1

Liver ViraStripe® Диагностический набор для определения IgGИммунодиагностический метод для качественного обнаружения IgG-специфических антител против антигенов печени в человеческойсыворотке.Диагностический набор «Liver ViraStripe® Test Kit IgG» содержит специфические для печени антигены: пируватдегидрогеназамитохондриального комплекса М2 (АМА-М2), печёночно-почечные микросомы (LKM-1), цитозольный антиген печени тип1 (LC1) ирастворимый печеночный антиген (SLA).Каждая полоска имеет встроенную систему контроля, включающую контроль сыворотки, контрольконьюгата и пороговый контроль.

Liver ViraStripe® Диагностическийнабор для определения IgG

Набор из 50 полосок Номер заказа V-LISGOK

Исследуемый образец 20 мкл сывороткиПродолжительность теста 90 минутХранение/Стабильность около 12 месяцев при 2-8°С

Содержание диагностического набора50 полосок Диагностические полоски, нитроцеллюлозные полоски с контрольной системой и специфическими для печени

антигенами в аналитической секции; код полосок: LI, полоски пронумерованы от 1 до 509 мл Конъюгат щелочной фосфатазы против специфических IgG человека, 10-кратный концентрат100 мл Буфер для разведения/промывки, 10-кратный концентрат1 пакетик Порошок для разведения/промывки, 5 грамм90 мл Раствор Хромоген/субстрата, готовый к использованию1 штука Инструкция по применению диагностического набора Liver ViraStripe® Test Kit IgG2 штуки Протокол оценки анализа IgG с изображением положительной контрольной полоски (PC LI)

Буфер для разведения/промывки, Порошок для разведения/промывки и Раствор Хромоген/субстрата взаимозаменяемы междуразличными методами «Вира-Страйп» и «Вира-Блот».Дополнительно отдельно поставляются330 мг IgG положительный контроль, сыворотка человеческая, готовая к использованию Номер заказа

V-LISGPK330 мг IgG отрицательный контроль, сыворотка человеческая, готовая к использованию Номер заказа

V-LISGNK9 мл Конъюгат щелочной фосфатазы с антителами против IgМ человека, 10-кратный концентрат,

жидкийНомер заказа V-UVNMKI

9 мл Конъюгат щелочной фосфатазы с антителами против IgА человека, 10-кратный концентрат,жидкий

Хранение и срок хранения реактивовПолоски антигенные:В закрытой упаковке стабильны до истечения срока хранения при2-8°С. Закрыть упаковку с неиспользованными полоскаминемедленно.

Буфер для промывки/разведения:Концентрат и порошок: стабилен до окончания срока хранения при 2-8°С.Рабочий раствор буфера: хранится при 2-8°С около 2-х недель. При болеедлительном хранении раствор разделить на порции и заморозить при -20°С

Коньюгат:10-кратный концентрат: стабилен при хранении при 2-8°С доокончания срока хранения.Рабочий раствор: Должен использоваться немедленно.

Раствор хромоген/субстрата:Стабилен при 2-8°С согласно указанному сроку хранения. Беречь отвоздействия света!

Подготовка реактивов и проб

Перед применением реактивы следует довести до комнатнойтемпературы (20-25°С).

Антигенные полоскиНужные полоски осторожно взять пинцетом на этикетке,разъединить на канавке и положить в подготовленные кюветы. Некасаться пальцами. Не используемые полоски немедленноположить в упаковку и хранить при 2-8°С.

Рабочий раствор буфера для разведения/промывки: Развести10-кратный концентрат буфера дистиллированной водой впропорции 1:10 (100 мл концентрата + 900 мл дистиллированнойводы). Затем добавить необходимое количество порошка дляразведения/промывки и размешивать до полного растворения.Поместить буфер для разведения/промывки на магнитнуюмешалку на10-15 минут, рН 7,5 ± 0,1.

Рабочий раствор конъюгата:Разбавить необходимое количество 10-кратного концентрата коньюгатасогласно таблице 1 в течение первой процедуры промывки (пункт 7процедуры проведения диагностического теста).

Остальные реактивы: готовы к применению

Пробы пациента:В каждом тесте используется 20 мкл неразбавленной сывороткипациента.

