:מגישים300934288אופיר עמר

300374378יערה משה

10/10/2012

הפקת חלבוןGST

מחייד קי

E.coliבביוראקטו

ר

מבוא

כיום, ישנם מס' רב של חלבונים המשמשים כתרופות לצד המולקולות הכימיות. מתן חלבונים תרופתיים נעשה כאשר הגוף אינו מייצר כלל או במידה לא מספקת הורמונים או אנזימים

חיוניים.

בכדי ליצור תרופות ביולוגיות אלה, נדרשת הפקת חלבונים בכמות גדולה ורמת ניקיון גבוהה. . תהליך זה בנוי ממס'downstream , ותהלכי ההפרדה נקראים upstreamתהליכי היצור נקראים

שלבים: השלב הראשון הוא מציאת מקור בו מיוצר החלבון. לאחר מכן בידוד הרצף הגנטי המקודד

לחלבון זה )ע"י שימוש באנזימי חיתוך ושיטות לניקוי חלבונים עליהם נפרט בהמשך( והחדרתו מעגלי בתאDNAלתא מארח. בדרך כלל הנשא של הגן יהיה פלסמיד )פלסמיד הינו מקטע

החיידק בעל יכולת לחדור לחיידק באופן עצמאי ולהתרבות בלי תלות בכרומוזום החיידק).יוצרים פלסמיד רקומביננטי ע"י חיתוך עם אותו אנזים חיתוך, ולאחר מכן מאחים את הרצף הגנטי

לפלסמיד ע"י ליגאז. את הפלסמיד הרקומביננטי מחדירים לתא המארח )חיידק( ומגדלים את המהונדס. נהוג להחדיר בנוסף גן בורר אשר מקודדDNAהחיידק לקבלת כמות גדולה של ה

לתכונה המאפשרת הפרדה בין התאים המהונדסים לתאים שלא הונדסו. הגן הבורר בדר"כ מקנה לתאים תכונה שמאפשרת לו לשרוד בתנאים מסוימים למשל אנטיביוטיקה. הביטוי של

החלבון הרצוי יכול להתבצע באופן רציף או להיות מבוקר ע"י חוסר/ עודף של מולקולות מסויימות במצע הגידול. כך ניתן לבקר ביטוי חלבונים ע"י האופרון, אופרון הינו צבר גנים בעלי ייעוד משותף, נועד לאפשר שעתוק של אותה קבוצת גנים כתגובה לאות תוך תאי או חוץ תאי

וזאת על מנת למנוע תעתוק מיותר של הגנים הללו שלא בעת הצורך. למשל אופרון הלקטוז נועד לאפשר קליטת ופירוק לקטוז לצורכי אנרגיה. החיידק יפרק לקטוז כאשר אין מקורות אנרגיה

אחרים במצע הגידול. רצף הגנים המקודדים לחלבונים המפרקים לקטוז באופרון הלקטוז, βמתורגמים רק כאשר יש רמת לקטוז גבוהה והעדר גלוקוז. בתא נוצרת מהלקטוז נגזרת כימית

- galactosideמולקולה זו נקשרת לדכאן, וגורמת לשינוי המבנה המרחבי שלו, כך שאחיזתו של הדכאן נחלשת ומתאפשר תעתוק הגנים של מודל האופרון ויתורגמו חלבונים הפעילים בקליטה

ופירוק של הלקטוז. לאחר התרבות החיידקים המהונדסים לכמות מספקת, יש להעביר את התרבית לביוראקטור

)עליו נפרט בהמשך( לייצור תעשייתי של החלבונים. יש לציין כי גידול החיידקים הרצויים בתנאים אופטימליים יגדיל את רמת ביטוי החלבונים

בחיידקים בנוסף לגידול מהיר יותר של החיידקים.

תחילה נפרט על כמה שיטות וחומרים בהם נעזרנו במהלך הניסוישיטה זו הינה מעין קולונת זיקה עבור החלבון1 הפרדת החלבון בעזרת חרוזי ספרוז -

GST-המכילה חלקיקי שרף- ספרוז, אשר קשורים קוולנטי ל ,GSH. GSHגלוטטיון( עם חרוזי הספרוזGSTבחיבור . GSTבצורה המחוזרת( הינו הסובסטרט של החלבון

נוצר קומפלקס שלאחר סירכוז יהווה משקע המכיל את החלבון הרצוי. GSHו – חופשי לתמיסת תוך כדי שינויGSHלאחר מכן את החלבון ניתן לשחרר ע"י הוספת

באפיניות גבוהה יותר. GST, אשר אליו יתחבר החלבון pH (8)ההינה שיטה לקביעת ריכוז החלבון. בשיטה זו נעשה שימוש בראגנט2 ברדפורד -

אשר צובע את החלבון. צבע זהCoomasie Brilliant Blueהמכיל את החומר ובהיקשרו לחלבון )חום-אדמדם( 465nmבעל בליעה מקסימלית באורך גל

)כחול(. כך שכמות הבליעה באורך גל זה ביחס ישיר לכמות595nmבולע באורך גל החלבון. שיטה זו מאפשרת קביעת ריכוזי חלבון נמוכים. שיטה זו איננה ספציפית

לחלבון מסויים, ואף בעלת רגישות גבוהה למגיבים חנקניים.הינה שיטה להפרדת מולקולות לפי מטענם החשמלי )במקרה- 3 אלקטרופורזה בג'ל

שלנו חלבונים(, בה תמיסת דוגמא מורצת במצע ג'ל המחובר לאלקטרודות כך

שנוצר בו שדה חשמלי הגורם לחלבונים השונים בתמיסה לרוץ בקצב שונה בהתאם למטענם. מהירות תנועת החלבונים בג'ל מושפעת מבנה המרחבי שלהם, חלבונים

גדולים יותר נעים באטיות ולמרחק קצר ואילו חלבונים קטנים נעים במהירותולמרחק גדול יותר. נהוג להריץ גם סמן גודל אשר ישמש לזיהוי מיקום החלבונים.

