目的基因的 pcr 扩增 及其扩增产物的鉴定分析

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综合性设计性实验 -8. 目的基因的 PCR 扩增 及其扩增产物的鉴定分析. 此实验共包括如下六个部分 第一部分,目的基因选择 第二部分, PCR 引物设计 第三部分, PCR 实验操作 第四部分, PCR 产物电泳鉴定 第五部分, PCR 产物测序鉴定 第六部分,目的基因序列变异分析. 第一部分,目的基因选择. 候选基因简介. 在本实验中,有三个候选基因,分别是 NGAL , Fascin 和 Ezrin 。 这三个基因在食管癌及其他多种肿瘤中呈过表达,说明它们在肿瘤的发生发展中起重要的生物学作用。 - PowerPoint PPT Presentation

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目的基因的 PCR 扩增及其扩增产物的鉴定分析

综合性设计性实验 -8

此实验共包括如下六个部分

1. 第一部分,目的基因选择

2. 第二部分, PCR 引物设计

3. 第三部分, PCR 实验操作

4. 第四部分, PCR 产物电泳鉴定

5. 第五部分, PCR 产物测序鉴定

6. 第六部分,目的基因序列变异分析

第一部分,目的基因选择

候选基因简介

在本实验中,有三个候选基因,分别是 NGAL , Fascin 和 Ezrin 。

这三个基因在食管癌及其他多种肿瘤中呈过表达,说明它们在肿瘤的发生发展中

起重要的生物学作用。

汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组曾对这三个基因进行

了深入研究,在国外杂志上发表 SCI 收录研究论文 20 余篇,已形成系列优势。

同学们可查阅相关资料,选择感兴趣的基因来做 PCR 实验。

NGAL ( neutrophil gelatinase-associated lipocalin )即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载

蛋白,是脂质运载蛋白( lipocalin) 家族的一个成员。

NGAL 基因的蛋白产物具有保护调节基质金属蛋白酶 -9 的活性,作为小分子铁配合物

结合蛋白参与机体铁代谢和天然免疫反应等功能。另外, NGAL 作为一种早期标志物

还可以帮助判定缺血性肾损伤程度。

NGAL 的 mRNA 信息在 NCBI 核酸数据库中有来自不同实验室登记的多个版本,包含

完整编码区的有 BC033089 和 NM_005564 等,编码区长为 597 bp ,编码 198 个氨基酸,

包含了 N 端前部长为 20 个氨基酸的信号肽序列(为核酸序列的 1-60 bp )。

NGAL 基因

NGAL 核酸编码区序列及其相应的蛋白序列:

前 20 个 AA 为信号肽序列

2001 年汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组以永生化食管上皮细胞系 SHEE 和食管癌细胞系 SHEEC 互为对照,用 cDNA 微列阵进行筛选,用 RNA 印迹和 RT-PCR 进行鉴定, cDNA 克隆测序后与 GenBank 进行 BLAST 分析比较。结果表明NGAL 基因在 SHEEC 中出现显著差异过表达,其 cDNA 序列与小鼠 24p3 、大鼠 NRL (n

eu-related lipocalin) 和人中性粒细胞 NGAL 具有较高的相似性。这提示 NGAL 基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中可能发挥着重要作用,可能是一种新的癌基因或促癌基因。

