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メイラード反応による変色メカニズムと生体への影響
明治大学農学部 早瀬 文孝
1.メイラード反応とは
2.食品中のメイラード反応生成物
3.メラノイジンの生成メカニズムと制御
4.メイラード反応生成物の生体への影響
メイラード反応による変色メカニズムと生体への影響
1.メイラード反応とは
2.食品中のメイラード反応生成物
3.メラノイジンの生成メカニズムと制御
4.メイラード反応生成物の生体への影響
アミノカルボニル反応カルボニルアミン反応非酵素的褐変反応メイラード反応(=アミノカルボニル反応:
狭義にはアミノ化合物と還元糖の反応)グリケーション=非酵素的糖化反応
グリコキシデーション
R-NH2 + R'-CO-R''アミンアミノ酸ペプチドタンパク質核酸の塩基リン脂質
還元糖アルデヒドケトンポリフェノールアスコルビン酸ステロイド
1.メイラード反応とは
血糖(グルコース)
アマドリ化合物
(AGEs)
アミノ化合物(タンパク質、核酸、脂質)
カルボニル化合物
Advanced Glycation End products
カルボニル活性酸素
メイラード反応
N
OHC
Lys
OHLys
NH
CH2COOH
AGE(advanced glycation end products)とは?
◎非酵素的な糖化によってアミノ化合物(糖化タンパク質、糖化アミノ酸など)に生じた修飾構造のうち、後期段階生成物
(アマドリ、ジカルボニル類などは含まない)
◎非酵素的糖化とは糖類(グリコールアルデヒド、グリセルアルデヒド、還元糖など)が関与するメイラード反応
NN
N
NHH
Arg
Lys
メラノイジンとは?◎メイラード反応後期段階生成物◎含窒素難分解性高分子化合物◎褐色を呈する
類似化合物メラニン、リグニン、カラメル(一部メラノイジン含有)、
フミン(一部メラノイジン様物質)など
O
O
O
N
O CHO
NH O
NH
O
R’R
OO
OO
OO
N
O CHO
NHNH O
NH
OO
R’R
(Hofmann et al.)
N
R
N
R
N
R++
++
n
(Hayase et al.)
NRNR
NRNR
n(Tressl et al.)
低分子メイラード反応生成物の影響
変色フレーバーの生成変異原性物質の生成活性酸素種の生成タンパク質の劣化
ー栄養価や消化性の低下ー物性の変化ー重合、褐変、蛍光物質の生成
メラノイジンの生理作用
活性酸素消去作用抗菌作用抗化学発ガン作用降コレステロール作用食物繊維用作用腸内細菌増殖作用
抗酸化機構?アレルギー抑制作用?
メイラード反応による変色メカニズムと生体への影響
1.メイラード反応とは
2.食品中のメイラード反応生成物
3.メラノイジンの生成メカニズムと制御
4.メイラード反応生成物の生体への影響
松石昌典,食肉の科学,36,183-198,1995
加熱した食肉で検出された肉様香気物質
(+)-(S)-Alapyridaine – Taste Enhancer
T.Soldo et al.,Chem.Senses,28,371-379,2003
斉藤知明,日本味と匂学会誌11巻別冊11,165-174 (2004). *K.Shima et.al. J. Agric. Food Chem., 46,1465 (1998).
食品のこくと、こく味
イミダゾリノン(クレアチンとメチルグリオキサール)
食品中のメイラード反応生成物
アマドリ化合物 3-DG リジルピラリン メラノイジン(mmol/kg) (mmol/kg) (μmol/kg) (g/100ml)
醤油 3.5 0.2-1.2 - 0.7味噌 5.5 0.6-2.5 - -日本酒 0.022 0.031 - -ワイン 0.055 - - -レモンジュース - 0.154 - -チーズ グレービー - - 50 -粉乳 - - 8 -ホットココアミックス - - 27 -黒ビール - - - 0.1
はちみつ中のメイラード反応生成物
(mg/kg)
HMF(5-hydroxymethyl-2-furfural) 0.6-443-DG 79-1,266グリオキサール 0.2-2.7メチルグリオキサール 0.4-5.4
K.U. Weigel et.al., Eur. Food Res. Technol. 218, 147 (2004).