Sodium Dodecyl Sulfate - הוספת ריכוז גבוה של SDS אלקטרופורזה בנוכחות SDS מאפשרת הפרדת חלבונים באלקטרופוריזה על בסיס משקלם

חומצות אמינו כך נוצר מטען2אחת נקשרת )בקירוב( לכל  SDSמולקולת  המולקולרי. המקורי של החלבונים חסר משמעות(. חשמלי שלילי חזק )כך שהמטען החשמלי

יהיה ביחס לגודלSDSבמילים אחרות, המטען החשמלי הכולל של החלבון בנוכחות גורם למבנה המרחבי של החלבונים השונים, להיות דומה.SDSהחלבון. יש לציין כי

בתנאיםאו לביצוע תהליכים ביוכימיים מיכל לגידול מיקרואורגניזמים - 4 ביוראקטור סטריליים, המשמש ליצור תעשייתי. נפח ביוראקטור תעשייתי נע בין מאות ליטרים

לעשרות אלפי ליטרים ואילו ביוראקטורים מעבדתיים הם קטנים יותר, עד כמה מאות ליטרים. את הביוראקטור מזינים מתרבית מוצא שגודלה לפני, לאחר עיקורו. הביוראקטור מווסת ע"י פרמטרים רבים כדי להשרות בו את התנאים האופטימלים

, איוורור המצע, מסיסות החמצןpHלגידול החיידקים: סטריליזציה, טמפרטורה, רמת

O.D.ערבול, שבירת קצף, הוספת מרכיבי המצע, פתח הוצאת דגימות ,

פלסמיד pGEX5 - : מכילori, MCS -multiple cloning siteגן ל-, עמידות לאמפיצלין ,

GST, lac operon , Ptac (. חזק מאודאינדוסיבילי )פרומוטור פלסמיד זה נבחר כיוון שקל לשלוט על תחילת תהליך הייצור של החלבון ועל קצב

שמונע את ייצור החלבוןlac operonייצור קבוע של החלבון מאחר וקיים בפלסמיד זה IPTG אשר נקשר לאופרטור העיכוב נמנע.IPTGבנוכחות גלוקוז ובהוספת האופרטור

נבחר כיוון שייצור בקנהE.coliאינו מתפרק ע"י החיידק וכך נשמר קצב ייצור קבוע. מידה גדול שלו הוא זול, קל יחסית להחדיר פלסמידים זרים אל תוך התא, התנאים

ומצעי הגידול האופטימליים שלו ידועים ואימות נוכחות החלבון קל.IPTGאנלוג ללקטוז משמש כמשרן. הוא איננו מפורק ולכן מקבלים אינדוקציה –

מתמשכת.

6 חלבוני Glutathione S -transferase )GST ( המצויים בעיקר הם חלבונים בנטרול רעלים מהגוף. הוא מנטרל שייריםבציטוזול. לחלבון זה תפקיד

אחד . GSHאלקטרופילים של רעלים ע"י צימודם לגלוטטיון מחוזר- . כך שנוכל לבדוק את הפעילותCDNBמהסובסטרטים של חלבון זה הוא

, ובדיקת ריכוז התוצר:CDNBהאנזימתית ע"י הוספת

GSH + CDNB GST GS-DNB + HCl

GS-DNB340 בעל בליעה מקסימלית באורך גלnm.

Homogenizer 7 – הומוגנייזר הינו מכשיר בשימוש במעבדות ובעזרתו ניתן להוציא את תכולת התאים שגידלנו אל התמיסה ולאחר מכן לבצע עליה אנליזה לקביעת

הכמויות. פיצוץ התאים מתבצע על ידי הפרשי לחצים שנובע מכך שבוכנה הדוחסת את

( בתרחיף וכתוצאה מכךpsi 15000תרחיף החיידקים מייצרת לחץ גבוה מאוד )כ- הלחץ בתאים עולה גם, התרחיף שיכול לצאת דרך צינור קטן מאוד וללא לחץ עובר

ירידת לחץ חדה, בתאים הלחץ לא יורד מהר ולכן יש הפרש לחצים גדול מאוד )לחץ עצום בתוך התא ולחץ נמוך מחוצה לו( שגורם לפיצוץ התאים וליציאת תוכן התא

לתרחיף.נעשה מספר חזרות על התהליך על מנת לוודא כי כל התאים עברו פיצוץ.

לאחר מכן נעביר את התרחיף סירכוז במהירויות שונות על מנת לשקע את תכולת

התא הלא רצויה ובכך נעשה בידוד ראשוני מאוד של המרכיב שייצרנו בתא )חלבון,פלסמיד או תוצרים שניוניים(.

תהליך זה הינו זול מאוד )חוץ מהמכשיר היקר אך זו רכישה חד פעמית(, מהיר וניתןלעבוד עם כמויות גדולות בכל פעם, מאפיין חשוב מאוד בייצור תעשייתי.

PBS – Phosphate buffered saline הינה תמיסת בופר שמורכבת מסודיום כלוריד - (, התמיסה בד"כ איזוטונית7 קבוע בתחום הביולוגי )pHוממלח פוספט ושומרת על

ומונעת לחצים שנובעים מהפרשי ריכוזים של מלחים שונים בתא ומחוצה לו. כך למנוע מהתא להכנס למצב עקה במידה ונרצה להשתמש בו או אם לא נרצה את

שישמורpHהתא יותר נוכל לשמור על החלבונים והפלסמידים שייצרנו בתחום עליהם מפגיעת חומצות.

מהלך הניסוי:

בתנאי מעבדה: GSTהפקה של חלבון ה-.1

( לאחר בחירת פלסמיד הביטויpGEX( והתא המארח )E.coliנסדקו תנאי הגידול ) האופטימלים לייצור מקסימלי של החלבונים.

חמש תרביות חיידקים גודלו בתנאים שונים בכדי למצוא את התנאים האופטימליים לגידול החיידקים וייצור החלבון. לאחר בדיקת בליעה נמצא כי

,pH 7 מעלות צלזיוס, 37התנאים האופטימליים לגידול החיידקים הינם בטמפ' . לאחר פיצוץ התאים ע"י ליזיס, חמשת הדוגמאות הורצו בג'לterrificמצע גידול

בכדי לבדוק נוכחות ורמת ביטוי החלבון, נמצא כי בדוגמא בה התנאים הם )ניתן קיים את ביטוי החלבון הגדול ביותר. IPTGהאופטימליים הנ"ל אך עם נוכחות

בנספח(.1לראות סעיף

לפניIPTG נעשתה בשלב הלוגריתמי של הגידול הוספת IPTGנציין כי הוספת השלב הלוגריתמי תגרום לייצור החלבון בשלב מוקדם יותר ובכך תעכב את IPTGגידול החיידקים. בנוסף אנו רוצים ייצור מסה גדולה של החלבון לכן הוספת

לא תהיה בשלב מאוחר יותר בו מתחילה תמותת החיידקים )השלב הסטציונרי(.

