Антиоксиданты: механизм действия и

роль в профилактике и лечении заболеваний

Е.В. Проскурнина, ФФМ, 2016

С конференции INDC 2016

Вопросы номенклатуры

• Восстановитель: вещество, отдающее электрон в окислительно-восстановительных реакциях,

• Антиоксидант (Холливелл, Гаттеридж) (биоантиокислитель): любое вещество, которое присутствуя в низких, по сравнению с окисляемым субстратом концентрациях, ингибирует или полностью прерывает его окисление.

По химической природе АО представляют собой широкий класс соединений

Ферменты

Супероксид-дисмутаза

глутатион-пероксидаза

каталаза

Поли-фенолы

Производные галловой кислоты

пирокатехин

Токоферолы

Эвгенол, пирокатехин

Флавоно-иды

Рутин

кверцетин, дигидро-

кверцетин

ресвератрол

Липиды

Лецитин

кефалин

По растворимости:

Водорастворимые

Мочевая кислота, витамин С, глутатион и

другие

…

Жирорастворимые(липидные)

Витамин Е, коэнзим Q10

…

По молекулярной массе:

Низкомолекулярные

Мочевая кислота, витамин С, глутатион,

витамин Е

билирубин, эстрогены, мелатонин

Высокомолекулярные

Ферменты: супероксиддисмутаза,

каталаза, глутатион-пероксидаза

Белки: ферритин, церулоплазмин,

альбумин, лактоферрин

По действию:

• Перехватчики свободных радикалов (скевенджеры)

• Ферменты, катализирующие превращение активных форм

• Хелаторы металлов переменной валентности

Экзогенные антиоксиданты

Природные антиоксиданты

9

Содержат в большом количестве гидроксильные группы у бензольногокольца (полифенолы) или непредельные связи (каротиноиды)

Ликопин (каротиноиды)

• Замедляет развитие атеросклероза, а также обеспечивает защиту ДНК, что может предотвращать онкогенез.

• Потребление ликопина, а также ликопин-содержащих продуктов приводит к достоверному уменьшению маркеров окислительного стресса у человека.

• Ликопин самый сильный каротиноид-антиоксидант.

ПродуктыСодержание ликопина, мг/кг

Томаты 5-50

Томатный соус 62-134

Томатная паста 54-1500

Грейпфрут 34

Гуава 54

Арбуз 23-72

Лигнаны (полифенолы)

Источник Содержание в 100 г

Льняное семя 300,000 мкг (0.3 г)

Кунжутное семя 29,000 мкг (29 mg)

Капустные 185 - 2321 мкг

Зерновые 7 - 764 мкг

Красное вино 91 мкг

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9B%D1%91%D0%BDhttps://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9A%D1%83%D0%BD%D0%B6%D1%83%D1%82https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9A%D0%B0%D0%BF%D1%83%D1%81%D1%82%D0%B0_(%D1%80%D0%BE%D0%B4)

Флавоноиды(полифенолы)• Гидроксипроизводные флавона (собственно

флавоноиды), 2,3-дигидрофлавона (флаваноны) изофлавона (изофлавоноиды), 4-фенилкумарина (неофлавоноиды)

Де Сент-Дьерди, 1936

Флавон изофлавон 4-фенилкумарин

Зеленый чай

• Флавоноиды кверцетин, кемпферол

• Катехины (галлат эпигаллокатехина)

• Каротиноиды, токоферолы, аскорбиновая кислота

Таксифолин

• Биофлавоноид сибирской лиственницы

• Антиоксидант для профилактики оксидативного стресса и антиокислитель в пищевой промышленности

• Характеризуется не только антиоксидантным, но химиопротективным и метаболическим действием

Ресвератрол

• В экспериментах с мышами и крысами были выявлены противоопухолевое, противовоспалительные, понижающие уровень сахара в крови, кардиопротекторные и другие положительные эффекты ресвератрола. Кроме того, в 2003 была открыта способность ресвератрола увеличивать продолжительность жизни некоторых беспозвоночных, а после и короткоживущих рыб.

Антоцианы

• Р. Вильштеттер, 1913 • Богаты антоцианами такие

растения, как, например, черника, клюква, малина, ежевика, чёрная смородина, вишня, баклажаны, свёкла, чёрный рис, виноград Конкорд и мускатный виноград, красная капуста, и некоторые виды перцев, как жгучих, так и т. н. сладких. В медицине широко применяются антоцианы черники (в составе экстракта черники).

