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第一节 第一节 岛津岛津 LC-10ATLC-10AT 型型 HPHPLCLC 操作规程操作规程

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目的 : 规范岛津 LC-10AT 型高效液相色谱仪的使用。

范围 : 适用于岛津 LC-10AT 型高效液相色谱仪的使用。

职责 : 质检员对本规程的实施负责。

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一、 一、 系统组成系统组成

本系统由 2 个 LC-10ATvp 溶剂输送泵（分主 /A 泵和副 /B 泵）、 Rheodyne 7725i 手动进样阀、 SPD-10Avp 紫外 - 可见检测器、 N2000 色谱数据工作站和电脑等组成，另外还包括打印机、不间断电源等辅助设备。

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二、 二、 准备 准备

1 、准备所需的流动相，用合适的 0.45μm 滤膜过滤，超声脱气20min 。

2 、根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定量环。

3 、 配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的0.45μm 滤膜过滤。（注意腐蚀性与有机系的的溶剂）

4 、检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。

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接通电源，依次开启不间断电源、 B 泵、 A 泵、

检测器，待泵和检测器自检结束后，打开打印机、电脑

显示器、主机，最后打开色谱工作站。

三、 开机

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四、 四、 参数设定 参数设定

1 、 波长设定：在检测器显示初始屏幕时，按 [func] 键，用数字键输入所需波长

值，按 [Enter] 键确认。按 [CE] 键退出到初始屏幕。

2 、流速设定：在 A 泵显示初始屏幕时，按 [func] 键，用数字键输入所需的流速

（柱在线时流速一般不超过 1ml/min ），按 [Enter] 键确认。按 [CE] 键退出

。

3 、流动相比例设定：在 A 泵显示初始屏幕时，按 [conc] 键，用数字键输入流动相 B 的浓度百分数，按 [Enter] 键确认。按 [CE] 键退出。

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四、 四、 参数设定 参数设定

4 、 梯度设定：

4.1 ：在 A 泵显示初始屏幕时，按 [edit] 键， [Enter] 键；

4.2 ：用数字键输入时间，按 [Enter] 键，重复按 [func] 键选择所需功能（ FL

OW 设定流速， BCNC 设定流动相 B 的浓度），按 [Enter] 键，用数字键输入

设定值，按 [Enter] 键；

4.3 ： 重复上一步设定其它时间步骤；

4.4 ：用数字键输入停止时间，重复按 [func] 键直至屏幕显示 STOP ，按 [Ente

r] 键。按 [CE] 键退出。

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五、 五、 更换流动相并排气泡 更换流动相并排气泡

1 ： 将 A/B 管路的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中；

2 ：逆时针转动 A/B 泵的排液阀 180° ，打开排液阀；

3 ：按 A/B 泵的 [purge] 键， pump 指示灯亮，泵大约以 9.9ml/min 的流速冲洗， 3min （可设定）后自动停止；

4 ：将排液阀顺时针旋转到底，关闭排液阀。

5 ：如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。

6 ：如按以上方法不能排尽气泡，从柱入口处拆下连接管，放入废液瓶中，设流速为 5ml/min ，按 [pump] 键，冲洗 3min 后再按 [pump] 键停泵，重新接上柱并将流速重设为规定值。

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六、 六、 平衡系统 平衡系统

1、查看基线：

1.1：按《N2000色谱数据工作站操作规程》打开“在线色谱工作站”软件，

1.2：输入实验信息并设定各项方法参数后，

1.3：按下“数据收集”页的 [ ] 按钮。

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六、 六、 平衡系统 平衡系统

2 、等度洗脱方式 2.1 ：按 A 泵的 [pump] 键， A 、 B 泵将同时启动， pump 指示灯亮。用检

验方法规定的流动相冲洗系统，一般最少需 6倍柱体积的流动相。

2.2 ：检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。

2.3 ：观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过 1MPa 。如超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡，按检查管路后再操作。