בביוראקטור:GSTהפקה של חלבון ה-.2

הוכן תרחיף מחיידקיE.coliמהתרבית שהונדסה, בארלנמאייר ובתוספת מצע, טרי.

הביוריאקטור נקבע על תנאים קבועים שנמצאו אופטימליים. תרבית החיידקים Setמהארלנמאייר הועברה לתוך הביוריאקטור ברגע שהתנאים שקבענו הגיעו ל-

Pointוזאת על מנת שההעברה מהארלנמאייר לביוראיקטור לא תגרום לשלב ,

Lagארוך. בזמן הגידול נמדדה בליעה כל חצי שעה בכדי למצוא את השלב היה צפוי להוספה אך בפועל הוספנוIPTG( A(o.d600)=0.8-1המתאים להוספת

בבליעה כמעט כפולה וזאת כיוון שהתחלנו עם בליעה גדולה יחסית ורצינו לתת לחיידקים מספיק זמן להתרבות( וגם לאחר מכן נמדדה בליעה בכדי לבנות

בנספח(.3)ניתן לראות סעיף עקומת גידול עבור ייצור החלבון.

לאחר הגידול החל שלב הקציר ובו העברנו את התרחיף למבחנות והשקענו את .PBSהחיידקים בצנטריפוגה. הנוזל העליון הורחק והמשקע הורחף מחדש ב-

התרחיף החדש הועבר בגאזה בסינון גס ולאחר מכן בהומוגנייזר ובו התאים מתפוצצים ע"י הפרשי לחצים. התאים המפוצצים שוקעו שוב והנוזל העליון נלקח

נמצא בנוזל העליון של התאים המפוצצים ששוקעו(. עלGSTלמבחנה )החלבון מ"ל מהביוריאקטור25מנת למדוד את המשקל הרטוב והיבש נלקחה דוגמא של

הועברה לאפנדורף ואז שוקעהPBSעם תרחיף החיידקים שוקעה והורחפה שוב ב שוב, הנוזל העליון הורחק ונשקל האפנדורף )זהו המשקל הרטוב(, האפנדורף הועבר לתנור ונשקל לאחר יומיים של ייבוש, תוצאות השקילות כתובות בפרק

התוצאות.

ניקוי החלבון:.3לאחר פיצוץ התאים בהומוגנייזר )מיצוי חיידקים(, התרחיף הושקע עם חרוזי

המהווה סובסטרטGSHספרוז. חרוזי הספרוז מכילים שייר של גלוטטיון מחוזר- -un, כך שנוצר ביניהם קומפלקס שיוצר משקע. הנוזל העליון הוצא ))GSTעבור

bound והמשקע הורחף שוב עם ,pbs פעמים כדי3. פעולה זו נעשתה עוד לשטוף את המשקע עם החרוזים )שטיפה(. לאחר השטיפה הורחף המשקע עם

חופשי. התרחיף סורכז שוב והועבר הנוזלGSH המכיל pH=8בופר אילוציה למבחנה חדשה שנקראה – אילוציה.

:בדיקת נוכחות חלבון בשלבים שונים של הניקוינלקחה דוגמא לאחר הומוגנייזר וסרכוז מיצוי חיידקים -Un-bound - נלקחה דוגמא מהנוזל העליון לאחר שיקוע מיצוי החיידקים

ביחד עם חרוזי ספרוז.לאחר הרחפת המשקע שנוצר עם חרוזי הספרוז וסרכוז מחדש. שטיפה -

נלקחה דוגמא משתי השטיפות הראשונות.הנוזל העליון לאחר סירכוז המיצוי עם בופר האילוציה. אילוציה -

ריכוזים ידועים שונים של של תמיסת חלבון 6הוכנו BSAבכדי לקבוע את כמות הדוגמאות, בשיטת ברדפורד.4החלבון הכללי בכל אחת מ-

-595 הריכוזים ביחד ריאגנט ברדפורד באורך גל 6נמדדה בליעה לכל אחד מnm בנספח(.6)ניתן לראות סעיף )עבודה דופליקטים(. ולאחר מכן נבנה גרף כיול

-הדוגמאות הוסף ראגנט ברדפורד והתמיסה נמהלה בהתאם לטווח4ל בנספח(.7)ניתן לראות סעיף הבליעות בגרף הכיול .

.הריכוזים נקבעו לפי גרף הכיול ובהתאם לפקטורי המיהול 280nm , באורך גל UVבנוסף נקבע ריכוז החלבון הכללי, בספקטרופוטומטר

בנספח(.8)ניתן לראות סעיף לבקרה.

–BSA מיהולים שונים של חלבון 3 הדוגמאות ו4הרצת .4

4 0.5 הדוגמאות נמהלו בכדי להגיע לריכוזµg/µlפרט לדוגמאת השטיפה עקב( למשךBSA מיהולים שונים של 3ריכוז נמוך מידי(. לאחר מכן הורתחו ביחד עם

דקות ליצירת דנטורציה של החלבונים )כך ירוצו החלבונים באלקטרופורזה לפי5 בנספח(.9)ניתן לראות סעיף היוצרות את המטען(. SDSהגודל, ביחד עם מולקולות

:GSTקביעת פעילות .5

, שתי מולקולות אלו הן סובסטרטGSH ו- CDNBרמת פעילות האנזים נמדדה ע"י הוספת . תוצר זה בולע באורך גלGSH-DNB , אשר הופך אותם לקומלקפס והתוצר GSTשל

340nmבגרף של בליעה כנגד זמן עבור כל פרקציה נוכל למצוא את קצב הראקציה ומכן . להשליך על רמת פעילות האנזים ועל ריכוזו.

