los phd-fingers de chd5 reconocen específicamente cola n-terminal no modificada de la histona h3. ...
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Los PHD-fingers de CHD5 reconocen específicamente cola N-terminal no modificada de la histona H3.
Chip y micro array de CHD5
CHD5 es blanco directo de miR-211. La sobreexpresión de miR-211 promueve el crecimiento de las células tumorales al menos en parte por la reducción de la expresion de CHD5.
Las mutaciones somaticas adquiridas del gen CHD5 son poco frecuentes en neuro-blastoma y la inactivación se por deleción y/o metilación del promotor.
En NB, la expresión de CHD5 y la metilación de su promotor están asociados a la amplificación de MYC.
La elevada expresión de CHD5 está fuertemente correlacionada con la evolucion favorable del NB.
La reducción de la expresión de CHD5 mediada al menos por metilación de su promotor contribuye al desarrollo y la progresión del cancer de mama.
La reducida expresión de CHD5 es un marcador prognostico negativo en cancer de vesícula primario.
CHD5 es un importante supresor tumor (TSG) en Endometriosis.
En cancer de pulmón, CHD5 es un TSG silenciado por metilación del promotor.
En cancer gástrico, CHD5 es un TSG silenciado por metilación del promotor.
hsa-mir-1202 aprareció con 4 reads en 3 experimentos de deep sequencing en squamous cell.
hsa-mir-1203 aprareció con 1 read en 1 experimento de deep sequencing en cervix normal.
has-mir-1201 sería un snoRNA.
Últimos avances PCR
Detección de los miRNAs 1201, 1202 y 1203
Caracterización de los niveles de expresión de los miRNAs.
Detección del ARNm de CHD5 Detección de CHD5
Caracterización del niveles de expresión de CHD5.
Alteración de los niveles de los miRNAs
Respuesta en los cultivos celulares Respuesta en la expresión de CHD5 Especificidad de la regulación de los miRNAs
Respuesta en la expresión de genes regulados por CHD5:P53p19
Caracterización de los niveles de expresión de los miRNAs en muestras de pacientes con LLC
Caracterización del niveles de expresión de CHD5 en muestras de pacientes con LLC
PCR PCR
real time PCR real time PCR
western blot
inmunoprecipitación
transfección con oligos sintéticos sense y anti-sense
apoptósis
viabilidad
western blot
northern blot
inmunofluorescencia
western blot
luciferasa
Estrategia
Proyecto
Análisis de las semillas en el 3’UTR de CHD5
real time PCR
real time PCR
1203 sh, 1203HeLa, C- 12031201 sh, 1201 HeLa, C- 12011202 sh, Ladder, 1202HeLa, C- 1202CHD5 set1, C- set1 GAPDH sh, GAPDH HeLa, C- GAPDH
Detección de miRNAs PCR
1) ARN total , tejido neural de rata2) ARN total, Jurkat3) ARN total, Daudi4) ARN total, SKN-AS5) ARN total, SKN-BE2.FastRuler DNA Ladder High Range, Fermentas (#SM1128).
Detección ARNm CHD5
Northern-blott
PCR
Detección ARNm CHD5
PCR tiempo real
Set1 Set2 Set3 Set1 Set2 Set3
SHSet 1: Comprende sólo 1 exon
Set 2: Levanta CHD3
Set 3: El indicado
Abcam Santa Cruz
0,15 % tween 0,15 % tween
75 µg beads 75 µl beads
2 µg Anticuerpo 2 µg Anticuerpo
500 µg proteína 500 µg proteína
Detección CHD5 Inmuno-precipitación
Control
1203 AS1202 AS1201 AS
1203 S1202 S1201 S
Lipofectamina 2000
Transfecciones de los miRNAs SK-N-SH
SK-N-SH50 nM de miARNs2 ml/ml de lipofectamina
Transfecciones de los miRNAs SK-N-SH
HeLa50 nM de miARNs2 ml/ml de lipofectamina.