メイラード反応による変色メカニズムと生体への影響
1.メイラード反応とは
2.食品中のメイラード反応生成物
3.メラノイジンの生成メカニズムと制御
4.メイラード反応生成物の生体への影響
メイラード反応に与える要因
pH温度 (10°Cで3~5倍の反応速度)溶媒時間アミノ化合物とカルボニル化合物の濃度
(1Mグリシン-0.5Mキシロースは0.5Mグリシン-0.25Mキシロースに比べ6倍褐変する)
水分活性(乾燥食品を保存する場合には0.6-0.8
で最も褐変しやすい)酸素遷移金属
H.Kato, 1956
M.L.Wolform et.al, 1953
水分含量として30%
K.Eichner, 1972
H. Hashiba, 1976
D.L.Ingles, 1964
D.J. McWeeney, 1962
D.J. McWeeney, 1963
B.Lindberg et al, 1964
Glc-SO2Xyl-SO2
T.M. Leynolds, 1965
CH2SH
HCNH2
COOH
CH2SH
COOH
CH2SH
CH2
COOH
CH2SH
CH2OH
SH
システイン メルカプト酢酸 3-メルカプトプロピオン酸
メルカプトエタノール チオフェノール
加藤博通、食品の変色の化学、1995
M. Brownlee et al, 1986
Maillard Reaction
Sugars
Amino Compounds
Functions
Radical Scavenging Activity
Anti Oxidative Activity etc
Formation Pathway & Structure
Little Knowledge・・・
-CHO(Carbonyl groups)
-NH2
(Amino groups)
Melanoidins (Mel)
MelanoidinsBlue-M2
Blue-M3
Yel
Yel
?
R1=CH2COOH
R2=(CHOH)CH2OH
CHOOH
R2
CCHO H
H R1 NH2+
Antioxidative activity by POV test
Scavenging activity ofOH and DPPH radicals
Mechanism of Antioxidative activity
Blue-M1
Yellow compounds
●Viability and Lipidperoxidation in COS-1cell Exposure in Blue-M1
D-Xylose (1M)Glycine (0.1M)
Incubation in 60%Ethanol(pH8.1)Under N2 at 26.5℃ for 48h and 2℃ for 96h
DEAE Sephadex A-25
Sephadex G-15
Bio-gel P-2
Sephadex G-15 ×2
Blue-M1Structure of Blue-M1
N
CH
N
HC
HC
N CH
NCHOHCHH2CCHOH
CH2CH2
CH2CH2
CHOH
COOH
COOH
CH2OHCH2OH
COOH
COOH
D-Xylose(1M)Glycine(0.1M)NaHCO3(0.1M)・60%Ethanol・pH8.1・Placed under N2
(Incubation)
・26.5℃(48 h)and 2℃(96 h)
RP-HPLC separation of Blue-M2
Demineralization
Anion Exchange Chromatography
Gel permeation Chromatography
Demineralization
RP-LC purification of Blue-M2
Demineralization
RP-HPLC、UV/VIS、
Fluorescence、MS、NMR
Lyophilization
H2NH2C C OH
O
CHOHC OH
CHHOHC OH
CH2OH
D-Xylose Glycine
Gel permeation Chromatogram of Blue fraction by Biogel P-2.
Blue-M2 fraction Blue-M1
10 20 30 40
Fraction No.(2ml/fr)
1.0
2.0
Abs
at 6
40nm
Solvent : 1M NaCl
15 23
N
CH
N
HC
HC
N CH
NCHOHCHH2CCHOH
CH2CH2
CH2CH2
CHOH
COOH
COOH
CH2OHCH2OH
COOH
COOH
Identified structure of Blue-M2.
C
CCH
C
NHC
C
N
HCC
HC
C
CN
N
C
CH
CH2
COOH
CH2
COOH
CH2
COOH
CH2
COOH
H2CCH
OH
H2C
OH
CH
CHO
CHC
CH2
OH
HC OH
HC OH
H2C OH
N
CH2
COOH
H2C C
CHCH
CH2O
HO OHHO
HO
1 2
3
1612
4
5
6
10
17
7
8
919
2218
13
14
11
15
23
21
25
26
24
2039
3837
3635
27282930
3132
3334
H-HCOSYHMBC
(A) (B)
900800700600500400300200100 Da
30000
20000
10000
Cou
nts
940:M+
881:a851:a+b+H
807:(c)
791:2a+b
746:c+l
735:(e)+H
675:a+e645:(f)
295:(g)
309:(h)+H 529:(i)413:(j)
588:d+k
605:d+k+H2O
574:a+k
0190:(m)-O
C
CCH
C
NHC
C
N
HCC
HC
C
CN
N
C
CH
CH2
COOH
CH2
COOH
CH2
COOH
CH2
COOH
H2CCH
OH
H2C
OH
CH
CHO
CHC
CH2
OH
HC OH
HC OH
H2C OH
N
CH2
COOH
H2C C
CHCH
CH2O
HO OHHO
OH
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(b)
(b)
(d)
(d)
(d)(b)
(k)
(l) (i)
(j)(f)
(g)(h)
(c)
(e)
(m)
MALDI-TOF-MS PSD mode fragmentation pattern of Blue-M2.