Дополнительно доступные контроли:В каждом тесте используется по 100 мкл положительного иотрицательного теста.

2

Таблица 1: приготовление раствора коньюгатыКоличествополосок

Раствор пробпромывочногораствора

Концентратконьюгаты

Конечныйобъём

1 1,35 мл + 0,15 мл 1,5 мл2 2,70 мл + 0,30 мл 3,0 мл3 4,05 мл + 0,45 мл 4,5 мл4 5,40 мл + 0,60 мл 6,0 мл5 6,75 мл + 0,75 мл 7,5 мл6 8,10 мл + 0,90 мл 9,0 мл7 9,45 мл + 1,05 мл 10,5 мл8 10,80 мл + 1,20 мл 12,0 мл9 12,15 мл + 1,35 мл 13,5 мл10 13,50 мл + 1,50 мл 15,0 мл11 14,85 мл + 1,65 мл 16,5 мл12 16,20 мл + 1,80 мл 18,0 мл13 17,55 мл + 1,95 мл 19,5 мл14 18,90 мл + 2,10 мл 21,0 мл15 20,25 мл + 2,25 мл 22,5 мл16 21,60 мл + 2,40 мл 24,0 мл17 22,95 мл + 2,55 мл 25,5 мл18 24,30 мл + 2,70 мл 27,0 мл19 25,65 мл + 2,85 мл 28,5 мл20 27,00 мл + 3,00 мл 30,0 мл21 28,35 мл + 3,15 мл 31,5 мл22 29,70 мл + 3,30 мл 33,0 мл23 31,05 мл + 3,45 мл 34,5 мл24 32,40 мл + 3,60 мл 36,0 мл25 33,75 мл + 3,75 мл 37,5 мл26 35,10 мл + 3,90 мл 39,0 мл27 36,45 мл + 4,05 мл 40,5 мл28 37,80 мл + 4,20 мл 42,0 мл29 39,15 мл + 4,35 мл 43,5 мл30 40,50 мл + 4,50 мл 45,0 мл31 41,85 мл + 4,65 мл 46,5 мл32 43,20 мл + 4,80 мл 48,0 мл33 44,55 мл + 4,95 мл 49,5 мл34 45,90 мл + 5,10 мл 51,0 мл35 47,25 мл + 5,25 мл 52,5 мл36 48,60 мл + 5,40 мл 54,0 мл37 49,95 мл + 5,55 мл 55,5 мл38 51,30 мл + 5,70 мл 57,0 мл39 52,65 мл + 5,85 мл 58,5 мл40 54,00 мл + 6,00 мл 60,0 мл41 55,35 мл + 6,15 мл 61,5 мл42 56,70 мл + 6,30 мл 63,0 мл43 58,05 мл + 6,45 мл 64,5 мл44 59,40 мл + 6,60 мл 66,0 мл45 60,75 мл + 6,75 мл 67,5 мл46 62,10 мл + 6,90 мл 69,0 мл47 63,45 мл + 7,05 мл 70,5 мл48 64,80 мл + 7,20 мл 72,0 мл49 66,15 мл + 7,35 мл 73,5 мл50 67,50 мл + 7,50 мл 75,0 мл

Указания по работе:1. промыть инкубационные кюветы буфером для

разведения/промывкиНадписи на кюветах должны наноситьсяводостойким маркером. Промывка удаляет частицы загрязнения.

2. вложить в каждый канал по 1 антигенной полоске На каждую пробу пациента или контрольную сыворотку взятьпинцетом по одной полоске, осторожно разъединить с этикеткойи положить в кювету. Сторона с зелёной разъединительнойлинией и номером должна указывать вверх – на этой сторонесвязан антиген.

3. добавить по1,5 мл буфера, инкубировать 5 минут прикомнатной температуре, на платформе шейкера

Убедиться, что полоски полностью покрыты. Использоватьшейкер с частотой колебаний 40 в минуту, избегать перелива. Несливать буфер.

4. добавить пипеткой по 20 мкл пробы пациента или по100 мкл каждого из контролей

Нанести пипеткой сыворотку прямо на номер антигеннойполоски. Следить, чтобы мальтомобиль работал или чтобыкювета качалась после каждогодобавления сыворотки.