A

B

利用 cDNA 芯片筛选两种细胞的差异表达基因

A. 永生化食管上皮细胞系 SHEE

B. 食管癌细胞系 SHEEC

A B C

反转录 PCR检测 NGAL 在两种细胞的 mRNA

水平A. 永生化食管上皮细胞系 SHEE

B. 食管癌细胞系 SHEEC

C. 100 bp DNA marker

Fascin 蛋白的 mRNA全长为 2767bp ,由 5‘ 端非翻译区 111bp碱基, 3’ 端非翻译区 1

174bp碱基, 1482bp 的全编码序列区和 6 个 PloyA 信号肽组成,编码 493 个氨基酸,

分子量约为 55kD 。

Fascin 蛋白定位于细胞质张力纤维和细胞膜皱褶 (ruffles) ,边缘的丝状伪足 (filopodia) 、

微棘 (microspikes) 的核心肌动蛋白束中。

以往研究发现, Fascin 基因在许多上皮来源的肿瘤细胞系,如宫颈癌 Hela 、胃癌 AG

S 、大肠癌 LM1215 和 SW480 、胰腺癌 BxPC3 和 T3H4 等细胞系中均上调表达。

细胞的丝状伪足和微棘与细胞的运动,癌细胞的转移有密切关系,提示 Fascin 蛋白可

能在细胞迁移、细胞粘附以及细胞间信息交流等过程中发挥作用。

Fascin 基因

ATGACCGCCAACGGCACAGCCGAGGCGGTGCAGATCCAGTTCGGCCTCATCAACTGCGGCAACAAGTACCTGACGGCCGAGGCGTTCGGGTTCAAGGTGAACGCGTCCGCCAGCAGCCTGAAGAAGAAGCAGATCTGGACGCTGGAGCAGCCCCCTGACGAGGCGGGCAGCGCGGCCGTGTGCCTGCGCAGCCACCTGGGCCGCTACCTGGCGGCGGACAAGGACGGCAACGTGACCTGCGAGCGCGAGGTGCCCGGTCCCGACTGCCGTTTCCTCATCGTGGCGCACGACGACGGTCGCTGGTCGCTGCAGTCCGAGGCGCACCGGCGCTACTTCGGCGGCACCGAGGACCGCCTGTCCTGCTTCGCGCAGACGGTGTCCCCCGCCGAGAAGTGGAGCGTGCACATCGCCATGCACCCTCAGGTCAACATCTACAGCGTCACCCGTAAGCGCTACGCGCACCTGAGCGCGCGGCCGGCCGACGAGATCGCCGTGGACCGCGACGTGCCCTGGGGCGTCGACTCGCTCATCACCCTCGCCTTCCAGGACCAGCGCTACAGCGTGCAGACCGCCGACCACCGCTTCCTGCGCCACGACGGGCGCCTGGTGGCGCGCCCCGAGCCGGCCACTGGCTACACGCTGGAGTTCCGCTCCGGCAAGGTGGCCTTCCGCGACTGCGAGGGCCGTTACCTGGCGCCGTCGGGGCCCAGCGGCACGCTCAAGGCGGGCAAGGCCACCAAGGTGGGCAAGGACGAGCTCTTTGCTCTGGAGCAGAGCTGCGCCCAGGTCGTGCTGCAGGCGGCCAACGAGAGGAACGTGTCCACGCGCCAGGGTATGGACCTGTCTGCCAATCAGGACGAGGAGACCGACCAGGAGACCTTCCAGCTGGAGATCGACCGCGACACCAAAAAGTGTGCCTTCCGTACCCACACGGGCAAGTACTGGACGCTGACGGCCACCGGGGGCGTGCAGTCCACCGCCTCCAGCAAGAATGCCAGCTGCTACTTTGACATCGAGTGGCGTGACCGGCGCATCACACTGAGGGCGTCCAATGGCAAGTTTGTGACCTCCAAGAAGAATGGGCAGCTGGCCGCCTCGGTGGAGACAGCAGGGGACTCAGAGCTCTTCCTCATGAAGCTCATCAACCGCCCCATCATCGTGTTCCGCGGGGAGCATGGCTTCATCGGCTGCCGCAAGGTCACGGGCACCCTGGACGCCAACCGCTCCAGCTATGACGTCTTCCAGCTGGAGTTCAACGATGGCGCCTACAACATCAAAGACTCCACAGGCAAATACTGGACGGTGGGCAGTGACTCCGCGGTCACCAGCAGCGGCGACACTCCTGTGGACTTCTTCTTCGAGTTCTGCGACTATAACAAGGTGGCCATCAAGGTGGGCGGGCGCTACCTGAAGGGCGACCACGCAGGCGTCCTGAAGGCCTCGGCGGAAACCGTGGACCCCGCCTCGCTCTGGGAGTACTAG

MTANGTAEAVQIQFGLINCGNKYLTAEAFGFKVNASASSLKKKQIWTLEQPPDEAGSAAVCLRSHLGRYLAADKDGNVTCEREVPGPDCRFLIVAHDDGRWSLQSEAHRRYFGGTEDRLSCFAQTVSPAEKWSVHIAMHPQVNIYSVTRKRYAHLSARPADEIAVDRDVPWGVDSLITLAFQDQRYSVQTADHRFLRHDGRLVARPEPATGYTLEFRSGKVAFRDCEGRYLAPSGPSGTLKAGKATKVGKDELFALEQSCAQVVLQAANERNVSTRQGMDLSANQDEETDQETFQLEIDRDTKKCAFRTHTGKYWTLTATGGVQSTASSKNASCYFDIEWRDRRITLRASNGKFVTSKKNGQLAASVETAGDSELFLMKLINRPIIVFRGEHGFIGCRKVTGTLDANRSSYDVFQLEFNDGAYNIKDSTGKYWTVGSDSAVTSSGDTPVDFFFEFCDYNKVAIKVGGRYLKGDHAGVLKASAETVDPASLWEY