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 40 80 100
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Anion exchange chromatogram of Maillard reaction products obtained from D-Xylose-Glycine model system
NaC
l con
c.
Abs
at 6
25nm
Fraction number (16ml/fraction)
52 63
Redfractions
Abs
at 5
50nm
20
Abs
orba
nce(
550n
m)
0 10 20 30 40 50 60
Red-M1 Red-M2
HPLC profile of Red fractions
Retention time (min)
200 300 400 500 600 700nm
Red-M1
Red-M2
Abs
orba
nce
554.5nm
564.0nm
UV/VIS spectra of Red-M1 and Red-M2
C
HC
NC
C
N
C
CCH
NCH
C
CHC
CN
CH2OH
H2C
CHOH
CH2OHCH2
COOH
CH2 H2C
CH2
COOH
COOH
COOH
CHOH
CHOH
CHOH
CH2OH
Identified structure of Red-M1
HMBC correlationH-H COSY correlationfrom Amadori compound
Xylulose-Glycine;XG
Xylose(1M)
Glycine(0.1M)
Browning(Abs 420nm)
Blue(Abs 625nm)
+
Amadori Compound(Xylulose-Glycine;XG)
(0~100mM)
0
1
2
3
0 10 25 50 100
Rat
io(6
25nm
/420nm
)
0 10 25 50 100
XG (mM)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 10 25 50 100
XG (mM)
Bro
wnin
g (A
bs 4
20nm
)
0
0.5
1
1.5
0 10 25 50 100
XG (mM)
Blu
e (
Abs
625nm
)
XG
H 2C NH
C
C HHO
C OHH
CH 2OH
O
CH 2
COOH
Incorporation of XG in Blue-M1 & M2
XG(3.2mM)
Blue-M1
Blue-M2
Xylose(1M)
Glycine(0.1M)
Blue Soln
MALDI-TOF-MS
H 2C NH
C
C HHO
C OHH
CH 2OH
O
CD 2
COOH
d2-XG(25mM)
d2-XG
H→DH→D
Incorporation of d2-XG in Blue Compounds
Blue-M1
Blue-M2
H 2C NH
C
C HHO
C OHH
CH 2OH
O
CD 2
COOH
d2-XG
CH
N
N
HC
HC
N
HC
CH
N
HC
CHO
HCC
NH2C C
HCHC
CH2O
H2C
CHOH
CH2OH
CH2
COOH
CH2
COOH
CH2
COOH
CH2
COOH
CH2OH
CH2
COOH
CHOH
CHOH
CH2OH
HO
HO
HO OH
Incorporation of d2-XG in Blue-M1
Blue-M1m/z 619 m/z 619
Cont d2-XG (+)
Xyl
Gly
XG Intermediatecompounds
Blue-M1Glycinefrom XG
N
N
HC
N
N
CH2
COOH
CH2
COOH
CH2
COOH
CH2
COOH
CH2HOC
CHOH
CH2OHCHOH
CH2OH
Blue-M1
× ×
××
Incorporation of d2-XG in Blue-M2
Blue-M2m/z 940
Blue-M2+2Dm/z 942
d2-XG (+)Cont
Blue-M2
Blue-M1
CH
N
N
HC
HC
N
HC
CH
N
HC
CHO
HCC
NH2C C
HCHC
CH2O
H2C
CHOH
CH2OH
CH2
COOH
CH2
COOH
CH2
COOH
CH2
COOH
CH2OH
CH2
COOH
CHOH
CHOH
CH2OH
HO
HO
HO OH
× ×
××From XG
CD2
Xylose & XG
Schiff base
Blue-M1
Pyrrolopyrrolealdehyde
Red-M1Red-M2
Blue-M2
Amadori compound
Melanoidins
GlycineXylose
メイラード反応による変色メカニズムと生体への影響
1.メイラード反応とは
2.食品中のメイラード反応生成物
