下水試料中の女性ホルモン測定法の課題

－ LC/MS/MS と ELISA の比較から－

建設省土木研究所○ 高橋明宏、小森行也、矢古宇靖子、　岡安祐司、斉藤正義、東谷忠、田中宏明

背景・目的• 17β17β ｴｽﾄﾗｼﾞｵｰﾙｴｽﾄﾗｼﾞｵｰﾙの内分泌攪乱作用大作用大• 下水下水の内分泌攪乱作用にしめる割合大割合大• 実態調査実態調査（下水道）はＥＬＩＳＡ法ＥＬＩＳＡ法を使用• ＥＬＩＳＡ法は測定簡易 簡易 bubu ｔ 正・負の誤差ｔ 正・負の誤差

↓

•LC/MS/MSLC/MS/MS を用いた測定法の検討• ＥＬＩＳＡ法の測定値を確認確認

LC/MS/MS 法の検討•GC/MS ： 誘導体化が必要　　　　　　 　抱合体の分解必要　　　　　　　 形態別の把握が困難

•LC/MS/MS ： 誘導体化が不要不要　　　　　　　 抱合体の分解不要分解不要　　　　　　　 形態別形態別の把握が可能• 使用装置 ： FINNIGAN 　 TSQ7000

条件検討①　 化法と特定ｲｵﾝ ｲｵﾝAP-ESI AP-CI

MW 特定ｲｵﾝPosi Nega Posi Nega

17β E2 272 [M-H]－ × 271 × 271

EE2 296 [M-H]－ × 295 × 295

E2-Ac 314 [M-H]－ × 313 × 313

E2-3Sul(Na) 374 [M-Na]－ × 351 × ×

Estrone 270 [M-H]－ － 269 － －Estriol 288 [M-H]－ － 287 － －

条件検討②　 MS/MS 測定条件Collision EnergyとDaughter Ions

親ｲｵﾝ20eV 30eV 40eV 50eV

17β E2 271 × × 145,183 145,183

EE2 295 × × 145 145,159

E2-Ac 313 × 253 253 145

E2-3Sul(Na) 351 × 271 271 271

Estrone 269 × (145) 145 145

Estriol 287 × × 145,171 145,171強度が減少、ｲｵﾝ BG が低下、 S/N 比が 10 倍以上

向上

• 装 置： TSQ7000 、 HP1100• ：ｶﾗﾑ HP Zorbax Eclops XDB-C18 、 2.1×150mm• 移動相：ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ // 水水（ 60:40 ）、 0.2mL/min• 注入量： 10μL• 化 ：ｲｵﾝ AP-ESIAP-ESI NegativeNegative 、 Collision Energy 　　　　　　 40eV 、 Argon 2.2-2.3 mTorr 　　　　　• 測定質量数： 271271( Parent ) 、 145( Daughter )

測定条件　 LC/MS/MS 法

供試試料　（下水試料）下水処理方式 処理水量

Ａ 標準活性汚泥法 172千ｍ３/ 日

Ｂ 標準活性汚泥法 152千ｍ３/ 日

Ｃ 標準活性汚泥法＋砂ろ過＋礫間接触酸化

49千ｍ３/ 日

Ｄ 循環式硝化脱窒法 92千ｍ３/ 日

Ｅ 凝集剤添加循環変法＋砂ろ過

118千ｍ３/ 日１１年７，８，９月、スポット、流入と放流

試料調整　 LC/MS/MS （抽出）

Ｃ１８固相抽出

溶出（ EtOAc/MeOHEtOAc/MeOH ＝ 1/5 ）乾固

抽出物

超音波抽出（アセトン）

ろ液

SSろ過ろ過

試料 1000ml

未精製試料の測定　　

17βEstradiol

17βEstradiol-d3

Ethnyl Estradiol

Standard Influent

m/z=271

m/z=273

m/z=295

4.6×150mm 、 MeCN/H2O=6/4 、 0.4ml/min

精製方法　　 TLC 法

展開層 最下層 下層 中間層 上層 最上層

Ｒｆ値 0.0-0.2 0.2-0.4 0.4-0.6 0.6-0.8 0.8-1.0

17β E2 0 0 100 0 0

EE2 0 0 100 0 0

E2-Ac 0.4 0.6 0.2 98.8 0

E2-3Sul(Na) 85.8 7.2 4.1 1.6 1.31. 3

2.

• Silica Gel 60 (MERCK) 、 CHCl3/ ｱｾﾄﾝ =9/1•回収率は 6060～～ 7070％• 抱合体抱合体の精製は不十分不十分

精製した試料の測定　（ TLC ）

17βEstradiol

17βEstradiol-d3

Ethnyl Estradiol

m/z=271、145

m/z=275、 145

m/z=295、 145

精製後 精製前

精製方法　　抽出法・ 法ｶﾗﾑ• 抽出法 ： 親水性成分の除去　　 EtOAc 、 EtOEt 、 n-Hx に溶解、食塩水で抽出　　 n-Hxn-Hx／食塩水／食塩水の組み合わせが良好

