第六章 高效液相色谱分析法 第六章 高效液相色谱分析法 HPLCHPLC （（ High Pertormance Liquid ChromatographHigh Pertormance Liquid Chromatograph

yy ，，））

第一节 概述第一节 概述第二节 基本理论和条件选择第二节 基本理论和条件选择第三节 各类高效液相色谱法第三节 各类高效液相色谱法第四节 高效液相色谱仪第四节 高效液相色谱仪

第一节 概述

高效液相色谱法： 它在经典色谱理论的基础上，采用了高

压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。

一、 HPLC 的特点和实际应用

1. 特点：“三高” “一快” “一广”

高柱效——大于 30000 塔板 / 米柱效高（远高于一般 LC ）

高灵敏度 10-9g （紫外检测）、 10-11g （荧光检测）

高压： 150-350*105 Pa 分析速度快 应用范围广泛（可分析 80% 有机化合物）

二、 HPLC 与 GC 差别

1 ．分析对象的区别GC ：对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子

型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测 , 可测占有机物的 20%

HPLC ：不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的 80%

2 ．流动相差别的区别GC ：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。 HPLC ：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和 pH 值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。

3 ．操作条件差别GC ：加温操作HPLC ：室温；高压（液体粘度大，峰展

宽小）

第二节 基本理论和条件选择基础基础理论理论

热力学理论：塔板理论——平衡理论热力学理论：塔板理论——平衡理论 动力学理论：速率理论——动力学理论：速率理论—— VanderVander 方方

程程一、塔板理论一、塔板理论

理理 nLH / 22

21

2 )(16)(54.5)(W

t

W

ttn RRR

理

effeff nLH / 2

21

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)(54.5)(16W

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tn RReff

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tk R

2)1

(k

knneff

理

2 ）涡流扩散项及其影响

向扩扩散项后uCAH：HPLC （忽略纵mDB 2

T

Dm

相忽略大低，流动相柱温 BT

RtnHu

uHscmu

，但柱效，

时，/1

min/1mlu 选择兼顾柱效和分析时间，

讨论： 1 ）流动相流速对 HPLC 板高的影响（与 GC 对比）

dpA 2 dpA

柱效，， nHAdp

二、速率理论（与二、速率理论（与 GCGC 对比）对比）

1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （ dp≤10μm ） 首选化学键合相，匀浆法装柱2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇，

约 1ml/min 3. 柱温的选择：选室温 250C 左右

三、三、 HPLCHPLC 法中分离条件的选择法中分离条件的选择

一、液固吸附色谱法（ LSC ） 二、液液分配色谱法（ LLC ）三、离子色谱法（ IC ）四、空间排阻色谱法（ SEC ）五、高效逆流色谱（ HSCCC ）

第三节 各类高效液相色谱法简介第三节 各类高效液相色谱法简介

1 ．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异

一、液固吸附色谱法（ LSC ） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂

2．固定相：与GC比，固定相粒径不同（<10μm）（1）硅胶——70% （2）氧化铝• 适用：中等相对分子量（200~2000） 同族分离或同分异构体分离

3 ．流动相：底剂（烷烃） + 有机极性调节剂 例： 正己烷或庚烷 + 氯仿 - - -注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间4 ．出柱顺序：弱极性组分先出柱，强极性组分后出柱5 ．硅胶吸水量↑， LSC→LLC• 硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大• 硅胶含水量 >17% 分配色谱 硅胶失活→载体 吸附的水→固定液

1 ．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2 ．正相色谱与反相色谱正相色谱——固定液极性 > 流动相极性（ NLLC ） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分：甾醇、类（磷）脂化合物、脂肪酸

反相色谱——固定液极性 < 流动相极性（ RLLC ） 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 理想的、普遍适用的分析方法，同族化合物 （有机化合物都存在疏水基团）

二、液液分配色谱法（ LLC ）

利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面分离机制：分配 + 吸附（以 LLC 为基础）特点： 不易流失 热稳定性好 化学性能好 载样量大 适于梯度洗脱