Transfecciones de los miRNAs HeLa
Viabilidad en HeLaCristal violeta
Viabilidad celular
Efecto de los miRNAs
Controles SenseAnti-sense
--
XX
+
+
HeLaCitometría de flujo24 horas post-transfección.
Apoptósis
Efecto de los miRNAs
X
+
+
+
-
X
Control
1203 AS1202 AS
1201 AS
M2
M3
M4 M5
Histogram Statistics
Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median Peak Ch
All 0, 255 43318 100.00 86.64 115.29 108.75 34.27 101.00 84
M1 0, 67 1123 2.59 2.25 41.47 37.23 41.72 43.00 67
M2 69, 105 22358 51.61 44.72 88.54 88.17 9.21 87.50 84
M3 106, 144 9266 21.39 18.53 123.15 122.61 9.41 122.00 106
M4 144, 178 7644 17.65 15.29 159.83 159.57 5.80 160.00 160
M5 179, 255 3088 7.13 6.18 204.65 203.55 10.53 198.00 179
File: sh2_22.9.09.001 Log Data Units: Linear Values
Sample ID: control Patient ID:
Tube: Panel:
Acquisition Date: 22-Sep-09 Gate: G1
Gated Events: 43318 Total Events: 50000
X Parameter: FL2-A (Linear)
Histogram Statistics
Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median Peak Ch
All 0, 255 10708 100.00 43.40 101.56 92.43 41.14 90.00 81
M1 0, 63 1270 11.86 5.15 41.61 38.06 37.51 44.00 62
M2 63, 100 5110 47.72 20.71 81.58 81.08 10.96 81.00 81
M3 101, 136 2134 19.93 8.65 117.56 117.08 9.07 117.00 101
M4 136, 170 1703 15.90 6.90 150.70 150.42 6.05 150.00 152
M5 171, 255 591 5.52 2.40 203.40 202.03 11.69 202.00 172
File: sh2_22.9.09.002 Log Data Units: Linear Values
Sample ID: 12O1 Patient ID:
Tube: Panel:
Acquisition Date: 22-Sep-09 Gate: G1
Gated Events: 10708 Total Events: 24675
X Parameter: FL2-A (Linear)
M2
M3
M4 M5
M2
M3
M4 M5
Histogram Statistics
Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median Peak Ch
All 0, 255 27386 100.00 65.91 109.92 102.67 35.69 98.00 82
M1 0, 65 1465 5.35 3.53 40.66 37.15 38.69 41.00 64
M2 65, 106 14473 52.85 34.83 86.97 86.50 10.44 86.00 82
M3 108, 143 5319 19.42 12.80 124.82 124.36 8.59 125.00 108
M4 143, 174 4500 16.43 10.83 156.95 156.72 5.43 156.00 159
M5 177, 255 1488 5.43 3.58 203.02 201.93 10.51 197.50 179
File: sh2_22.9.09.003 Log Data Units: Linear Values
Sample ID: 12O2 Patient ID:
Tube: Panel:
Acquisition Date: 22-Sep-09 Gate: G1
Gated Events: 27386 Total Events: 41550
X Parameter: FL2-A (Linear)
Histogram Statistics
Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median Peak Ch
All 0, 255 40264 100.00 84.38 113.38 106.15 35.12 102.00 84
M1 0, 69 2149 5.34 4.50 44.00 39.91 39.46 45.00 69
M2 69, 106 19958 49.57 41.83 88.82 88.40 9.79 88.00 84
M3 108, 147 9242 22.95 19.37 125.95 125.39 9.51 125.00 108
M4 147, 178 6319 15.69 13.24 160.52 160.30 5.25 160.00 159
M5 177, 255 2706 6.72 5.67 203.52 202.41 10.63 198.00 177
File: sh2_22.9.09.004 Log Data Units: Linear Values
Sample ID: 12O3 Patient ID:
Tube: Panel:
Acquisition Date: 22-Sep-09 Gate: G1
Gated Events: 40264 Total Events: 47715
X Parameter: FL2-A (Linear)
M2
M3
M4 M5
2.59