5. инкубировать на шейкере 30 минут при комнатнойтемпературе

6. слить жидкость Сбить всю оставшуюся жидкость на фильтрующую бумагу. Присливе полоски держатся на дне кюветы.

7. Промывка: трижды по 5 минутДобавить по 1,5 мл промывочного буфера, инкубировать5 минут, слить жидкость

Промывка производится в шейкере. Во время промываприготовить рабочий раствор коньюгата, см. таблицу 1. Остатокжидкости слить на фильтрующую бумагу.

3

Принцип тестаС помощью набора «Лебер Вира-Страйп» можно обнаружить специфические для печени антитела в человеческой сыворотке.Специфические антитела во время инкубации сыворотки связываются с фиксированный на диагностической полоске антигеном. Во время реакцииконьюгат щелочной фосфатазы связывается с комплексом антиген-антитело. Щелочная фосфатаза подвергает реакции хромоген/субстрат, врезультате чего комплекс антител и антигенов на полоске окрашивается в лиловый цвет.Промывка между инкубацией сыворотки, коньюгата и хромоген/субстрата удаляет несвязанные реактивы.

Иммунологическая проба с встроенной системой контроляЗелёная разделительная черта делит полоску на контрольный и аналитический участки. На контрольном участке находятся контроль сыворотки, тривида контроля коньюгата (иммуноглобулин G, A, M) и пороговый контроль. Аналитический участок содержит специфические для печени антигены.Анализ

1. Подготовить протокол анализа Внести данные в протокол анализа. Готовые полоски пациентоввклеить в протокол анализа: положить зелёную разделительную линиюполоски пациента положить точно на напечатанную разделительнуюлинию и приклеить полоску

2. Действительность теста Тест считается действительным, если полосы функциональногоконтроля, конъюгат контроля и порогового контроля становятся четковидимыми на каждой полоске. Если нет реакции по крайней мереодного из этих контролей, тест недействителен и должен бытьпроведен повторно при точном соблюдении инструкций.Не оценивайте не отвечающие требованиям методики полоски.

3. Оценка проб пациентов Протокол анализа теста содержит напечатанную положительнуюконтрольную полосу (помечена как PC LI). Зелёная разделительнаялиния и разделительная контрольной полосы должны находиться точнодруг под другом. Оцените положение полос на полосках с пробамипациентов и занесите данные в протокол.Не определяемые полосы не должны учитываться.

4. Оценка полос с использованием пороговогоконтороля

В соответствии с директивами качества в лаборатории требуетсяпроводить отсечку каждого набора для теста (13). Полоса пороговогоконтроля встроена в контрольную секцию каждой полоски«ЛеберВира-Страйп». Интенсивность полосы контроля определяет границудля оценки результатов тестанта.Полоса считается четкой, если ее интенсивность равна или вышеинтенсивности полосы порогового контроля и помечается Х впротоколе анализа.Полоса считается нечеткой, если ее интенсивность меньшеинтенсивности полосы порогового контроля и помечается (Х) впротоколе анализа.

Оценка образцов пациентаПолосы могут быть оценены в качестве подтверждения симптомов заболевания. Окончательный клинический диагноз должен ставиться с учётоманамнеза, клинической картины и лабораторных данных. Специфическими для печени считаются следующие антигены: AMA-M2,LC1, LKM-1,SLA. Могут появляться другие, неохарактеризованные полосы, однако они не анализируютсяЛебер Вира-Страйп (иммуноглобулин G)

Появившиеся полосы/kD результат интерпретацияПолос нет отрицательно Специфические антитела на антигены печени не

обнаруженыОдна или много нечетких полос сомнительный Обнаружен низкий титр антител против

соответствующих антигенов. В случае клиническогоподозрения на аутоиммунное заболевание печенинеобходимо провести дополнительный тест через 2-3недели.

Одна или много четких полос положительный Обнаружены антитела к соответствующим антигенам.Определение типа аутоиммунного заболевания печеникоррелирует с соответствующими антителами

8. добавить пипеткой по 1,5 мл свежего раствораконьюгата

Следить, чтобы антигенные полоски полностью были покрытырабочим раствором коньюгата.

