目的基因的克隆 — pcr 法扩增目的基因片断

二零零二年七月第 1 页 / 共 8 页

黄旭、黄晨辉

目的基因的克隆— PCR 法扩增目的基因片断

PCR(Polymerase Chain Reaction) ，聚合酶链式反应 ,模拟了发生在细胞内的 DNA 复制的过程


黄旭、黄晨辉

DNA的结构（ 1）三磷酸核糖核苷 NTP

三磷酸脱氧核糖核苷 dNTP

三磷酸双脱氧核糖核苷 ddNTP


黄旭、黄晨辉

DNA的结构（ 2）A 腺嘌呤

G 鸟嘌呤

C 胞嘧啶

U 尿嘧啶

T 胸腺嘧啶

五种碱基

A-T C-G


黄旭、黄晨辉

DNA的结构（ 3）

氢键维持了 DNA 的双螺旋结构


黄旭、黄晨辉

DNA的复制（ 1）

3’-OH 进攻 5’- Pi

DNA 聚合酶催化

DNA 的延伸方向 :5‘->3’


黄旭、黄晨辉


DNA 复制相关蛋白在复制起始点打开双链 DNA

然后 DNA 解链酶结合到单链 DNA 上进一步解开双链 DNA


黄旭、黄晨辉



黄旭、黄晨辉

DNA的复制和体外的模拟模板（母链）细胞内源外源加入

打开双链解链酶加热变性

维持单链单链结合蛋白高温

引物引物合成酶外源加入

底物 dNTP 细胞内源外源加入

聚合酶细胞内源外源加入

反应环境细胞内环境缓冲液


黄旭、黄晨辉

PCR循环 --变性


黄旭、黄晨辉

PCR循环—退火


黄旭、黄晨辉

PCR循环—延伸


黄旭、黄晨辉

PCR整个过程


黄旭、黄晨辉

讨论 1：为何酶促反应需要那么高的温度为了确保模板是单链，尤其是第一次反应的模板

防止非特异性的引物退火延伸的温度必须大于退火温度，而小于变性温度 DNA 聚合酶不能热变性，所以选用耐高温的聚合酶

常规用的 PCR DNA 聚合酶是从一种嗜热细菌分离出来的DNA 聚合酶。酶活性在 100 0C 条件下，能保持几个小时。而其最适合酶促温度在 72 0C 左右。


黄旭、黄晨辉

讨论 2：影响 PCR质量的一些因素模板 : 选用纯度较高的 DNA 作模板，杂质蛋白和 RNA 的

存在都会影响到 DNA 聚合酶与引物和模板的结合。目的片断：目的片断或者目的片断相邻的 DNA 含 GC 量较高，或者有重复序列存在，都会导致二级结构的存在。可在反应体系里加入 DMSO ，破坏模板的二级结构。引物的设计：引物太短，要求退火的温度就低，错配的可能性就大，再者，两条引物不能存在较长的互补片断。酶：纯度、可信度，碱基错配率 <1/10000 。


黄旭、黄晨辉

讨论 3： PCR的应用

从蓝藻里面克隆 SOD

(超氧化物歧化酶 )

清除人体内细胞中自由基

抗氧化、抗辐射、消炎、抗衰老、抗癌

高压氧中毒、肺气肿、糖尿病、早衰

食品、保健品、药品、化妆品

基因库检索 SOD 的序列设计引物以蓝藻总 DNA位模板做 PCR获得的基因片断连接在表达载体原核表达蛋白


黄旭、黄晨辉


检测粉末样品是否含

有炭疽杆菌

炭疽菌恐慌，降临美国，席卷全球

生命力强、传染快、发作快、死亡率高。

有两对引物是根据编码炭疽杆菌 EF 因子的基因序列设计的，仅与各种炭疽杆菌的 EF 因子同源。 PCR产物是 1247bp 和208bp 的片断。非炭疽杆菌均呈阴性。

用营养肉汤培养 2 小时取培养液直接作 PCR


黄旭、黄晨辉


基因测序

基因组计划首要任务就是测序

Sanger 双脱氧法

ddATP-绿色荧光

ddTTP-红色荧光

ddCTP-蓝色荧光

ddGTP-橙色荧光


黄旭、黄晨辉


基因测序


黄旭、黄晨辉

实验步骤：1.取一个干净 PCR专用小管

2.往 PCR管里面加入各种试剂

3.设定好机器各种参数

4. 开始 PCR

5.电泳检测 PCR 结果

无菌去离子水 34ul

10X PCR 缓冲液 5ul

dNTP混合液 4ul

Mg++溶液 3ul

引物 1 1ul

引物 2 1ul

模板基因组 DNA 1ul

rTag 聚合酶 1ul

目的基因的克隆 — pcr 法 扩增目的基因片断

Documents

目的基因的克隆 — pcr 法扩增目的基因片断