Средиземноморская диета

Из напитков больше антиоксидантов в какао

Эндогенные антиоксиданты

Глутатион – важнейший антиоксидант

Антиоксидант мелатонин

Применяется как снотворное средство

Мелатонин

Синтезированный в эпифизе мелатонин поступает в кровь и спинномозговую жидкость — ликвор, пройдя через которую, накапливается в гипоталамусе. Помимо крови и ликворе, мелатонин обнаружен в моче, слюне, амниотической жидкости.Мелатонин транспортируется

сывороточным альбумином, после освобождения от альбумина связывается со специфическими рецепторами на мембране клеток-мишеней, проникает в ядро и там осуществляет своё действие.Мелатонин — редкий пример гормона, к которому имеются как мембранные, так и ядерные рецепторы.

Кофермент Q

Супероксиддисмутаза

• Фермент, открыт Мак-Кордом и Фридовичем в 1958 году.

• M(n+1)+−СОД + O2●− → Mn+ − СОД + O2

• Mn+−СОД + O2●− + 2H+ → M(n+1)+−СОД +

H2O2

Cu-Zn-СОД – цитоплазматическая и внеклеточнаяMn-СОД - митохондриальная

Ферменты пероксисомы

• Пероксисомы являются главным источником по крайней мере трех окислительных ферментов -оксидазы D-аминокислот, уратоксидазы и каталазы . Подобно митохондрии, пероксисома- это один из главных центров утилизации кислорода в клетке .

Каталаза – основная пероксидаза пероксисом

Каталаза (гемсодержащий фермент) использует образующуюся перекись водорода для окисления множества низкомолекулярных субстратов —спиртов, фенолов, муравьиной кислоты, формальдегида и этанола

H2O2 + RH2 = R + 2H2O

Этот тип окислительных реакций особенно важен в клетках печени и почек, пероксисомы которых обезвреживают множество ядовитых веществ, попадающих в кровоток. Почти половина поступающего в организм человека этанола окисляется до ацетальдегида этим способом. Кроме того, реакция имеет значения для детоксикации клетки от самой перекиси водорода

Каталазный каталитический цикл

ФеррикаталазаПротофорфирин IX-Fe3+

Compound I

H2O2

H2O

1

(PP IX)*Fe = O

Каталаза млекопитающих содержит сильно связанный NADPH Kirkman, H. N., and Gaetani, G. F. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81,4343-4347.

Каталазный каталитический цикл

D▪Каталаза млекопитающих содержит сильно связанный NADPH Kirkman, H. N., and Gaetani, G. F. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81,4343-4347.

Феррикаталаза

Compound IIDH

Protoporphyrin IX-Fe3+

Compound I

H2O2

H2O

1

(PP IX)*Fe = OH2O2

O2

2

Каталазный каталитический цикл

D▪Каталаза млекопитающих содержит сильно связанный NADPHKirkman, H. N., and Gaetani, G. F. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81,4343-4347.

Феррикаталаза

Compound IIDH

Protoporphyrin IX-Fe3+

Compound I

H2O2

H2O

1

(PP IX)*Fe = OC2H5OH

3

CH3СOН

Каталазный каталитический цикл

Каталаза млекопитающих содержит сильно связанный NADPH Kirkman, H. N., and Gaetani, G. F. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81,4343-4347.

Феррикаталаза

Compound IIDH

D▪

Protoporphyrin IX-Fe3+

Compound I

H2O2

H2O

1

(PP IX)*Fe = ONADPH

3

NADP+

Глутатион-пероксидаза

• Пероксид водорода нейтрализуется в реакции с глутатионом, катализируемой

• глутатионпероксидазой (изоформы 1,2,3, 5):

• 2H2O2 + 2GSH → 2H2O + O2 + GSSG.

• Образующийся окисленный глутатионвосстанавливается под действием фермента глутатион-редуктазы за счет энергии НАДФ-Н. Отношение восстановленный/окисленный глутатион внутри клетки является одним из важнейших параметров, который характеризует уровень окислительного стресса.

• Гидропероксиды фосфолипидов восстанавливаются с участием изоформы 4

• ROOH + 2GSH → ROH + H2O + GSSG

Глутатионпероксидаза была открыта в 1957 году Гордоном Миллсом

Селенсодержащий фермент

Тиоредоксины и глутаредоксины

• Восстановление дисульфидных связей в белках осуществляется за счет тиоредоксин- и глутаредоксин-зависимых систем.