בנספח(.10-11)ניתן לראות סעיפים

תוצאות:

0 50 100 150 200 2500

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

בביוראקטור החיידקים גידול עקומת

[time [min

O.D

IPTG

:חישוב ריכוזי חלבון בארבעת הפרקציות בשיטת ברדפורד

ממוצע2בליעה 1 בליעה מיהולדוגמא µg/mlריכוז

*

ריכוז סופי בהתאם לפקטורהמיהול

600.6930.6920.6925121.22647273.584מיצוי חיידקיםun-bound600.6270.6310.629109.24536554.718

50.3530.360.356557.83019289.15095שטיפה400.6810.6680.6745117.83024713.208אילוציה

: 280nm באורך גל UV בדיקת ריכוז

1 בליעה מיהולדוגמא ריכוז חלבון כללי

1mg/mL ריכוזGST

ריכוז סופי

1mg/mL בהתאם לפקטורהמיהול

מיצויחיידקים

2000.4410.4410.220544.1

un-bound2000.4470.4470.223544.71000.0680.0680.0343.4שטיפה1000.1540.1540.0777.7אילוציה

בפרקציות השונות: GST קצב פעילות

החיידקים מיצוי un bound אילוציה שטיפה0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

האנזים פעילות קצב

V

בדיקת פעילות האנזים בפרקציית אילוציה )מיכאלס מנטן(:

0 100 200 300 400 500 600 700 800-0.005

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0.035

0.04

0.045

הסובסטרט ריכוז השפעתהראקציה קצב על

[S] µM

V

Km=2628.2μM=2.628mM

Vmax=0.203 μMmin

חישוב ניצולת-

הכולל שזוקקה לאחר אילוציה: GSTמשקל החלבון

enzyme concetration×solution volume=4713.2 ugmL×0.5mL=2356.6 μg=2.3566mg

דרך א'

מהמשקל היבש של החיידקים בריאקטור:GSTניצולת ייצור החלבון

totalenzyme weighttotal dry weight

×100%= 2.3566mg

38.9mgmL×615mL

×100%=0.00985%

דרך ב'

ממשקל החלבון הכולל:GSTניצולת ייצור

total enzyme weighttotal proteinweught

×100%= 2356.6 μg7273.6 μg/mL×40mL

×100%=0.81%

0.001 0.0015 0.002 0.0025 0.003 0.0035 0.004 0.00450

10

20

30

40

50

60

70

f(x) = 12953.6096997376 x + 4.92892858358869R² = 0.956747249892383

lineweaver burk

1/[s]

1/V

דיון ומסקנות –

בהפקת החלבון בתנאי מעבדה חיפשנו אחר התנאים האופטימליים שיובילו לתפוקה גדולה יותר . תנאיםterrific ומצע גידול 37oC pH=7 מצאנו שהתנאים הם GSTשל חיידקים ובפרט חלבון ה-

וסביבת גידולו הינה מערכת העיכול של בני אדםE.coliאלו תאמו את ציפיותינו שכן מדובר ב- הכוללת תנאים אלו.כמו כן חיפשנו את השלב הלוגריתמי בגידול החיידקים שבמהלכו נוסיף את

תיעשה בשלב לוגריתמי על מנת ליצור כמות גדולה של חיידקים קודםIPTG. הוספת IPTGהמשרן GSTלתחילת ייצור החלבון ובכך ליצור ביומסה גדולה שתיצור את החלבון בבת אחת. ייצור ה-

דורש אנרגיה אשר באה על חשבון גידול החיידקים ולכן מעכב את קצב ההתרבות. ניתן לראות חלה ירידה בשיפוע שלב לוגריתמי.IPTGבגרף גידול חיידקים בביוריאקטור כי מרגע הוספת

בהפקת החלבון בביוריאקטור גודלה תרבית חיידקים קודם לכן אשר תהווה את המזרע שנוסיף לפני גידול תרבית זו, פלסמיד זה נוחpGEXלביוריאקטור. אל חיידקי המזרע הוכנס פלסמיד

. גן זה נשלט עלGSTלסלקצית החיידקים הרצויים כי הוא מכיל עמידות לאמפיצילין בנוסף לגן של שמונע את ייצור החלבון בנוכחות גלוקוז.lac operonידי

יש לגדל את המזרע מחוץ לריאקטור לפני הוספת המזרע בבקבוק עם אותו המצע על מנת למנוע מצב של עקה לחיידקים ובכדי לוודא שאנו בשלב הלוגריתמי בעת הוספת המזרע, כך

לקצר את שלב ההסתגלות של החיידקים כאשר נעביר אותם לריאקטור.

לאחר זריעת החיידקים בביוריאקטור מדדנו בליעה כל חצי שעה בכדי למצוא את הנק' המועדפת , בתיאוריה רצינו להוסיף את האופרטור כאשר הבליעה שלנו היא ביןIPTGלהוספת האופרטור

וזאת כיוון שהתחלנו בבליעה גבוהה יחסית1.85 רק בבליעה של IPTG אך בפועל הוספנו 0.8-1 הייתה רק הכפלה אחת ואנו רצינו לתת לחיידקים להתרבות לפחות זמן1וכאשר הגענו לבליעה

בחצי שעה.IPTGדור אחד נוסף לכן דחינו את הוספת

נציין כי שתי הקבוצות קיבלנו מזרע חיידקים שגודלו בצורה שונה, אנו קיבלנו חיידקים אשר גודלו במצע חדש ולעומת זאת הקבוצה השניה קיבלה חיידקים שגודלו במצע גידול ישן. ניתן לראות

את ההבדלים בעקומה בנספח. בשלב ההסתגלות בניגוד לציפיות החיידקים במצע הישן הראו התרבות מהירה יותר מהמצע החדש וכמעט ללא שלב לאג, בהמשך בהתאם לציפיות ממצע

חדש החיידקים הראו התרבות מהירה וארוכה יותר. מצע ישן עלול להכיל חומרי הזנה שהתפרקו, שקעו או עברו שינוי כימי עם הזמן ולכן אינם מספקים לחיידקים את הדרוש להם. אנו משערים כי

העליה המהירה יותר במצע הישן בשלב הלאג הופיעה מאחר והעברת האינוקולום ממצע ישן למצע חדש גרמה להם להתפתח מהר יותר כיוון שהם הגישו את הריכוז הגבוה של החומרים

שהם צריכים ולכן יצאו משלב הלאג מהר יותר. לאחר מכן כאשר החיידקים שגודלו במצע החדש יצאו משלב הלאג הם התחילו את השלב הלוגריתמי והחלו להכפיל את עצמם ולכן עברו את

החיידקים שגודלו במצע הישן.