Fascin 基因的编码区序列

Fascin 基因的蛋白序列

Fascin 蛋白的三级结构:由 4 个 β- 三叶草结构组成,含多个 β折叠

我们课题组发现,在永生化食管上皮细胞 SHEE向食管癌细胞 SHEEmt 的恶性转化中,

Fascin 基因呈现上调表达,并且在食管癌组织中也检测到 Fascin 蛋白呈阳性表达。

Fascin 在食管癌中的具体功能以及过表达的机制至今仍没有得到很好的阐明。为此我们

设计并合成了靶向 Fascin 基因的 siRNA ,试图通过 RNA干扰的方法减少 Fascin 基因

的表达,从而探讨 Fascin 对肿瘤的分化、分裂增殖和浸润等生物学行为的影响。

扫描电镜结果显示抑制 Fascin 表达后, EC109 细胞突触形成明显减少。

细胞免疫荧光结果显示代表 Fascin 蛋白的绿色荧光在被干扰细胞( A )中要比对照细胞( B )的弱

A B

Ezrin 基因

Ezrin 为 ERM ( Ezrin,radixin,moesin )蛋白家族成员之一, ERM 家族成员大多位于丝状

突和膜伸展部位,基本功能就是将肌动蛋白栓系到细胞膜和将膜蛋白锚定在特定的部位,这

样可维持细胞膜表面的一些特殊结构,如微绒毛和细胞膜突起等。

ERM 家族蛋白还参与细胞表面粘附分子的定位,通过细胞与细胞、细胞与基质之间的相互

作用参与细胞粘附作用降。

ERM 家族蛋白还是酪氨酸激酶的受体,并通过 Rho-GTP 酶参与信号转导。

Ezrin 含有 585 个氨基酸,等电点为 6.15 ,理论分子量为 69kD 。 Ezrin 分子带有大量电荷

( 38.5% 的氨基酸残基带电荷),这可能是导致它的理论分子量与实际分子量不同的原因

( Ezrin 实际分子量为 80kD )。

Ezrin 定位与染色体 6q25.2-q26 , DNA 长度为 1761 个碱基,含 13 个外显子。

ATGCCGAAACCAATCAATGTCCGAGTTACCACCATGGATGCAGAGCTGGAGTTTGCAATCCAGCCAAATACAACTGGAAAACAGCTTTTTGATCAGGTGGTAAAGACTATCGGCCTCCGGGAAGTGTGGTACTTTGGCCTCCACTATGTGGATAATAAAGGATTTCCTACCTGGCTGAAGCTGGATAAGAAGGTGTCTGCCCAGGAGGTCAGGAAGGAGAATCCCCTCCAGTTCAAGTTCCGGGCCAAGTTCTACCCTGAAGATGTGGCTGAGGAGCTCATCCAGGACATCACCCAGAAACTTTTCTTCCTCCAAGTGAAGGAAGGAATCCTTAGCGATGAGATCTACTGCCCCCCTGAGACTGCCGTGCTCTTGGGGTCCTACGCTGTGCAGGCCAAGTTTGGGGACTACAACAAAGAAGTGCACAAGTCTGGGTACCTCAGCTCTGAGCGGCTGATCCCTCAAAGAGTGATGGACCAGCACAAACTTACCAGGGACCAGTGGGAGGACCGGATCCAGGTGTGGCATGCGGAACACCGTGGGATGCTCAAAGATAATGCTATGTTGGAATACCTGAAGATTGCTCAGGACCTGGAAATGTATGGAATCAACTATTTCGAGATAAAAAACAAGAAAGGAACAGACCTTTGGCTTGGAGTTGATGCCCTTGGACTGAATATTTATGAGAAAGATGATAAGTTAACCCCAAAGATTGGCTTTCCTTGGAGTGAAATCAGGAACATCTCTTTCAATGACAAAAAGTTTGTCATTAAACCCATCGACAAGAAGGCACCTGACTTTGTGTTTTATGCCCCACGTCTGAGAATCAACAAGCGGATCCTGCAGCTCTGCATGGGCAACCATGAGTTGTATATGCGCCGCAGGAAGCCTGACACCATCGAGGTGCAGCAGATGAAGGCCCAGGCCCGGGAGGAGAAGCATCAGAAGCAGCTGGAGCGGCAACAGCTGGAAACAGAGAAGAAAAGGAGAGAAACCGTGGAGAGAGAGAAAGAGCAGATGATGCGCGAGAAGGAGGAGTTGATGCTGCGGCTGCAGGACTATGAGGAGAAGACAAAGAAGGCAGAGAGAGAGCTCTCGGAGCAGATTCAGAGGGCCCTGCAGCTGGAGGAGGAGAGGAAGCGGGCACAGGAGGAGGCCGAGCGCCTAGAGGCTGACCGTATGGCTGCACTGCGGGCTAAGGAGGAGCTGGAGAGACAGGCGGTGGATCAGATAAAGAGCCAGGAGCAGCTGGCTGCGGAGCTTGCAGAATACACTGCCAAGATTGCCCTCCTGGAAGAGGCGCGGAGGCGCAAGGAGGATGAAGTTGAAGAGTGGCAGCACAGGGCCAAAGAAGCCCAGGATGACCTGGTGAAGACCAAGGAGGAGCTGCACCTGGTGATGACAGCACCCCCGCCCCCACCACCCCCCGTGTACGAGCCGGTGAGCTACCATGTCCAGGAGAGCTTGCAGGATGAGGGCGCAGAGCCCACGGGCTACAGCGCGGAGCTGTCTAGTGAGGGCATCCGGGATGACCGCAATGAGGAGAAGCGCATCACTGAGGCAGAGAAGAACGAGCGTGTGCAGCGGCAGCTGCTGACGCTGAGCAGCGAGCTGTCCCAGGCCCGAGATGAGAATAAGAGGACCCACAATGACATCATCCACAACGAGAACATGAGGCAAGGCCGGGACAAGTACAAGACGCTGCGGCAGATCCGGCAGGGCAACACCAAGCAGCGCATCGACGAGTTCGAGGCCCTGTAA

