微量凯氏（ Mirco-Kjeldahl ）定氮法

目 的

1 、学习微量凯氏定氮法的原理2 、掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括标准

硫酸铵含量的测定，未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。

原 理 （消化、蒸馏、滴定、计算）

凯氏定氮法常用于测定天然有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等）的含氮量。

天然的含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此时程称之为“消化”。

（但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。）

浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定的量和浓度的硼酸溶液中（紫红色），硼酸吸收氨后（绿色），氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止（紫红色），最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中的氮量。

OHNHSONaNaOHSONH 44242 22)4( 324 NHOHOHNH

324333 BOHNHBOHNH 334324 BOHCLNHHCLBOHNH

滴定时用甲烯蓝和甲基红混合指示剂，其指示范围为 pH5.2~5.6 ，将 NH4H2BO3 的绿色滴至原来 H3BO3 的紫红色即为终点。本法适用范围 0.2~1.0 毫克氮。相对误差应小于 2% 。

器 材

1 、改良型凯氏定氮仪 2 、 10mL 微量酸式滴定管 3 、酒精灯（打火机）4 、凯氏烧瓶 5 、锥形瓶（ 50~100 毫升）、容量瓶（ 50 毫

升）

试 剂

1 、 0.1mg/mL 标准（ NH4 ） 2SO4

2 、 30% NaOH 溶液 3 、 2% 硼酸4 、标准 HCl （ 0.0100M ） 5 、混合指示剂（田式指示剂）

操作步骤 （样品的处理、消化时间长，略）

1. 熟悉改良型凯氏定氮仪构造原理，滴定管的使用

夹子 1

夹子 2

夹子 3

图 凯氏微量定氮蒸馏装置

2. 蒸馏器的清洗（将蒸汽发生器废水换掉，主要清洗反应室）

⑴ 取 3 个 50mL 锥形瓶编号，各准确加入 5mL 硼酸（内加混合指示剂 1-2 滴），呈淡紫色。表面皿覆盖备用。

⑵ 先将夹子② 打开缓慢接上冷水，向蒸汽发生器（ A 球）中注入 3/

4 球体的水，将夹子①②③全关上，将水烧开，然后在加样漏斗中加入少许蒸馏水到反应室（ B 球）中， B 球中水将自动吸到A 球；或者将酒精灯挪开；或者将夹子②打开放入少许冷水，都将使反应室中的水自动吸出，反复清洗 3次。

最后一次可用硼酸检测：将冷凝管出口下端浸入第 1 个硼酸及指示剂的锥形瓶的液面下，蒸馏数分钟，观察颜色变化，若不变色则洗净。（注：先挪开锥形瓶，再挪酒精灯，防锥形瓶中液体被倒吸）

3. 蒸馏样品

⑴ 打开夹子③放掉部分热水，并补充适量冷水，将冷凝管出口下端浸入第 2 个硼酸及指示剂的锥形瓶的液面下。打开夹子①，用移液管取5mL （ NH4 ） 2SO4 缓慢加入反应室，再加入 5mL NaOH ，关闭夹子①，并在加样漏斗中加入少许蒸馏水做水封。关闭所有夹子，缓慢打开冷凝水，开始加热蒸馏

⑵ 当观察到锥形瓶内溶液由紫变绿时，开始计时蒸馏 3 分钟，然后提高冷凝管出口离开液面 1cm 高，同时用少许蒸馏水冲冷凝管出口外侧，继续蒸馏 1 min. 移走锥形瓶，用表面皿覆盖，等待滴定。

⑶ 清洗反应室：放掉发生器中废水，按照步骤 2 （ 2 ）操作，最后将蒸汽发生器中废水全换了，并加热使蒸汽通过整个装置数分钟

4. 蒸馏空白

⑴ 操作如蒸馏样品，空白不加（ NH4 ） 2SO4 ，而是 5mL 蒸馏水及 5mL NaOH

⑵ 第 3 个锥形瓶收集完后，清洗反应室，放掉废水，操作按照 3 （ 3 ）

5. 滴定

用标准盐酸溶液滴定第 2 ， 3两只锥瓶内溶液，当硼酸溶液刚由绿变回淡紫色时为滴定终点，记录所用盐酸的量。

6. 计算

C —— 标准 HCl 的浓度 0.01M

V1 —— 滴定样品消耗标准 HCl平均mL 数 V2 —— 滴定空白消耗标准 HCl平均mL 数V —— （ NH4 ） 2SO4 样品体积（ mL ）

（ NH4 ） 2SO4 样品含 N 量（ mg/mL ） = C (V1-V2) ×14 / V

代入上式得：（ NH4 ） 2SO4 样品含 N 量（ mg/mL ） = 0.01 (V1-V2) ×14 / 5