亚砷酸盐刺激 NIH 3T3 细胞 HSP27转位的机制研究

报告人：基础医学院 04 级医学实验技术 --李涛指导老师：姜勇教授、龚小卫博士

知识背景基本结构：热休克蛋白 N 端为一个具有 ATP 酶活性的高度保守序列和 C 端一个相对可变的基质识别序列。

知识背景

HSP27 在细胞应激中的作用

知识背景

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研究目的及意义研究 HSP27 在受刺激后移位入核与 p38 的关系，明确 p38 在 HSP27 移位入核过程中的作用机制。

在研究基础上初步提出 HSP27 移位入核的分子机制。

此次研究为进一步研究 p38 在 HSP27 移位入核分子机制的作用奠定基础，对 p38 信号通路异常引起的一些疾病的临床治疗提供了一些新的思路。

研究内容

验证 HSP27 在刺激作用下能移位入核

研究 HSP27 移位入核与 p38 的关系

技术路线NIH 3T3 细胞

p38 抑制剂SB203580预处理

EGFP-HSP27(WT)

EGFP-HSP27(S82A) EGFP-C2

对 HSP27 细胞内定位影响

对 HSP27 磷酸化影响

对 HSP27功能无影响

空白

实验流程1.定点突变、载体构建

2. 细胞培养、预处理、刺激

3.脂质体介导的细胞转染

4.荧光显微镜观察

5.免疫印迹（ Western blot ）检测

6.实验结果分析

实验结果 HSP27 的定点突变结果 — HSP27 第 82 位丝氨酸定点突变为丙氨酸 [AGC 突变为 GCC]

Fig. 1 The sequencing of the HSP27(S82A) mutantThe mutated sites were underlined

实验结果EGFP-HSP27(WT) 和 EGFP-HSP27(S82A)的鉴定

Fig. 2 The construction and identification of EGFP-tagged HSP27(WT) and HSP27(S82A)

A: 1, DNA ladder; 2, PCR product of EGFP-HSP27(WT); 3, PCR product of EGFP-HSP27(S82A). B: 1, DNA ladder; 2, EGFP-HSP27(WT) digested by Hind III and BamH I; 3, EGFP-HSP27(S82A) digested by Hind III and

BamH I

实验结果 EGFP-HSP27(S82A) 的移位被阻断

Fig. 3 Effect of Ser82 mutation on the nuclear translocation of HSP27 in the cells stimulated with arsenite (400)

实验结果SB203580 预处理阻断了 HSP27 的磷酸化

Fig. 4 Effect of SB203580 on the Ser82 phosphorylation of HSP27 in the cells stimulated with arsenite1, control; 2, NaAsO2; 3, SB203580+NaAsO2

实验结果SB203580 预处理阻断了 HSP27 的移位入核

Fig. 5 Effect of SB203580 on the nuclear translocation of HSP27 in the cells stimulated with arsenite (400)

小结

为研究 HSP27 的磷酸化激活与其细胞内定位之间的关系

p38 MAPK 特异性抑制剂SB203580 预处理 NIH3T3细胞

EGFP-HSP27(WT) 和 EGFP-HSP27(S82A) 真核表达载体转染 NIH3T3 细胞

结果分析

小结野生型 HSP27 受到应激刺激后移位入核，而其突变体 HSP27(S82A) 不能入核 。

SB203580 的预处理使 HSP27 的磷酸化和移位入核都被阻断 。

以上说明 p38 MAPK 确实在 HSP27 磷酸化激活后的移位入核中起作用

下一步工作HSP27 另外两个磷酸化位点（ Ser15 和 Ser78 ）被突变后对 HSP27 磷酸化及其移位入核的影响。

探讨 HSP27 的上游激酶 MK2 或 PRAK 在其移位入核中的作用 。

HSP27 移位入核后所介导的生理功能 。