• 法 ： 疎水性成分の除去ｶﾗﾑ　　 、ｼﾘｶｹﾞﾙ ｼﾘｶｹﾞﾙDEA 、 を比較ﾌﾛﾘｼﾞﾙ　　ﾌﾛﾘｼﾞﾙｶﾗﾑﾌﾛﾘｼﾞﾙｶﾗﾑにより良好に精製

試料調整　 LC/MS/MS （精製）抽出物

Rf 0.35～ 0.55 ・ MeOH

HexHex ：塩水：塩水抽出（ボウ硝脱水）Hex/CH2Cl2＝ 1/1

ﾌﾛﾘｼﾞﾙﾌﾛﾘｼﾞﾙｶｰﾄﾘｯｼﾞEtOAc/ CH2Cl2 ＝ 1/19

ｼﾘｶｹﾞﾙｼﾘｶｹﾞﾙ TLCTLC （ CHCl3/ ＝ｱｾﾄﾝ 9/1 ）

測定試料（ MeOH ・ 1000倍）

測定の精度　　標準物質• 2～18ng/L の標準混合溶液• IS ： 17βE2-d3 　　　　　　　　　　　　　　＊ ng/L

定量性(検量線) 標準偏差(n=5)

RRF R2 2ng/ L 4ng/ L

検出 下限*

17β E2 1.024 0.996 0.09 0.15 0.3

EE2 0.715 0.989 0.13 0.18 0.4

E2-Ac 3.944 0.999 0.16 0.17 0.5

E2-3Sul(Na) 22.346 0.995 0.24 0.22 0.71. 3

2. 標準偏差の３倍を検出下限とした、

添加回収試験　下水試料

試料添加濃度

μ g/ L測定値μ g/ L

回収率％

精製方法

沈殿下水 無添加 0.0134 － Hx-FL0.03 － － TLC0.05 0.0565 80.3 Hx-FL0.05 0.0481 63.4 FL-TLC0.08 0.0659 65.5 Hx-FL-TLC

放流水 無添加 (<0.001) － TLC0.03 0.0229 76.9 TLC

実試料の測定結果　 LC/MS/MS法

流入水 μ（ ｇ/ L） 放流水 μ（ ｇ/ L）処理場

７月 ８月 ９月 ７月 ８月 ９月

Ａ 0.011 0.010 0.009 <0.001 <0.001 <0.001

Ｂ 0.011 0.012 0.007 <0.001 <0.001 <0.001

Ｃ 0.014 0.008 0.011 <0.001 0.001 <0.001

Ｄ 0.015 0.007 0.013 <0.001 <0.001 <0.001

Ｅ 0.007 0.007 0.011 <0.001 <0.001 0.001

試料調整　　 ELISA 法

Ｃ１８固相抽出（ MeOHMeOH溶出）

乾固

測定試料（ 1000010000 倍倍・ DDMSOMSO ）

超音波抽出（ MeOMeOHH ）

ろ液

SS

ろ過ろ過

試料 1000ml

①希釈試料（ 20％ DMSO 溶液）②抗体結合マイクロプレート　　　↓←酵素標識 E2 、試料、 E2抗体③抗原抗体反応（室温、 22時間時間）　　　↓←洗浄、発色試薬④発色反応（室温、暗所、 3030 分分）　　　↓←反応停止薬⑤測定（プレートリーダープレートリーダー、 450nm ）

測定方法　　ＥＬＩＳＡ法

実試料の測定結果　ＥＬＩＳＡ

流入水 μ（ ｇ/ L） 放流水 μ（ ｇ/ L）処理場

７月 ８月 ９月 ７月 ８月 ９月

Ａ 0.058 0.036 0.062 0.020 0.019 0.025

Ｂ 0.057 0.046 0.058 0.036 0.017 0.008

Ｃ 0.075 0.047 0.022 0.015 0.010 0.008

Ｄ 0.057 0.030 0.028 0.024 0.022 0.013

Ｅ 0.031 0.036 0.041 0.006 0.006 0.004

　 ELISA と LC/MS/MS の比較（流入）

0

5

10

15

20

0 20 40 60 80

ELISA ng/ L法（ ）

LC/M

S/M

Sng

/L法

（）

0

5

10

15

20

0 20 40 60 80

(ng/ L)ＥＬＩＳＡ法

LC/M

S/M

Sng

/L法

（）

ABCDE

　 ELISA と LC/MS/MS の比較（流入）

まとめ•LC/MS/MSLC/MS/MS 法の測定方法を検討法の測定方法を検討•17βE2 の誘導体誘導体、抱合体抱合体も検出可検出可•試料の精製精製が必要 ( 検出下限 0.3ng/L0.3ng/L)•５処理場の流入と放流を３回測定•ＥＬＩＳＡ、 LC/MS/MS を比較すると　　流入は 2.02.0～～ 8.38.3 倍倍（平均平均 4.74.7 倍倍）　　放流は 1ppt1ppt 以下以下（ LC/MS/MS ）

今後の予定•LC/MS/MS 法の前処理法前処理法の検討

•抱合体の測定検討

•ELISA 法の測定値が高い要因高い要因の検討

•ELISA 法の前処理法前処理法の検討

•生物影響生物影響との関係把握