3.メラノイジンの生成メカニズムと制御
4.メイラード反応生成物の生体への影響
100
34.6
22.4
30.1
5.3
21.7
0 20 40 60 80 100 120
Tocopherol
BHA
Mel(Xyl-Gly)
Mel(Glc-Gly)
Blue-M1
Control
POV(%)
The Effect of Blue-M1 and Melanoidin,BHA,Tocopherol on Peroxide Value of Linolenic acid.Mel(Glc-Gly),Glucose incubated with glycine at 95℃ for 7h.Mel(Xyl-Gly),Xylose incubated with glycine at 95℃ for 7h.POV(%)=(POV with sample/ POV without sample)×100Concentration of Blue-M1,BHA,Tocopherol and Melanoidin is 230μM and 0.025%
Structure of Blue-M1
N
CH
N
HC
HC
N CH
NCHOHCHH 2 CCHOH
CH 2CH 2
CH 2CH 2
CHOH
COOH
COOH
CH 2 OHCH 2 OH
COOH
COOH
100
84.1
63.7
5.2
0 20 40 60 80 100 120
Blue-M11000μl
Blue-M1 250μl
Blue-M1 50μl
Contro l
POV(%)
The Effect of Concetration of Blue-M1 on Peroxide Value of Linolenic acid.Concentration of Blue-M1 is 195μM
ESR spectra of DMPO-OH adducts with or without sample
ControlBlue-M1
Mel(Glc-Gly)0.2%Mel(Glc-Gly)0.4%
BHATocopherol
100
31.3
45.8
16.6
0
0
0 20 40 60 80 100 120
Tocopherol
BHA
Mel(Glc-Gly)0.4%
Mel(Glc-Gly)0.2%
Blue-M1
Control
Relative ESR signal intensity(%)
100
68.2
61.2
60.7
48.9
37.5
32.8
0 20 40 60 80 100 120
Blue 100μl
Blue 80μl
Blue 60μl
Blue 40μl
Blue 20μl
Blue 10μl
Control
Rerative ESR signal intensity(%)
Relative signal intensity of DMPO-OH adducts with or without sampleRelative ESR signal intensity(%)=(ESR signal intensity with sample/ESR signal intensity without sample)×100Concentration of Blue-M1,BHA,Tocopherol is 3mM
The Effect of Concentration of Blue-M1 on Relative signal intensity of DMPO-OH adducts. Concentration of Blue-M1 is 3mM
100
33.9
42.4
8.1
11
0
0 20 40 60 80 100 120
Tocopherol
BHA
Mel (Glc-Gly)0 .4%
Mel(Glc-Gly) 0 .2%
Blue-M1
Control
Relative ESR signal intensity(%)
Relative ESR signal intensity of DPPH radicals with or without sampleConcentration of Blue-M1,BHA,Tocopherol is 3mM.
ESR spctra of DPPH radical with or without sample
ControlBlue
Mel(Glc-Gly)0.2%Mel(Xyl-Gly)0.4%
BHATocopherol
100
88.7
56.3
41.1
33.9
0 20 40 60 80 100 120
Blue50μl
Blue40μl
Blue20μl
Blue5μl
Control
Relative ESR signal intensity(%)
The Effect of Concentration of Blue-M1 on Relative signal intensity of DPPH radicals with or without sample.Concentration of Blue-M1,BHA,Tocopherol is 3mM.