3 ．固定相（ 1 ）载体 + 固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用（ 2 ）化学键合固定相

1 ）反相键合相色谱固定相：极性小的烷基键合相 C8 柱， C18 柱（ ODS 柱—— HPLC 约 80% 问题）

流动相： 底剂 + 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇，乙腈， THF适用：非极性 ~ 中等极性组分（ HPLC80% 问题）

（ 1 ）反相离子对色谱法（ IPC 或 PIC ）反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加 k 和 tR ，以改善分离

适用：较强的有机酸、碱

（ 2 ）反相离子抑制色谱在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相 pH 值，抑制

组分解离，增加其 k和 tR，以达到改善分离的目的

1 ）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质 pH 一定的缓冲溶液2 ）调节 pH 范围： 3.0~8.0 pH>8.0 破坏键合相与载体的结合 pH<3.0 腐蚀柱子3 ）适用：极弱酸碱物质 pH=3~7弱酸； pH=7~8 弱碱；两性化合物

2 ）正相键合相色谱固定相：极性大的氰基或氨基键合相流动相：极性小（同 LSC ） 底剂 + 有机极性调节剂 例：正己烷 + 氯仿 - 甲醇，氯仿 -乙醇适用：• 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小） 分离物质也相似• 氨基键合相与硅胶性质差别大，呈碱性 分析极性大物质、糖类等

• 阳离子官能团：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。

• 阴离子官能团：―R4N＋季铵基、-氨基等。

• ( 由于硅胶基质的键合相只能在pH＝2～7.5的范围内使用，而离子交换色谱要求有更宽的pH范围，因此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。)• 流动相：水，通过盐浓度或PH控制组分保留值

三、离子交换色谱法（ IC ）

四、排阻色谱色谱 （ size- exclusion chromatography ）固定相：凝胶 ( 具有一定大小孔隙分布 ) ；

原 理：按分子大小分离。 可对相对分子量大（大于 2000 ）化合物

按质量分离（相对分子质量差别大于 10% ）

分离类型选择

第四节 高效液相色谱仪

11 ．贮液罐（滤棒，可滤．贮液罐（滤棒，可滤 去颗粒状物质）去颗粒状物质）22 ．高压泵（输液泵）．高压泵（输液泵）33 ．进样装置．进样装置44 ．色谱柱——分离．色谱柱——分离55 ．检测器——分析．检测器——分析66 ．废液出口或组分收集器 ．废液出口或组分收集器 77 ．记录装置．记录装置

二、高效液相色谱仪流程图二、高效液相色谱仪流程图

一 流动相贮存器

对流动相的要求：1 ）与固定液不反应2 ）对样品有良好溶解度 k=1~10 k=2~5 最理想的3 ）与检测器匹配： UV （常用，测定波长应大于溶剂的截止波长） 荧光，电化学4 ）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈） 使用前过滤、脱气

流动相中气泡？ •原因 •危害

•脱气 超声波振荡；惰性气体鼓泡吹扫脱气；真空脱气。

流速 不稳、基线 起伏、噪音峰 尖锐、检测器问题

氧气空气

二．泵： 恒压泵：流量精度不稳 恒流泵：常用

三 进样装置

1. 隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室）

GC 系统压力较小，可以 HPLC 系统压力太大，必须停泵进样（早期）

2. 阀进样：不必停泵，六通阀

进样装置

耐高压的六通阀进样装置

四 梯度淋洗装置载液（即流动相）中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。外梯度 :

内梯度 :

五 高效分离柱

柱体为直型不锈钢管，内径 1 ～6 mm ，柱长5 ～40 cm 。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。

六 液相色谱检测器 1. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点：灵敏度高； 线形范围高；流通池可做的很小（ 1mm × 10mm ，容积 8μL ）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。

2. 光电二极管阵列检测器

紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器： 1024 个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。

光电二极管阵列检测器

3. 示差折光检测器（ differential refractive index detector ） 除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；