5.34
11.86
5.35
Series10
102030405060708090
100
% Viabilidad
1201 AS 1202 AS 1203 AS Control
Apoptósis
Efecto de los miRNAs
0
2
4
6
8
10
12
14vi 1201
CemBatspMHh1ksqlHVWWcU
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18vi 1202
35o1nuYilLMrR6A4hBlHwW 35o1nuYilLMrR6A4hBlHwW
0
2
4
6
8
10
12
14
16vi 1203
VA5Gvo53SR6QbLi7m6hgob
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45vii 1202
UeQG8KAgyJXc5Ez745OVX4
0
5
10
15
20
25
30
35vii 1201
qDMsxZOdzfy79OVHZAchTV
0
5
10
15
20
25
30
35vii 1203
l1VOM9efqfxJ9rT2Q6fFhQ
Regulación de CHD5 Luciferasa
X
+
-
12011203
12011202
X
X
-+
+
-
+ +X
0
2
4
6
8
10
12viii 1201
3XtPSheUss1CqeWTPf7uwM
0
5
10
15
20
25
30viii 1202
b00Z59TMTNynKMZClxJ9Wn
0
2
4
6
8
10
12viii 1203
VGwIDpDjIAUvjItO49vxxk
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45v0 1201
pGc0hYDIhaNNX3vghCyYk6
05
101520253035404550
v0 1202
m8mKGsIt2sRgxNCRZfgKbQ
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45v0 1203
ODhSnzYuVxrjj4ExhbZN7l
Regulación de CHD5 Luciferasa
12021202
Sin inserto
X
+
+-
-
X
++
X
-
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
vi 1201
CemBatspMHh1ksqlHVWWcU
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
vi 1202
35o1nuYilLMrR6A4hBlHwW
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
vi 1203
VA5Gvo53SR6QbLi7m6hgob
0
2
4
6
8
10
12
14vi 1201
CemBatspMHh1ksqlHVWWcU
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18vi 1202
35o1nuYilLMrR6A4hBlHwW 35o1nuYilLMrR6A4hBlHwW
0
2
4
6
8
10
12
14
16vi 1203
VA5Gvo53SR6QbLi7m6hgob
X
+
-
12011203
-+
+
+
X
+ +
X
X
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
vii 1202
UeQG8KAgyJXc5Ez745OVX4
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
vii 1201
qDMsxZOdzfy79OVHZAchTV
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
vii 1203
l1VOM9efqfxJ9rT2Q6fFhQ
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45vii 1202
UeQG8KAgyJXc5Ez745OVX4
0
5
10
15
20
25
30
35vii 1201
qDMsxZOdzfy79OVHZAchTV
0
5
10
15
20
25
30
35vii 1203
l1VOM9efqfxJ9rT2Q6fFhQ
12011202
X
X
-
+ +X
+-
X
X
--
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
viii 1201
3XtPSheUss1CqeWTPf7uwM
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
viii 1202
b00Z59TMTNynKMZClxJ9Wn
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
viii 1203
VGwIDpDjIAUvjItO49vxxk
0
2
4
6
8
10
12viii 1201
3XtPSheUss1CqeWTPf7uwM
0
5
10
15
20
25
30viii 1202
b00Z59TMTNynKMZClxJ9Wn
0
2
4
6
8
10
12viii 1203
VGwIDpDjIAUvjItO49vxxk
12021202
+
+-
X
++
X
+
+
+
X
X +
+
X
X
Regulación de CHD5 Luciferasa
Sin corrección por V0
I (1201 - 1203)
II(1202 - 1201)
III(1202 - 1202)
1201s + X X
1201as X X -1202s + - -1202as + + +1203s - X X
1203as - + +
Con corrección por V0
I (1201 - 1203)
II(1201 - 1202)
III(1202 - 1202)
1201s + - X
1201as X X X
1202s + - +1202as X X X+1203s + - +1203as X + X+
CHD5 3’UTR (nt 1017-1023) 5’ ...GCCUACCCUGCCCACCUCCGGAG...