מכאן עברנו לשלב קציר החיידקיםUp Stream Processingעד שלב זה התהליך היה ה-מהביוריאקטור.

בשלב זה השתמשנו כמה שיטות הפרדה ראשוניות, סירכוז ע"י צנטריפוגה, סינון גס על ידי גזה. שקלנו את המשקל הרטוב והיבש של החיידקים על מנת למצוא ניצולת. מהשוואת המשקל

.90%הרטוב והיבש אנו מסיקים כי תכולת המים בחיידקים היא כ- הינו חלבון תוך תאי ולכן העברנו את מיצוי החיידקים דרך הומוגנייזר ע"מGSTכידוע חלבון ה-

להביא לפיצוץ תאי החיידקים בצורה זולה ומהירה מאוד גם לכמויות גדולות. במהלך מיצוי החלבון מתאי החיידקים לקחנו דגימות מהשלבים מיצוי, חלבונים שאינם קשורים, שטיפה

ואילוציה בכדי לראות היכן אנו מפסידים כמות גדולה של חלבון. את ריכוזי החלבון מדדנו בשנישיטות בפרקציות השונות.

על פי שיטת ברדפורד ראינו כי ריכוז החלבון הכללי הגבוה ביותר הופיע במיצוי החיידקים, לאחר , אלוציה ואז שטיפה. מיצוי חיידקים הינה פרקציית האם שלנו ובה כל החלבוןunboundמכן

היאunboundהכללי של החיידק כך שבה אכן תופיע כמות החלבון הגבוהה ביותר. פרקציית לספרוז לכן יש עדיין כמות גדולה שלGSTהפרקציה של החלבון החיידקי לאחר שקשרנו את

חלבון כללי.פרקציית השטיפה אמורה להיות בעלת כמות חלבון קטנה מאוד והיא אכן כך.באלוציה הריכוז גבוה אך נפח האלוציה הכולל הינו חצי מ"ל ולכן בעצם מדובר בכמות קטנה.

GSTכידוע בתא החיידק ישנם הרבה חלבונים כך שלא ציפינו לראות כמות גבוה של ריכוז .unboundבפרקציית האלוציה לעומת מיצוי חיידקים ו-

ועל כן ספציפיות זו נבחן בבדיקת פעילות האנזים. עם זאתGSTשיטת ברדפורד אינה ספציפית ל- היה גבוהunbound. בשיטה זו מצאנו כי ריכוז ה-UVבדקנו ריכוז גם בעזרת ספקטרופוטומטר

מעט ממיצוי החיידקים עובדה זו נוגדת את ההיגיון ואת הממצאים מבדיקת ברדפורד. נסביר זאת בשל השימוש בקיווטה אחת לכל הפרקציות המובילה לאי דיוק בריכוזים אך פחות או יותר

R=0.98 בשיטת ברדפורד הראה על BSAמאמתת את הממצאים. נציין כי עקומת הכיול של חלבון אנוUVכלומר על דיוק גבוה, בצירוף האי דיוקים הגבוהים ממיחזור ואי שטיפת הקיווטה בשיטת

נוטים לקבל את התוצאות משיטת ברדפורד כמדוייקות. וידאנו את נכונות התוצאות ואת סדר הגודל הכללי של נוכחות חלבון בעזרת הרצה בג'ל

של נספח התוצאות ניתן לראות כי בפרקציית המיצוי היה כמות9אלקטרופורזה, ואכן בסעיף גדולה של חלבון לכל בכל הגדלים וייתכן ואף ברחו חלבונים קטנים מחוץ לג'ל. פרקציית ה-

unboundהייתה עם פיזור דומה אך בהירה מעט יותר ובפרקציית השטיפה לא נצפו בנדים ברורים כלל אלא שאריות קטנות של חלבון, בפרקציית האלוציה נצפה בנד יחיד ומאוד כהה של

GST, דבר זה מעיד על עבודה נכונה ונקייה לאחר קשירת ה-25kD בגודל של GSTחלבון ה- ומכאן אנו מבינים כיunboundלספרוז. נציין כי ישנם שני בנדים של חלבון בפרקציות מיצוי ו-

לספרוז ועל כן על מנתGST לחרוזי הספרוז לא הצלחנו לקשור את כל ה-GSTבתהליך קשירת ה- לשפר את התהליך ולמנוע איבוד חלבון רצוי אנו ממליצים להוסיף חרוזי ספרוז בכמות גדולה

לספרוז.GSTיותר או לחלופין לאפשר זמן רב יותר לקשירת ה-

יש צורך בשיטה ספציפית לכן השתמשנו בסובסטרט שלGSTעל מנת לקבוע את נוכחות החלבון ל-CDNBאנזים זה, את קצב הריאקציה מדדנו ע"י השינוי בריכוז התוצר של ריאקציית צימוד בין

GSH ע"י GST וללא GSTשכן ריאקציה זו קורת גם ספונטנית. ההפרש ביניהם נתן לנו מדד של קצב פעילות האנזים וכמותו הכוללת בפרקציות השונות.

