Laser ScanningConfocal Microscope

激光扫描共聚焦显微镜 LSCM在生命科学中应用

1 、显微形态学常用工具电子显微镜 光学显微镜

TEM SEM 生物显微镜 荧光显微镜 实体镜

LSCM

2 、 LSCM 简介A. 特点用激光作为光源，分辨率高，对样品损伤小，活体观察。对样品做光学切片，具有 Z 轴分辨率。以样品产生的荧光为检测信号，可进行定性、 定量测量。计算机重构形成立体图像。监测时间空间动态变化。超出单纯形态学观察。

B. 光路

物镜标本

针 孔

有针孔

无针孔

C. 成像原理

A B BC C

ＰＭＴC A B A

3 、功能介绍具有普通光镜所有的功能 : 万能生物显微镜、荧光显微镜、微分干涉A. 多通道、多荧光成像B. 光学切片，重构三维显微图像C. 生物活性物质（蛋白质、核酸、离子）定性、定量、定位分析D. 生理生化指标（ pH 、 Ca2+ 、 Mg2+ 等）的动态观察、测量E. 荧光漂白后恢复技术F. 细胞的激光显微“外科手术”及光陷阱技术G. 药物、病毒、细菌等外界物质的跟踪 H. 荧光蛋白的应用 I. 强大的图像处理功能。

利用 LSCM 还可以研究：细胞凋亡、细胞增值的动态过程；膜流动性、通透性、膜电位变化的检测；各种递质、高分子物质的扩散、受体的移动变化；细胞骨架、基因定位、原位杂交 .

A. 多荧光图像 用多荧光，您可以使用多个标记同时研究细胞结构。此外，多荧光试验是直接研究分子和其他细胞成分之间关系的唯一工具。

三重荧光图像与透射光图像

多通道成像原理Ch-1

DAPI

Ch-2

FICT

Ch-3

TRITC

=

=

=

B. 光学切片与重构三维图像

C. 生物活性物质定性、定量、定位监测

D. 生理生化指标的动态观察

Cover Glass:170um

Air/Oil/Water

For Inverted

E. 荧光漂白后恢复 研究膜或活细胞内用荧光标记的分子的扩散、转移或其他类型的运动

F. 细胞的激光 “外科手术”及光陷阱技术 将激光作为‘光子刀’，完成诸如细胞膜瞬间穿孔、切除线粒体溶酶体等细胞器、染色体切割、切除神经元突起等。 通过光陷阱操作可移动细胞器的微小颗粒和结构，广泛应用于染色体、细胞器、细胞骨架的移动。在细胞培养时还可以作细胞筛选

G. 药物、病毒、细菌的跟踪、定位 利用自发荧光或进行荧光标记，还可以检测该物质在细胞的分布及进入细胞的动态过程。

H. 荧光蛋白的应用GFP: 238 个氨基酸，分子量小， 479 激发，509 发射，其融合的蛋白不影响结合蛋白的生物活性，转染的细胞可继续传代。所以 GFP基因可以作为一种直观、方便、有效的报告基因。直接观察蛋白质定位、监测基因转录变化。

I. 笼锁—解笼锁 许多重要生物活性物质都有其笼锁化合物，处于笼锁状态其功能被封闭，而一旦被特异波长的瞬间光照射后，光活化解笼锁，恢复原有生物功能。 通过 LSCM 人为控制多种生物活性产物和其他化合物在生理过程中发挥功能的时间和空间。活性蛋白酶

反式肉桂酰活性部位酯化无活性酰基酶 光作用

解笼锁顺式

有活性

J. 强大的图像处理功能图像的加、减、乘、除、比率运算长度、面积、角度测量任意空间角度下的三维切面

4. 应用思路动植物组织 冰冻切片

100—5um 自发荧光或荧光染色

培养的细胞、组织 荧光染色加入处理

醛类长期固定样品 冰冻切片100—5um 蒸馏水漂洗 3 次

LSCM 观察

5. 应用实例A. 实时测量细胞内 Ca2+浓度的变化：

贴壁生长的细胞 缓冲液洗去杂质 Fluo -3荧光染色 37℃孵育30min

缓冲液洗脱未结合染料 10min488 激发525 检测加入药物等研研究因子

时间序列扫描细胞内 Ca 2+

浓度估算 图像存储图像分析

6 、 LSCM 的产生1957 年开始提出共聚焦显微镜技术原理。 LSCM 作为商品仪器是在 80 年代初。真正具有强大功能、完善的光学系统、计算机控制的 LSCM 从 1997 开始形成。

7. 我们的仪器配置 我校新购置蔡司 510配备 458 、 477 、 488 、 543 、 633 六条可见激光三个共聚焦通道。能满足绝大多数荧光染料的要求。

谢谢您的参与 !

希望大家交流、指正！于维军

405nm 0.5s

405nm 0.25sphoto bleaching

photo bleaching