|||||| miR-1203 3’ CUCGACGUAGGACCGAGGCCC
CHD5 3’UTR (nt 1314-1338) 5' ACGGAG-ATGGGGAGCAGGTCAGGCC 3' :||| ||| | ::||||||
miR-1201 3' AGTCTCGTACAC--AAATTAGTCCGA 5'
CHD5 3’UTR (nt 1863-1869) 5' ...GCUCUGCGGUGCCUCCUGGCAAA... ||||||
miR-1202 3' GAGGGGGUGACGUCGACCGUG
CHD5 3’UTR (nt 2087-2093) 5’...CUGUGCGCCUUCCUCUCAGGCAG...
|||||| miR-1201 3’ AGUCUCGUACACAAAUUAGUCCGA
CHD5 3’UTR (nt 3020-3026) 5‘ ...UGGGUGGGGGCCGAGGCUGGCAC... |||||||
miR-1202 3‘ GAGGGGGUGACGUCGACCGUG
CHD5 3’UTR (nt 3448-3454) 5' ...CAGGCACAGCCCCAG----GCUGGCAA... ||||| |||||||
miR-1202 3' GAGGGGGUGACGUCGACCGUG
psiCHECK-2_1/3 (i)
psiCHECK-2_1/2 (ii)
psiCHECK-2_2/2 (iii)
No RNA /irrele-vant RNA
1201s/1201as 1202s/1202as 1203s/1203as
s 100 91.9494976920988
73.5541677979908
78.8623404833017
as 94.1080640781971
29.0659788216128
121.89790931306
73.6763508009774
1030507090
110130
SH
CHD5
expr
essio
n in
relati
on to
CHD5
ex
pres
sion i
n con
trl sa
mple
cC2Dzha1xXS2TA3hd1gpd5
No RNA /irrele-vant RNA
Lipofectamine treated, no RNA control / irrele-
vant RNA
1201s/1201as 1202s/1202as 1203s/1203as
s 100 106.988013261923
101.734251466463
230.017852588625
241.596531497067
as 35.3226217801581
35.322622 117.495536852843
115.863300178526
227.339964294822
2575
125175225275
HeLa
CHD5
expr
essio
n in
relati
on to
CHD5
ex
pres
sion i
n con
trl sa
mpl
e
1S9AxOYprBZjBZiP4yR7vX
Regulación de CHD5 Western Blot
CHD5 SH CHD5 HeLa
1201s - -1201as x -1202s + -1202as + -1203s + x1203as x +
Regulación de CHD5 Inmunofluorescencia
HeLa 48 horas post-transfeccion.50 nM de los oligonucleotidos sintéticos.Rabbit anti-CHD5 (santa cruz)Anti-Rabbit Alexa fluor 488.
Regulación de CHD5 Inmunofluorescencia
SH 48 horas post-transfeccion.50 nM de los oligonucleotidos sintéticos.Rabbit anti-CHD5 (santa cruz)Anti-Rabbit Alexa fluor 488.
p53
Gapdh
1203 12011202 1203 1202 1201Pool ASControl Pool S
AS S
Regulación de p53 Western Blot
WI38
VI 1201 1203
VII1202 1201
VIII12021202
VI 12011203
c
VII12011202
c
VIII12021202
c
Western CHD5 SH
Western CHD5 HeLa
Apoptosis HeLa
Viabilidad HeLa
Inmuno HeLa
InmunoSH p53
1201s + X X + - X - - X X + + +1201as X X - X X X X - + + + + +1202s + - - + - + + - - - + + +1202as + + + X X X+ + - + - + + +1203s - X X + - + + x X X + + +1203as - + + X + X+ x + + + + + +
Resumen