קצב פעילות האנזים הגבוהה ביותר התקבלה בפרקציית אלוציה ואכן לפי ההרצה בג'ל בפרקציה הגבוהה ביותר. נציין כי ניתן לראות גם פה את איבוד החלבון הגדולGSTזו הייתה לנו כמות ה-

כתוצאה מכמות לא מספקת של חרוזי ספרוז או מזמן לא מספק לאנזים להיקשר לחרוזים. unboundלאחר האלוציה קצב פעילות האנזים הגבוהה הופיע במיצוי החיידקים וברמה דומה ב-

עובדה זאת מאששת את שהסקנו על כמות איבוד החלבון הרצוי בשימוש בחרוזי ספרוז. עם זאת.GSTבשטיפה נראה כי לא איבדנו חלבון

המתקבל מקוR2הערה - את המיהולים למדידת הבליעה במהלך הריאקציה החלטנו לפי ערך ה- הייתה קטנה מאוד עד לא קיימתGSTהמגמה בגרפים בליעה כנגד זמן. מאחר ובשטיפה נוכחות

נמוך במיוחד.R2התקבל ערך

מצאנו ע"י מדידת בליעה בריכוזי סובסטרט שונים עבור פרקציית האלוציה.Km – את Kmקביעת ראינו כי ככל שריכוז הסובסטרט גדל כך קצב הריאקציה עולה. בנינו גרף בליעה כנגד זמן לכל 11ריכוז והוצאנו את מהירות הריאקציה לכל ריכוז. לאחר מכן בנינו עקומת מיכאליס מנטן )סעיף

שהתקבלKm. ה-Vmax ואת Km ומתוך עקומה זאת הוצאנו את Lineweaver Burkבנספח( ועקומת הערך שקיבלנוKm(lit)=1.43mM והערך הספרותי שמצאנו מתוך מאמר הינו 2.628mMלנו הינו

הינו קרוב והשגיאה נוסעת משיטות העבודה ומשגיאות עבודה שלנו. אין לצורת גידול החיידקים השפעה על האנזים כיוון שהאנזים הינו קבוע ולא תלוי בצורת גידולו אך ייתכן וחומרים או תנאים סביבתיים אחרים האיצו את הפעילות שלו במקרה שלנו. לפי המאמר טמפ' משפיעה רבות על

פעילותו.

כאשר ביצענו חישובים למיהולים, עלינו על מקור שיכול להיות בעיה, כאשר משתמשים בריכוז על750uM ל-500uM מהווה גורם מגביל ולכן בעצם אין שינוי בין הריאקציה ב-GSH ה-750uMשל

בעודף בריכוז הגבוה כך שלא יהיה סיכוי שהוא יהווהGSHכן תכננו חלק נוסף לניסוי ובו נוסיף ניתן לראות כי בפרקציה בה הוספנו יותר750uM ב-cDNBגורם מגביל. בהשוואה בין שני ריכוזי

GSH-קצב הריאקציה היה גדול יותר בהרבה משמע שאכן ה GSHהיווה גורם מגביל בריאקציה המקורית.

בריכוז הגבוה ביותר )GSHמסקנתנו היא שעל מנת לשפר את הדיוק של הניסוי יש להוסיף יותר

750uM 750(. אמנם יש גידול בין הריאקציה שלuM-500 המקורית לuMאך זה נובע משאריות של

GSHשנשארו מהבופר אלוציה אך שאריות אלה לא מספיקים על מנת להוות עודף לריכוז הגבוה . )ניתן לראות את השוואה גרפים של קצב הריאקציה בנספח התוצאותGSHויש להוסיף עוד

(12בסעיף

כוללת חלקי המשקל היבש של כל החיידקיםGSTאת הניצולת הראשונה חישבנו ככמות חלבון שהתקבלו מהביוריאקטור, לכן חישבנו את המשקל היבש למ"ל ואז הכפלנו בנפח הביוריאקטור.

הניצולת שקיבלנו נמוכה מאוד אך זה צפוי שכן משקל החיידקים גדול בעשרות מונים ממשקלהחלבון שהם מייצרים, גם אם הם מייצרים את החלבון מספר פעמים.

לחלק לכמות חלבון כוללת. לכן לקחנו את ריכוזGSTאת הניצולת השניה חישבנו ככמות חלבון החלבון הכולל שמצאנו בפרקציית מיצוי והכפלנו בנפח המקורי של המיצוי שעבר בהומוגנייזר )

שזהו ערך הגיוני שהרי תאי חיידק ותאים בכללותם0.81% מ"ל( הערך שהתקבל הינו 40 בנספח התוצאות(13מורכבים מהמון חלבונים. )סעיף

והבליעה האחרונה שהתקבלה2.89הבליעה האחרונה שהתקבלה בריאקטור שלנו היא . הקבוצה השניה קיבלה חיידקים אשר גודלו טרם1.94בריאקטור של הקבוצה השניה היא

הזריעה במצע גידול ישן ולעומת זאת אנו קיבלנו מזרע שגדל במצע חיידקים חדש. הבדל זה גרם ככל הנראה לשלב לאג ארוך יותר ובסופו של דבר לבליעה קטנה יותר בסופו של דבר. הבליעה

הקטנה יותר מעידה על כמות קטנה יותר של חיידקים ואכן המשקל הרטוב והיבש שלנו גדול יותר(4משל הקבוצה השניה. )ניתן לראות את החישוב בנספח התוצאות בסעיף

במהלך התהליך. בתעשייה ישנו דגש רב על נקיוןGSTכפי שכבר הזכרנו ישנו איבוד של חלבון התוצר, לא ניתן לשווק מוצר ללא רמת ניקיון כמעט מוחלטת ועל כן יש לשים דגש על הניקיון אך

עם זאת איבוד חומר כפי שקרה לנו במעבדה לא יכול לקרות ואין אפשרות שהניקיון יבוא על חשבון איבוד חומר אלא יש לשלב בין שני הדברים, במעבדה שלנו עקבנו אחרי איבוד החומר

בתהליך ההפקה כאשר לקחנו דוגמא מכל שלב בתהליך וביצענו עליה הרצה בג'ל על מנת באותה הפרקציה, כך יכולנוGST ובנוסף ביצענו בדיקת פעילות 25kDלראות האם יש בנד ב-

לקבוע את מידת איבוד החומר באותו שלב ולשים לב לפעם הבאה בשלב זה יותר או לקבועדרכים למניעת איבוד החומר.