• Тиоредоксины (Trx-1 и Trx-2) содержат два легко и обратимо окисляющихся остатка цистеина; с участиемтиоредоксинредуктазы они претерпевают НАДФН-зависимое восстановление. Являясь донорами протонов, тиоредоксинывлияют на редокс-состояние,а также участвуют в редокс-сигнализации, регулируя активность киназ и факторовтранскрипции

• Trx-(SH2) + Protein-S2 → Trx-S2 + Protein-(SH2),

• Trx-S2 + NADPH + H+ → Trx-(SH2) + NADP

+

• Глутаредоксины (Glrx-1 и Glrx-2) также принадлежат суперсемейству тиол/дисульфид-обменных белков, а глутаредоксинредуктаза поддерживает соотношение окисленных/восстановленных глутаредоксинов с участием НАДФН и глутатиона.

Методы определения антиоксидантов

Хемилюминесцентный метод: определение активности антиоксиданта• Принцип: есть ХЛ-система генерации свободных

радикалов

• Добавляют антиоксидант

• Наблюдают эффект тушения хемилюминесценции, зависящий от активности антиоксиданта

• ! Надо различать понятия «активность» антиоксиданта и его «содержание»

Три типа кривых в системе пероксидаза –пероксид водорода - люминол

Class Parameter

Сильный Латентныйпериод

Средней силы Скорость нарастания

Слабые Степень тушения

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 2 4 6 8 10

Inte

nsi

ty o

f ch

em

ilu

min

esc

en

ce,1

03

ips

Time,min

1

2

3

4

5

6

TRAPLatency period

Ascorbate

STRONG

1

2

3

4

5

6

TAR

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 2 4 6 8 10

Сигн

ал,V

Время, мин

α-tocopherol

Qu

en

chin

g d

egre

e

WEAK

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10

Си

гна

л, V

Время, мин

1

2

34

56

Quercetin

MEDIUM STRENGTH

7

Фрукты Rosaceae характеризуются активностью средней силы

0

50

100

150

200

250

300

350

0 2 4 6 8 10

I cl, 1

03

pp

s

Time, min

Sorbus aucuparia

1

2

34

5

0

20

40

60

80

100

120

140

0 2 4 6 8 10

I cl, 1

03

pp

s

Time, min

Rubus idaeus1

2

3

4

5

0

50

100

150

200

250

300

0 2 4 6 8 10

I cl,

10

3p

ps

Time,min

Crataegus

1

234

5

0

50

100

150

200

250

300

0 2 4 6 8 10

I cl,

10

3p

ps

Time, min

Rosa cinnamonea

12

3

4

5

10

Rubus idaeus L.

Хемилюминесцентная система: пероксидаза из корней хрена, люминол, пероксид водорода

Определение антиоксидантной емкости: система АБАП + люминол

37А.В. Алексеев, Е.В. Проскурнина, Ю.А. Владимиров, Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2: Химия, 2012, Т.53, № 3, С. 187-193

Определение антиоксидантной емкости: система АБАП + люминол

Градуировка

Концентрация тролокса, нМ

23

0 100 200 400 600 800 1000I

ХЛ-система АБАП + люминол + тролокс, эксперимент и математическое моделирование

Lum-5773

Определение антиоксидантной емкости плазмы крови

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 5 10 15 20 25

ХЛ

, В

время, мин.

tgαНачальная фаза

Фаза действия сильного антиокси

данта Фаза А

Фаза B, действие слабого антиоксиданта

Электрохимический способ определения активности восстановителей

Принципиальная схема электрохимического прибора для определения антиоксидантной активности, Я. И. Яшин

Амперометрическая ячейка: измеряют силу тока в ячейке при постоянном большом положительном потенциале

Значение потенциалов, при которых реализуются

наибольшие сигналы

число гидроксильных групп учитывается в положениях: C-3, C-2', C-3', C-4', C-5'

Соединения Число групп ОН Потенциалы, mВ

Оксикислоты:Галловая

ПротокатехиноваяКофейная Феруловая

n-кумариновая

32211

100150150400750

Флаван-3-олы:(+) катехин

(-) эпикатехин(-) эпиталлокатехин

334

100, 600100, 600

900

Флаваноны:Нарингенин

Эриодиктиол12

300, 800100, 850

Флавонолы:Кверцетин Мирицетин

Изо кверцетинРутин

3421

300, 900100, 700250, 800300, 900

Токоферолы:a- токоферолg- токоферолd- токоферол

123

200300400

Определение количества антиоксидантов: ВЭЖХ

Хроматограф Маэстро (Интерлаб)• Определение аскорбиновой кислоты в соках в

соответствии с ГОСТ 31643-2012 «Продукция соковая. Определение аскорбиновой кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии»

• Определение нарингина и неогесперидина в апельсиновом соке в соответствии с ГОСТ Р 54742-2011 «Продукция соковая. Определение нарингинаи неогесперидина в апельсиновом соке методом ВЭЖХ»

• Чай и чай растворимый. Определение содержания кофеина

• Определение антиоксиданта Е310 пропилгаллат в пищевых продуктах

• Определение флавоноидов

• Определение ресвератрола в красных винах

• Определение тадалафила

Антиоксидантная терапияЧасть 4

Терапия антиоксидантами (?)