2.4 ：观察基线变化。如果冲洗至基线漂移 <0.01mV/min ，噪声为 <0.001m

V 时，可认为系统已达到平衡状态，可以进样。

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六、 六、 平衡系统 平衡系统

3 、梯度洗脱方式3.1 ： 以检验方法规定的梯度初始条件，按 2 项下方法平衡系统。

3.2 ：在进样前运行 1~2 次空白梯度。方法：按 A 泵的 [run] 键， prog.r

un 指示灯亮，梯度程序运行；程序停止时， prog.run 指示灯灭。

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七、 七、 进样 进样1 、进样前按检测器 [zero] 键调零，按软件中 [零点校

正 ] 按钮校正基线零点，再按一下 [ 查看基线 ] 按钮

使其弹起。

2 、用试样溶液清洗注射器，并排除气泡后抽取适量即可以进样了。

3 、含量测定的对照溶液和样品供试溶液每份至少注样 2

次 。

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八、 八、 谱图的判断 谱图的判断 及结果计算及结果计算

系统适用性实验：三个重要指标

①分离度（加强）：一般应≥ 1.5 。

②重复性：两次谱图的峰面积应相差不的过 1% 。

③理论塔板数：应≥规定的理论塔板数目。

④拖尾因子： 0.95＜ T＜ 1.05

⑤保留时间：对照与样品的主成分保留时间应大致一致。

⑥RSD ： ＜ 3%

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八、 八、 谱图的判断 及结果计算谱图的判断 及结果计算 1 、内标法 用含对照品和内标物质的对照溶液所得色谱峰响应值，

按下式算出校正因子（ f ）：

其中 As 和 Ar 分别为内标物质和对照品的峰面积或峰高， ms 和mr 分别为加入内标物质和对照品的量。

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八、 八、 谱图的判断 及结果计算谱图的判断 及结果计算 2 、外标法：

① 用含对照品的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式计算比值（ r

）： r=mr/Ar （其中 mr 和 Ar 分别为对照品的量和相应的峰面积或峰高。 ）

②再根据供试品溶液的色谱峰响应值，计算供试品中被测成分的含量（ mi ）： mi=r×Ai （其中 Ai 为供试品溶液中被测成分的峰面积或峰高）。

③必要时，再根据稀释倍数、取样量和标示量折算成标示量的百分含量，或根据稀释倍数、取样量折算成百分含量。

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九、 九、 清洗管路及进样口清洗管路及进样口1 、分析完毕后，先关检测器和数据处理机，再用经滤过

和脱气的适当溶剂清洗色谱系统，正相柱一般用正已烷，反相柱如使用过含盐流动相，则先用水，然后用甲醇 -水冲洗，冲洗前先按（ 4.1.1~4.1.2 ）操作，再用分析流速冲洗，各种冲洗剂一般冲洗 15~30 分钟，特殊情况应延长冲洗时间。

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九、 九、 清洗管路及进样口清洗管路及进样口

2 、 冲洗完毕后，逐步降低流速至 0 ，关泵，进样器也应用

相应溶剂冲洗，可使用进样阀所附专用冲洗接头。

3 、关断电源，作好使用登记，内容包括日期、检品、色谱

柱、流动相、柱压，使用小时数，仪器完好状态等。

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【特殊情况】：谱流路系统，从泵、进样器、色谱柱、

到检测器通池，在分析完毕后，均应按（ 5.1 ）充分冲

洗，特别是用过含盐流动相的，更应注意先用水，再

用甲醇 -水，充分冲洗。

九、 九、 清洗管路及进样口清洗管路及进样口

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谢谢大家！

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第二节 岛津 LC-10AT 型 HPLC

注意事项

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一、 流动相一、 流动相1 、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；

2 、水相流动相需经常更换（一般不超过 2天），防止长菌变质；

3 、使用双泵时， A 、 B 、 C 、 D 四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则 A 、 D （进液口位于混合器下方）放置含盐流动相， B 、 C （进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相；