9. инкубировать 15 минут на шейкере при комнатнойтемпературе

10. слить коньюгат Слить всю оставшуюся жидкость на фильтрующую бумагу.11. промыть трижды как в пункте 712. добавить по 1,5 мл дистиллированной воды13. инкубировать 1 минуту на мальтомобиле при комнатной

температуре14. слить жидкость Сбить всю оставшуюся жидкость на фильтрующую бумагу.15. добавить пипеткой по 1,5 мл раствора хромоген/субстрата Следить, чтобы антигенные полоски полностью были покрыты.16. инкубировать от 5 до 15 минут на шейкере при комнатной

температуреКак только чётко проявляется отсечка контрольной полоски,следует остановить реакцию. Внимание: слишком долгаяинкубация вызывает фоновую окраску.Отсечка контрольной полоски в контрольной головке

17. остановитьреакцию: слить жидкость Сбить всю оставшуюся жидкость на фильтрующую бумагу.18. промыть трижды дистиллированной водой по 1,5

млБез промежуточной инкубации

19. высушить полоски для проведения анализа Постучать по кювете, положить влажные антигенные полоски начистую фильтрующую бумагу или на впитывающую, неотбеленную бумагу и высушить их на воздухе.

4

Анализ Вира-страйп (иммуноглобулин G

Другие аутоантитела при аутоиммунном гепатите с диагностической релевантностью:ANA: антитела на нуклеопротеин. Эти антитела характерны для аутоиммунного гепатита типа 1 и встречаются в 30% случаев. Аутоиммунный гепатиттипа 1 встречается у женщин 10-20 лет (ювенильная форма) и у женщин 60-70 лет после менопаузы (9). ANA очень хорошо обнаруживается в иммуннойфлуоресценции, обладает однородной структурой.SMA 41kD Actin: G-иммуноглобулиновые антитела на гладкую мускулатуру типа актин наблюдаются примерно в 30% случаев при аутоиммунномгепатите типа 1. Антитела SMA легко обнаруживаются в иммунной флуоресценции на разрезе ткани желудка (12).УказаниеДанные о повышенной чувствительности и специфических свойствах Вы можете получить по запросу.Меры предосторожности:

1. Все компоненты человеческой сыворотки были проверены на антитела ВИЧ1, ВИЧ2, антигены гепатита В. Проверка дала отрицательныйрезультат. Тем не менее, все компоненты человеческого организма, а также пробы пациента, следует рассматривать как заражённые исоответственно обращаться с ними.

2. Не вводить в рот.3. При работе пользоваться одноразовыми перчатками.4. На рабочем месте не есть, не пить, не курить.5. Коньюгаты содержат 0,1% Sodium Azid, контрольные участки и промывочный буфер 0,02% тимерозала в качестве консерванта. Внимание:

вредно для здоровья. При попадании на кожу или в глаза тщательно промыть большим количеством воды. Ядовито при проглатывании! (см.листок безопасности).

6. Хромоген содержит BCIP и NBT. Избегать контакта с кожей и слизистой оболочкой. При попадании в глаза немедленно промыть большимколичеством воды.

7. Пробы и вероятно заражённые материалы, а также жидкие заражённые отходы дезинфицируются согласно общепринятым правилам,например, минимум 15-минутной обработкой в автоклаве при влажной жаре. Для утилизации жидких отходов последние можно смешать сгипохлоритом натрия в такой пропорции, чтобы получившаяся смесь содержала 1% гипохлорита натрия. Для окончательной дезинфекции датьпостоять 30 минут.