מהמיצוי אל חרוזי הספרוז ועל כן על מנת לשפר אתGSTאת רוב החומר איבדנו בעת ספיחת ה- התהליך היינו מוסיפים עוד חרוזים על מנת שיהיו בעודף גדול יותר או לחלופין מתן זמן רב יותר

(9 בג'ל בנספח בסעיף GST. )ניתן לראות את נוכחות ה-GSH ל-GSTלהיקשרות ה-

נספח תוצאות וחישובים:

דוגמאות של תרביות חיידקים שגודלו בתנאים שונים.5צילום הג'ל לאחר הרצת .1

O.D 600nm= 1.710: 2נמדדה הבליעה של דוגמא .2 O.D 600nm= 0.672 והתקבלה בליעה: 10לכן, נמהלה פי

נעשה החישוב הבא עבור נפח550ml בנפח הביוראקטור 0.5בכדי לקבל בליעה של כ-x=0.5×550ml×0.672המזרע הדרוש:

x=40.92mlמדידת הבליעה של המצע בביוראקטור בזמן גידול החיידקים כל חצי שעה:.3

13:0012:3012:0011:3011:0010:3010:009:30Time

2101801501209060300Time passed

[min]

0.2890.2770.2550.4640.3700.2190.5820.45

5O.D

מיהול10101055500

2.892.772.552.321.851.0950.5850.45

5O.Dסופי

IPTG הוספת

מראה על2ניתן לראות כי דוגמא הגבוה ביותר. GSTריכוז

0 50 100 150 200 2500

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

בביוראקטור החיידקים גידול עקומת

[time [min

A (O

.D=

600n

m)

כדי למצוא את המשקל הרטוב והיבש של מיצוי החיידקים25mLהוצאה דוגמא של .4)שהתקבל לאחר סירכוז והרחפה הראשונה(:

משקל רטוב- 265.9mg25mL

=10.363mg /mL

משקל יבש- 39.8mg25mL

=1.592mg /mL

נתונים שהתקבלו בקבוצה השנייה:

משקל רטוב- 163mg25mL

=6.52mg /mL

משקל יבש- 26.6mg25mL

=1.064mg /mL

:BSAחישוב ריכוזי חלבון .5

Pbs (mL)BSA (mL) ריכוזg/mLµ4000039825390102538020503604010034060150

ובניית גרף כיול )בשיטת ברדפורד(:BSAמדידת בליעה עבור ריכוזי .6

Concetration )ug/mL(AbsorptionAbs 2Average

000.0010.000550.0640.0570.0605

250.2050.2070.206500.3760.3460.361

1000.6220.6370.6295

IPTG

1500.7880.8080.798

0 20 40 60 80 100 120 140 1600

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

f(x) = 0.00532 x + 0.0499833333333333R² = 0.9801712325915

Abs vs. BSA concetration

[µg/ml ]ריכוז

O.D

(595

nm)

הדוגמאות ומציאת הריכוז בהתאם למשוואה בעקומת הכיול:4מדידת בליעה עבור .7

ממוצע2בליעה 1 בליעה מיהולדוגמא µg/mlריכוז

*

ריכוז סופי בהתאם לפקטורהמיהול

600.6930.6920.6925121.22647273.584מיצוי חיידקיםun-bound600.6270.6310.629109.24536554.718

50.3530.360.356557.83019289.15095שטיפה400.6810.6680.6745117.83024713.208אילוציה

=C*חישוב הריכוז: A−0.050.0053

:280nm באורך גל UVבדיקת ריכוז .8

1 בליעה מיהולדוגמא ריכוז חלבון

1mg/mLכללי GSTריכוז

1mg/mL ריכוז סופי בהתאםלפקטור המיהול

2000.4410.4410.220544.1מיצוי חיידקים

un-bound2000.4470.4470.223544.71000.0680.0680.0343.4שטיפה1000.1540.1540.0777.7אילוציה

*Yield can be estimated by measuring absorbance at 280nm:

For total protein 1 A280 = 1mg/mL, For GST, 1 A280 = 0.5 mg/mL

9.

קביעת קצב פעילות האנזים בכל אחת מהפרקציות:.10

מיצויחיידקים:

Time )min(בליעה (GST)ראקציה ללא

בליעה (GST)ראקציה בנוכחות

פעילות האנזיםבלבד

00.1240.150.02610.1190.1440.02520.1260.1510.02530.1230.1610.03840.1260.1650.03950.1260.1720.046

10ug BSA

סמןגודל

מיצויחיידקים

Un-bound

אילוצישטיפהה

1ug BSA

5ug BSA

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.50

0.0050.01

0.0150.02

0.0250.03

0.0350.04

0.0450.05

f(x) = 0.0056 x + 0.0178R² = 0.90845886442642

מיהול ) חיידקים במיצוי האנזים פעילות (1/60קצב

Time(min)

A(O

.D =

340

nm)

un bound

Time )min(בליעה (GST)ראקציה ללא

בליעה(GST )ראקציה בנוכחות

פעילות האנזיםבלבד

00.120.118-0.00210.1070.1260.01920.1040.1310.02730.1040.150.04640.1020.1690.06750.1020.1770.075

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.50

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08f(x) = 0.0152 x + 0.00119999999999999R² = 0.975346166835528

ב האנזים פעילות ) Unbound-קצב 1/20מיהול )

Time(min)

A(O

.D =

34

0n

m)

שטיפה:

Time )min( בליעה )ראקציה ללא

GST) בליעה )ראקציה בנוכחות

GST) פעילות האנזים

בלבד00.180.14-0.0410.1150.1160.00120.1140.113-0.00130.1150.1150

40.1150.115050.1170.116-0.001

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5

-0.0015

-0.001

-0.0005

0

0.0005

0.001

0.0015

f(x) = − 0.0003 x + 0.0007R² = 0.321428571428572

מיהול ) בשטיפה האנזים פעילות (1/5קצב

Time(min)

A(O

.D =

340

nm)

אילוציה:

Time )min( בליעה )ראקציה ללא

GST) בליעה )ראקציה בנוכחות

GST) פעילות האנזים

בלבד00.1110.11-0.00110.1080.1210.01320.1120.1380.02630.110.1660.05640.110.1750.06550.1110.1870.076

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.50

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08f(x) = 0.0165 x − 0.00229999999999999R² = 0.957682566483748

מיהול ) באילוציה האנזים פעילות (1/40קצב

Time(min)

A(O

.D =

340

nm)

Vפרקציה פקטורמיהול

קצב פעילותGST

מיצויהחיידקים

0.0056600.336

un bound0.0152200.3040.000350.0015שטיפה

0.0165400.66אילוציה

החיידקים מיצוי un bound אילוציה שטיפה0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