A 、 B 、 C 、 D 四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存放水相流动相。

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二、样品二、样品1 、采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；

2 、用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；

若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量

用流动相制备样品液； 3 、手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的 3～ 5倍；

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三、色谱柱三、色谱柱

1 、 使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如 pH 值范围、流动相类型等；

2 、 使用符合要求的流动相； 3 、 使用保护柱；

4 、 如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如 5％甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。

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三、 色谱柱三、 色谱柱

5 、 色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存；

6 、 不要高压冲洗柱子； 7 、 不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱； 使用过程中注意轻拿轻放。

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四、操作过程四、操作过程

1 、 开机操作：

（ 1 ）、打开电源，用 Harb 相连接时，注意 Harb 电源，打开计算机，打开 Bootp Server （一般启动时已打开）；

（ 2 ）、自上而下打开个组件电源， Bootp Server里显示有信号时（有六行字符），打开工作站（先打开 On line ）；

（ 3 ）、打开冲洗泵头的 10％异丙醇溶液的开关（需用针捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量为准；

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四、 操作过程四、 操作过程

（ 4 ）、注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的

容积低于最低限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积，

及时加液；

（ 5 ）、使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正确处理各种突发事件。

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四、 操作过程四、 操作过程2 、 先以所用流动相冲洗系统一定时间（如所用流动相为含盐流动

相，必须先用水冲洗 20 分钟以上再换上含盐流动相），正式进样

分析前 30min 左右开启 D 灯或W 灯，以延长灯的使用寿命；

3 、 建立色谱操作方法，注意保存为自己命名的 Method ，勿覆盖

或删除他人的方法及实验结果；

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四、 操作过程四、 操作过程4 、 使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用

洗针液洗净进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒 3遍以上，并排除针筒中的气泡；

5 、 溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用 5%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤；

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四、操作过程四、操作过程

6 、 实验结束后，一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整个管路 30 分钟以上，再用甲醇冲洗。冲洗过程中关闭 D 灯、 W 灯；

7 、 关机时，先关闭泵、检测器等，再关闭工作站，然后关机，最后自下而上关闭色谱仪各组件，关闭洗泵溶液的开关；

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四、操作过程四、操作过程

8 、 使用者须认真履行仪器使用登记制度，出现问题及时向老师报告，不要擅自拆卸仪器。未经操作培训，不得擅自使用仪器。

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自己总结的自己总结的 1212 条条注意事项注意事项

以下 12条注意事项是自己在安装和使用液相色谱

仪中的经验得出的，可能存在某些片面性，如有不当

之处请多提宝贵建议。

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1 、流动相必须用 HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗

粒性杂质和其他物质 ( 使用 0.45um或更细的膜过滤 ) 。

2 、流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后

使用。

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3 、不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。

4 、使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然 后用甲醇 (或甲醇水溶液 ) 冲洗 40 分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆 外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗 20ml 以上。

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5. 长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不

能用纯水保存柱子，而应该用有机相 ( 如甲醇等 ) ，因为纯

水易长霉。

6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂 ( 如甲醇 ) 等清洗进

样器。

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7.C18 柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。

8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀

检查 并清洗。

清洗方法：①以异丙醇作溶剂冲洗；②放在异丙醇中间用超声波清 洗；③用 10％稀硝酸清洗。

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9. 气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽

量避免产生气泡。

10. 如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在

输液前要进行流动相 的清洗。

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11. 要注意柱子的 PH 值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性

样品。

12. 更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边清洗，然后

插入新的 流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下

。

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谢谢大家！

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第三节 高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法