Литература:1. Burstyn, D.G., L.J. Baraff, M.S. Peppler, R.D. Leake, J. St. Geme, Младший, и C.R. Manclark. 1983. Серологическая реакция на нитевидныйгемагглютинин и лимфоцитарный лейкоцитоз, стимулирующий токсин Bordetella p.. Infect. Immun. 41:1150-1156. 2. Freidman, R.L. 1988. Pertussis:заболевание и новые диагностические методы. Clin. Microbiol. Rev. 1:365-376. 3. Gilchrist, M.J.R., 1990. Лабораторный диагноз pertussis. Clin. Microbiol.Newslet. 12:49-53. 4. Gilchrist, M.J.R., 1991. Bordetella p. 471-477. В A. Balows, W.J. Hausler, младший, K.L. Herrnann, H.D. Isenberg, и H.J. Shadomy(редактор)., Руководство для клинической микробиологии, 5-ый редакция, Американское Общество Микробиологии, Вашингтон, округ Колумбия 5.Cherry, J.D. 1984. Эпидемиология pertussis и иммунизации pertussis в Великобритании и США: сравнительное изучение Curr. Prob. Pediatr. 14:1-78. 6.Manclark. C.R., и J.L. Cowell. 1984. Pertussis, p. 60-106. В R. Germanier (редактор). Противобактериальные вакцины. Academic Press, Inc. Орландо, Fla. 7.Nagel, J., и E.J. Poot-Scholtens. 1983. IgA-антитело сыворотки как индикатор инфекции. J. Медиана. Microbiol. 16:417-426. 8. Olson, L.C. 1975. Pertussis.Терапия (Балтимор) 54:427-469. 9. Redd, S.C., H.S. Rumschlag, R.J. Biellik, G.N. Sanden, C.B. Reimer, и M.L.Cohen. 1988. Иммуноблот-анализ гуморальнойреакции во время инфекции Bordetella p. или иммунизацией с вакциной коклюша-столбняка-дифтерии. J. Clin. Microbiol. 26:1373-1377. 10.. Hahn, H.,Falke, D., Klein, P., 1991 Mediz. Mikrobiologie, Springer Verlag, Kap. 12, Bordetellen. 11. BRUCE D. Meade, Chrisanna M. Mink, и Charles R. Manclark, 1994,Серодиагностика Pertussis, Центр Биопрепаратов и Исследования, Фармкомитет, Bethesda, Штат Мэриленд 20892. 12. Wirsing von König, C.H., 1985,Labordiagnostik des Keuchhustens, GI Labor-Medizin 6:407-

AMA-M2 (70 kD)

У 90% пациентов образуются антитела на M2-PDH (5). Антитела AMA-M2 (70 kD) наЕ2 комплекса пируватдегидрогеназы относятся к антимитохондриальным антителамтипа М2 (АМА-М2) и весьма специфичны для первичного билиарного цирроза (РВС)(1-3).Признак первичного билиарного цирроза.Обнаружены антитела на АМА-М2. У 90% пациентов образуются антитела на M2-PDH(5). Антитела AMA-M2 (70 kD) на Е2 комплекса пируватдегидрогеназы относятся кантимитохондриальным антителам типа М2 (АМА-М2) и весьма специфичны дляпервичного билиарного цирроза (РВС) (1-3).

LC1 (60 kD) Признак аутоиммунного гепатита типа 2Обнаружены антитела на антитела типа 1 цитозола печени. У 59% пациентов саутоиммунным гепатитом типа 2 образуются антитела LC1 (8). Антитела направлены накомплекс ферментов форминимотрансферазы-циклодеаминазы. Эти антителаассоциированы с хроническим аутоиммунным гепатитом типа 2..

LKM-1 (56 kD) Признак аутоиммунного гепатита типа 2Антитела на микросомы почек и печени LKM-1 (56 kD). У 100% пациентов саутоиммунным гепатитом типа 2 обнаруживаются антитела на LKM-1 (6). АнтителаLKM-1 реагируют с комплексом цитохром Р-450 и весьма специфичны дляаутоиммунного гепатита типа 2 (1-3). Аутоиммунный гепатит типа 2 чаще всеговстречается у детей, особенно у девочек, и очень часто быстро прогрессирует (1,2).У взрослых пациентов с положительными результатами на LKM часто обнаруживаютсяантитела на вирус гепатита С (6).

SLA (52 kD) Признак аутоиммунного гепатита типа 3Антитела на растворимый антиген печени (52 kD). У 25-30% пациентовобнаруживаются антитела SLA с аутоиммунным гепатитом, часто являющиесяединственно возможнымидля обнаружения аутоантителами (6, 7).Антитела SLA весьма специфичны для аутоиммунного гепатита типа 3 (1-4).Аутоиммунный гепатит типа 3 чаще всего встречается у женщин в возрастемежду 30 и 40 годами (1).