatgg gagattaatc gtgtggaatg ctctaacgag tcagaaaact catgctatta aactcccttg tgcatgggtt atgacatgtg ctttctctcc aaatggtcag tcggttgcgt gtggtggatt agacagtgta tgttctatct ttagccttag ctcaacggcg gacaaggatg gaactgtacc ggtttcaaga atgctcactg gtcacagggg atatgtttcg tgctgtcagt atgtcccaaa tgaggatgcc caccttatca ccagttcagg tgatcaaact tgtatcttat gggatgtaac tactggtctc aaaacttctg tttttggcgg tgaatttcag tctggacata ctgctgatgt actaagcgtc tcaatcagtg gatcaaaccc aaactggttt atatctggtt catgcgattc cacagcacgg ttgtgggaca ctcgtgctgc aagccgagca gtgcgtacct ttcatggtca cgagggagat gttaatacgg tcaagttctt tccggatggg tatagatttg ggactggatc agacgatgga acatgcaggc tgtatgacat aaggactggt caccaactcc aggtctatca gccacatggt gatggtgaga acggacctgt cacctccatt gcattctctg tgtcagggag acttcttttc gctggctatg cgagcaacaa cacttgctac gtttgggata ccctcttggg agaggttgta ttggatttgg gattacagca ggattcacac aggaatagaa taagctgttt ggggttgtca gcagatggaa gtgccttgtg tacaggaagt tgggattcaa atctaaagat atgggcgttt ggaggacaca ggagagtgat ttga1372

RACK1 蛋白由 RACK1基因编码，全长 984bp

1 atggcggaag  gactcgtttt  gaagggcacc  atgcgtgaca  acactgacat 51  ggtgacggca aaccatcgcc caatcgataa  cgcagacatc  atcgtctcag101 cttcccgcga caaatccatc   attttgtgga  aactcaccaa  ggacgaccaa151 gcctacggtg tagctcagag  gcgtctcact  ggtcactctc    acttcgttga201 ggatgttgtt ctctcctccg  atggacaatt   cgcgctttcc  ggcagctggg251 acggcgagct  ccgtctttgg  gatcttgctg  ctggtgtctc cactcgtaga301 ttcgttggac  acaccaagga  cgtgctctcc  gtcgccttct  cactcgacaa351 ccgtcagatc  gtctctgcat  ctcgtgaccg  tacgatcaag  ctgtggaaca401 ctcttggtga  gtgcaagtac  accatttcag  aaggtggtga  gggacaccgt 451 gattgggtta  gctgcgtcag  attcagccct  aacacgcttc  agccgacgat501 tgtatctgct  cgtgggaca  agaccgtgaa  agtgtggaac  ctttcgaact551 gcaagctcag  atcgactctt  gctggtcaca  ccggttacgt  gagcactgtg601 gctgtatcac  ctgatggttc  tctttgtgca  agtggaggca  aagacggtgt651 tgttttgctg  tgggatttgg  ctgaggggaa  gaagctttac  tctcttgaag701 ctaactctgt  gatccatgct  ctttgcttca  gtcccaacag  gtactggctc751 tgtgctgcaa  ctgaacatgg  tattaagatt  tgggaccttg  agagcaagag 801 cattgttgag  gatttgaagg  ttgatctcaa  ggctgaggct  gaaaaggctg851 acaacagtgg  tcctgctgcc  accaagagga  aggttattta  ctgcacaagc901 cttaactgga  gcgctgatgg  aagcaccctc  ttcagtggtt  acaccgatgg951 agtcattaga  gtttggggta  ttggtcgttactag

Sense : 5’ GCGGATCC ATGTCTGTCTCCGAGCTCAAA3’AGB1 Primer

Anti-Sense:5’ GCGAATTCTCAAATCACTCTCCTGTGTCCT 3’

引物序列

RACK1PrimerSense: 5’ CCGAATTCATGGCGGAAGGACTCGTT3’

Anti-Sense:5’ CCGTCGACGTAACGACCAATACCC 3’

四、初步结果PCR 扩增目的基因，琼脂糖电泳结果

AGB1 RACK1

2000bp1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp

M 1 2 3 4 5 6 M 1

2000bp

1000bp750bp500bp

250bp

100bp

AtRACK1AGB1

五、实验计划 （ 1 ）进行 T-A 克隆，将目的基因克隆到 pMT18-T vector

中， 双酶切，回收目的基因 （ 2 ）将表达载体双酶切，回收线性载体 （ 3 ）将酶切的目的基因和载体进行连接 （ 4 ）转化宿主菌 （ 5 ）诱导蛋白表达 （ 6 ）分别过镍柱和谷胱甘肽亲和柱，纯化目的蛋白 （ 7 ）将纯化的目的蛋白结合 （ 8 ） SDS-PAGE 电泳检测其结果