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一、 一、 保留时间变化保留时间变化

1.柱温变化

2.等度与梯度间未能充分平衡

3.缓冲液容量不够

4.柱污染

5.柱内条件变化

6.柱快达到寿命

1.柱恒温

2.至少用 10倍柱体积的流动相平衡

柱

3.用 >25mmol/L的缓冲液

4.每天冲洗柱

5. 稳定进样条件 ,调节流动相

6.采用保护柱

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二、 二、 保留时间缩短保留时间缩短

1.流速增加

2.样品超载

3.键合相流失

4.流动相组成变化

5.温度增加

1.检查泵 ,重新设定流速

2.降低样品量

3.流动相 PH值保持在 3

~7.5检查柱的方向

4. 防止流动相蒸发或沉

淀

5.柱恒温

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三、 三、 保留时间延长保留时间延长 1.流速下降

2.硅胶柱上活性点变化

3.键合相流失

4.流动相组成变化

5.温度降低

1. 管路泄漏 , 更换泵密封圈 ,排除泵内气泡

2. 用流动相改性剂 , 如加三乙胺 , 或采用碱至钝化柱

3.流动相 PH值保持在 3~7.5检查柱的方向

4.防止流动相蒸发或沉淀

5.柱恒温

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四四 、 、 出现肩峰或分叉出现肩峰或分叉

1.样品体积过大

2.样品溶剂过强

3.柱塌陷或形成短路通道

4.柱内烧结不锈钢失效

5.进样器损坏

1.用流动相配样 , 总的样品体积小于第一峰的 15%

2.采用较弱的样品溶剂

3.更换色谱柱 ,采用较弱腐蚀性条件

4.更换烧结不锈钢 ,加在线过滤器 ,过滤样品

5.更换进样器转子

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五、 五、 鬼峰鬼峰 1.进样阀残余峰

2.样品中未知物3.柱未平衡

4.三氟乙酸 (TFA) 氧化 ( 肽谱 )5.水污染 (反相 )

1.每次用后用强溶剂清洗阀 , 改进阀和样品的清洗

2.处理样品3.重新平衡柱 ,用流动相作样品溶剂 ( 尤其

是离子对色谱 )4.每天新配 ,用抗氧化剂5.通过变化平衡时间检查水质量，用 HPLC级的水

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六、 基线噪声六、 基线噪声 1.气泡 (尖锐峰 )

2.污染 (随机噪声 )

3.检测器灯连续噪声4.电干扰(偶然噪声 )

5.检测器中有气泡

1.流动相脱气 ,加柱后背压2.清洗柱 ,净化样品 ,用 HPLC级试剂

3.更换氘灯4. 采用稳压电源 , 检查干扰

的来源 (如水浴等 )5.流动相脱气 ,加柱后背压

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七、 七、 峰拖尾峰拖尾 1.柱超载2.峰干扰3.硅羟基作用4.柱内烧结不锈钢失效5.柱塌陷或形成短路通道6. 死体积或柱外体积过大7.柱效下降

1.降低样品量 , 增加柱直径采用较高容量的固定相2.清洁样品 ,调整流动相3.加三乙胺 ,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相 PH值 , 钝化样品

4.更换烧结不锈钢 ,加在线过滤器 ,过滤样品5.更换色谱柱 ,采用较弱腐蚀性条件6.连接点降至最低 ,对所有连接点作合适调整 ,尽可

能采用细内径的连接管7.用较低腐蚀条件 ,更换柱 ,采用保护柱

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八、八、峰展宽峰展宽

1.进样体积过大

2.在进样阀中造成峰扩展

3.数据系统采样速率太慢4.检测器时间常数过大

1. 用流动相配样 , 总的样品体积小于第一峰的 15%

2.进样前后排出气泡以降低扩散3.设定速率应是每峰大于 10点4.设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的 10%

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八、八、峰展宽峰展宽

5.流动相粘度过高

6.检测池体积过大

7.保留时间过长8.柱外体积过大9.样品过载

5. 增加柱温 ,采用低粘度流动相6.用小体积池 ,卸下热交换器7.等度洗脱时增加溶剂含量也可用

梯度洗脱8.将连接管径和连接管长度降至最小

9.进小浓度小体积样品

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谢

谢！