האנזים פעילות קצבV

ע"י מדידות בליעה בריכוזי סובסטרט שונים )עבור פרקצית אילוציה(:Kmקביעת .11

time [min

]750500250125250

אילוציה

ביקורת

פעילו ת

GSTאילוצי

הביקור

ת

פעילו ת

GSTאילוצי

הביקור

ת

פעילו ת

GSTאילוצי

הביקור

ת

פעילו ת

GSTאילוצי

הביקור

ת

פעילו ת

GSTאילוצי

הביקור

ת

פעילו ת

GST

00.4810.4360.0450.4770.4540.0230.0930.090.0030.0420.043-00.0230.0160.0070.460.0030.457

10.3540.2910.0630.2890.304-0.020.1080.0930.0150.0450.0440.0010.0180.0160.0020.0010.002-0

20.2890.2030.0860.250.1960.0540.1240.0920.0320.0470.0450.0020.0160.02-00.0010.0010

30.2960.1330.1630.2870.1870.10.1460.0930.0530.0480.0450.0030.0180.0150.00300.002-0

40.3280.1410.1870.3150.1780.1370.1640.0940.070.050.0470.0030.0180.0150.00300.002-0

50.3590.1280.2310.3440.1770.1670.1830.0960.0870.0480.0460.0020.0170.0150.002---

0 1 2 3 4 5 60

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

f(x) = 0.0173142857142857 x + 4.76190476190533E-05R² = 0.995615240023135

האנזים פעילות קצב CDNB[250µM]

time [min]

A (O

.D=

340n

m)

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.50

0.00050.001

0.00150.002

0.00250.003

0.0035f(x) = 0.0007 x + 0.0005R² = 0.890909090909091

האנזים פעילות קצב CDNB[125µM ]

time [min]

A (O

.D=

340n

m)

0 1 2 3 4 5 60

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

f(x) = 0.0394 x + 0.0306666666666667R² = 0.963862360962456

האנזים פעילות קצבCDNB[750µM ]

time [min]

A (O

.D=

340n

m)

1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.50

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

f(x) = 0.0376 x − 0.0171R² = 0.990999579419599

האנזים פעילות קצב[ CDNB[500µM

time [min]

A (O.D

= 340

nm)

[s]1/[s]v1/v

7500.00133333

30.039425.380710665000.0020.037626.595744682500.0040.017357.803468211250.0080.00071428.571429250.04-0.0005-0--0.0005-

750*0.0010.051819.30501931

0001 002 003 004 005 006 007 00810.0-

0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

הסובסטרט ריכוז השפעתהראקציה קצב על

µM [S]

V

−1Km

=−4.928912954

≫≫Km=2628.2 μM=2.628mM

1Vmax

=4.9289→Vmax=0.203 μMmin

או בשיטה נוספת:

KmVmax

=12954→Vmax= Km12954

=0.203

0.001 0.002 0.003 0.004 0.0050

10203040506070

f(x) = 12953.60969974 x + 4.928928583589R² = 0.956747249892383

lineweaver burk

1/[s]

1/V

2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.50

0.00050.001

0.00150.002

0.00250.003

0.0035

f(x) = − 0.0005 x + 0.00466666666666667R² = 0.75

האנזים פעילות קצבCDNB[25µM]

time [min]

A (O

.D=

340n

m)

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

-0.0025

-0.002

-0.0015

-0.001

-0.0005

0

f(x) = − 0.0005 xR² = 0.454545454545455

האנזים פעילות קצב[ CDNB[0µM

time [min]

A (O.D

= 340

nm)

כלומר אותו מספר בשני השיטות.

על קצב פעילות האנזים- GSH בדיקת השפעת ריכוז .12

0 1 2 3 4 5 60

50.01.0

51.02.0

52.03.0

53.0

x 6824175824177150.0 = (x)f 2590832590832730.0 +

289872644153859.0 = ²R

פעילות קצבGSH[10µM]

CDNB[750µM]

time [min]A

(O.D

= 34

0nm

)

חישוב ניצולת- .13 הכולל שזוקקה לאחר אילוציה: GSTמשקל החלבון

enzyme concetration×solution volume=4713.2 ugmL×0.5mL=2356.6 μg=2.3566mg

דרך א'

מהמשקל היבש של החיידקים בריאקטור:GSTניצולת ייצור החלבון

totalenzyme weighttotal dry weight

×100%= 2.3566mg

38.9mgmL×615mL

×100%=0.00985%

דרך ב'

ממשקל החלבון הכולל:GSTניצולת ייצור

total enzyme weighttotal proteinweught

×100%= 2356.6 μg7273.6 μg/mL×40mL

×100%=0.81%

0 1 2 3 4 5 60

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

f(x) = 0.0394 x + 0.0306666666666667R² = 0.963862360962456

האנזים פעילות קצב[GSH[5µM

[ CDNB[750µM

time [min]

A (O.D

= 340n

m)

ביביליוגרפיה-

1. http://www.google.co.il/url? sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&cad=rja&ved=0CCoQFjAB&url=http%3A%2F%2Fwww.gelifesciences.com%2Fwebapp%2Fwcs%2Fstores%2Fservlet%2Fcatalog%2FGELifeSciences%2Fbrands%2Fsepharose%2F&ei=8r90UN6jDKK-0QXTxYGgDg&usg=AFQjCNEnuEkmQDL-p7yCwqrEb-mOpTGzpQ&sig2=zav2wV7w0vy639yKALpQRA

2. Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of

protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976.

3.  Weber K, Osborn M )August 1969(. "The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.". J Biol Chem. 244 )16(: 4406–4412

4. Engineering of Therapeutic Proteins Production in Escherichia coli, Current Pharmaceutical Biotechnology, 2011, 12, 268-274

5. http://wolfson.huji.ac.il/purification/PDF/Tag_Protein_Purification/GST/ PHARMACIA_GST_Gene_Fusion_System_Handbook.pdf

6. Beckett GJ, Hayes JD )1987(, "Glutathione S-transferase measurements and

liver disease in man", Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition 2: 1–24

7. http://www.silverson.com/us/process/homogenizing.html