Incubated at 37℃ for 24h (A)6h(B)
Medium 100μl WST-8 10μl
Incubated at 37℃ for 1h
Absorbance at 450nm
Experiment Condition of Cell Viability(A) and Lipid peroxidation of cell membrane (B) in COS-1 cell Exposure in Blue-M1
Fluorescence at Ex.305nm,Em.450nm
A BCOS-1 cell 1×104cells/100μl/well
0.01,0.05,0.1% of Blue-M1 50μl
15mM(A) or 10mM(B) of AAPH 50μl
50μM DPPP solution 100μl
Incubated at 37 ℃for 15min
0
20
40
60
80
100
120
140
160
10mMAAPH
0.01% 0.05% 0.10%
Blue-M1
% o
f contr
ol
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
80.0
15mM AAPH 0.01% 0.05% 0.10%
Blue-M1
% o
f contr
ol *
*p<0.01
*
*
**
**p<0.01
Cell Viability(A) and Lipid peroxidation of Cell membrane (B) in COS-1 cell Exposure in Blue-M1
All values represent the mean ± S.D(n=9)
A
B
N
CH
N
HC
HC
N CH
N
CH CHOH
CHOH
CH2OH
H2C
CHOH
CH2OH
CH2
COOCH3
CH2
COOCH3
CH2CH2
COOCH3 COOCH3
Blue-M1 0.5mgMethanol 0.8mlBenzene 2.8ml
Incubated at Room temperature for 30min
Trimthylsilyldiazomethane 200μl
Structure of Methylated Blue-M1(M.W.=675)
MALDI-TOF-MS Spectra of Mathylated Blue-M1
618.
82 [B
lue]
+
660.
79 [B
lue+
3Met
]+
674.
77[B
lue+
4Met
]+
632.
64 [B
lue+
1Met
]+
HPLC Pattern of Methylated Blue-M1
10 20 30 40 50 60 70 80 90
Blue-M1Met-Blue-M1
R.T(min)0 nm300 400 500 600 700
626
% of ESR signal intensity
*Met-Blue 1.21mM・50μlBlue-M1 1.31mM・40μl
63.6
100
60.7
0 50 100 150
Met-Blue-M1
Blue-M1
control
Hydroxyl radical Scavenging Activity of Methylated Blue-M1
Blue-M1 5mM 80μl30% H2O2 20μl
Incubated at Room temperature for 3h HPLC,MS,NMR
HPLC Pattern of Blue-M1 Incubated without H2O2 (A) and with H2O2 for 3h (B)
AU
- 0 .0 0 5
0 .0 0 0
0 .0 0 5
0 .0 1 0
0 .0 1 5
分1 0 .0 0 2 0 .0 0 3 0 .0 0 4 0 .0 0 5 0 .0 0 6 0 .0 0
AU
0 .0 0
0 .0 2
0 .0 4
0 .0 6
0 .0 8
0 .1 0
0 .1 2
0 .1 4
分1 0 .0 0 20 .0 0 3 0 .0 0 40 .0 0 5 0 .0 0 60 .0 0
A
Bnm
250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750
627.6625nm230nm
nm250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750
627.6232.1min
min
636.
53[B
lue+
OH
+H]+
658.
46 [B
lue+
OH
+Na]
+
618.
53[B
lue]
+
MALDI-TOF-MS Spectra of Blue-M1 Incubated with H2O2 for 3h65
2.58
[Blu
e+O
OH
+H]+
de
a’
b’
c’
d’ e’
N
CH
N
HC
HC
N CH
NCHOHCHH2CCHOH
CH2CH2
CH2CH2
CHOH
COOH
COOH
CH2OHCH2OH
COOH
COOH
OOH
a’ b’c’
d’e’
c
abA
B
123456789
a bcN
CH
N
HC
HC
N CH
NCHOHCHH2CCHOH
CH2CH2
CH2CH2
CHOH
COOH
COOH
CH2OHCH2OH
COOH
COOH
de
ppm
7 68NMR Spectrum of Blue-M1 Incubated without H2O2 (A) and with H2O2 for 3h (B)
abc
de
Added H2O2
IL-4IL-5IL-6
naiveCD4+T cell
Th1 cell
Th2 cell
B cell
IL-4
IgE
IL-12
IL-4 IFN-γ
IFN-γ
activation
inhibition
Th1/Th2 Cytokines in IgE production
Physiological effects of melanoidins
*
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
1 2 3
rela
tive inte
nsi
ty
IL-4IFN-γβ-actin
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
1 2 3re
lative inte
nsity
Effects of melanoidins on IFN-γ and IL-4 mRNA expression in splenocytes. Values are the mean±SD. n=3 *p<0.05 vs control
1.Control2.NDMEL 0.0001%3.NDMEL 0.001%
1 2 3
IFN-γ IL-4
Effect of melanoidins on IL-12 p40 mRNA expression in J774.1. Values are the mean±SD n=3 p<0.05 vs control
NDMEL (μg/ml)
IL-12β-actin
0102030405060
0 0.1 1
*re
lativ
e in
tens
ity