Данные мета-анализа больших рандомизированных

клинических исследований говорят об отсутствии эффекта

антиоксидантной терапии

Средиземноморская «диета», данные отдельных небольших клинических

исследований

свидетельствуют о положительном эффекте приема антиоксидантов

Исследование SELECT

• Selenium and Vitamin E Cancer Prevention Trial

https://www.cancer.gov/types/prostate/research/select-trial-results-qa

In SELECT, this measure means that there were 17 percent more prostate cancer cases diagnosed in the group of men assigned to take 400 International Units (IU) of vitamin E (and no selenium) daily compared to the men taking two placebos (no vitamin E and no selenium) after an average of seven years -- 5.5 of the years on supplements followed by 1.5 years not taking supplements.

Лайнус Полинг был приверженцем терапии витамином С

Ион Скулачева SkQ1 (1974)

Механизм действия митохондриально-адресованных антиоксидантов

Скулачин – эликсир молодости (?)

«На сегодня уже 19 разных признаков старения удалось затормозить или даже повернуть вспять при помощи SkQ1, среди них –инфекционные заболевания, остеопороз, дистрофия сетчатки, катаракта, увеит, инфаркт миокарда, аритмия сердца, нарушение полового поведения самцов, нарушение полового цикла самок, ослабление памяти, облысение, поседение, снижение температуры тела, уменьшение тимуса и старческая депрессия».

Болезни, вызванные недостаточностью антиоксидантов

Кешаньская болезнь (недостаточность селена)

• Цинга (?) – недостаточность витамина С и синтеза коллагена

Недостаточность витамина Е вследствие нарушения всасывания жиров

Антиоксидантные препараты

• Мексидол® оказывает антигипоксическое, мембранопротекторное, ноотропное, противосудорожное, анксиолитическое действие, повышает устойчивость организма к стрессу.

• Кудесан (коэнзим Q) (кардиопротекторный препарат)

• Глатион (глутатион) (В составе комплексной терапии заболеваний печени, таких как: острый и хронический гепатит различной этиологии, алкогольный цирроз, печеночный стеатоз, фиброз печени)

• Унитиол (хелатор тяжелых металлов) (при отравлениях)

Позитивное действие антиоксидантов

При лечении инфертильностиприменяют Процептин(Proceptin™ MX)

• Витамин С (аскорбиновая кислота) 25 мг

• Витамин Е (альфа токоферола ацетат) 67,5 мг

• Сульфат цинка 20 мг

• Ретинола ацетат 30 мкг

• Холекальциферол 5 мкг

• Фолиевая кислота 300 мкг

• Пиридоксин гидрохлорид 1 мг

• Селенат натрия 60 мкг

• L-карнитин 220 мг

• Коэнзим Q10 7,5 мг

• L-глутатион 40 мг

• L-аргинин гидрохлорид 125 мг

• L-метионин 2,5 мг

• Бетаин гидрохлорид 2,5 мг

Множество БАДов

Состояния, требующие приема антиоксидантов: острый оксидативныйстресс у здоровых людей

• Физическая нагрузка у спортсменов (люди и животные)

• Космическое облучение при космических полетах

Сейфулла, Р.Д.

Карнозин - антиоксидант

• Повышает выносливость при анаэробных нагрузках

• Сокращает время отдыха

• Увеличивает общую рабочую мощность тренировок

• Вышеперечисленные качества объясняют широкое распространение карнозина в бодибилдинге и спортивном питании.

•

Немедицинские применения антиокислителей

Пищевая промышленность (консерванты)

• Аскорбиновая кислота (E300) и токоферолы (E306), а также синтетические антиоксиданты, такие как пропилгаллат (E310), третичный бутилгидрохинон (TBHQ), бутилгидроксианизол (E320) и бутилгидрокситолуол (E321)

• Добавляют в масло, молоко и др.

• Также добавляют в косметические изделия (крема)

• Защита топлива от окисления

Быть или не быть?