Ezrin 的编码区序列

Ezrin 蛋白含有四个功能域

名称 起始 终点 功能

FERM_N 9 86

将胞浆蛋白连接到膜上FERM_M 88 206

FERM_C 210 299

ERM 338 586 结合胞浆蛋白

我们课题组发现 Ezrin 在食管癌及切缘食管粘膜组织中的位置分布有胞膜分布、胞浆分

布和胞膜胞浆混合分布等三种模式。恶性程度越高的癌细胞越易具有胞浆分布模式,说

明 Ezrin 细胞定位的变化可能在食管癌的发生发展过程中发挥重要作用。

第二部分, PCR 引物设计

引物决定了 PCR 产物的长度和特异性。目前有多种引物设计软件,如 primer premier5 、

Oligo 和北京军事医学科学院李伍举教授开发的 Biosun 等, Internet 免费引物设计网站有

primer 3 , Primerfinder 等。

引物设计有以下几个原则:

( 1)引物的特异性。引物应根据目的序列进行设计,引物与非靶序列之间不要超过

70%的同源性或连续 8 个的碱基互补,减少非特异产物;

( 2)引物的长度。一般指引物中能与模板序列互补结合的部分,不包括在 5‘端额

外增加的酶切位点序列和其他序列。引物长度以 18~24 bp为佳。

( 3 )引物 3’末端的碱基。引物 3’末端是延伸的始端,碱基错配会影响延伸效率。当最后一

个碱基是 A时,容易发生错配,所以引物 3’末端最好不要为 A;

( 4 )引物的 G+C 含量一般为 40%~ 60%,过高或过低都不利于引发反应;

( 5 )两条引物不能形成稳定的二聚体,或引物自身不能形成稳定的二级发夹结构,这些都

会影响引物与模板的结合。

( 6 )两条引物的融解温度 Tm值尽量不要相差太大,引物的 Tm值粗略计算公式为 Tm = 4

( G+C ) +2 ( A+T );

( 7 )引物的 5' 端对扩增特异性没有影响,因此可以被修饰而不影响扩增的特异性,引物 5′

端修饰包括加酶切位点、标记生物素和荧光等,引物 3' 端是延伸的开始,不能进行任

何修饰。

可通过两个方法将序列输入软件中

在表中粘贴序列

打开原有的序列文件

选择序列文件所在位置

在对话框中输入待扩增序列

点击左上角的“ Primer”按钮

Hairpin: 引物自身是否会形成发夹结构 Dimer: 同一种引物是否会形成二聚体 False primiring: 引物在待扩增序列中其他位置是否有配对 Cross Dimer: 正向与反向引物间是否会形成二聚体

引物设计界面

正向和反向引物的互换

正向和反向引物的评价

正向和反向引物的信息

每点击左边红色的按钮,就出现相应的内容

对正向和反向引物进行编辑

可对引物进行增加或减少碱基

用键盘输入了 5个碱基

引物的信息

改动后引物的信息

重新回到双引物的界面

“Edit”-“ Copy”-“ Sense Primer”

5' CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 3'

输出引物序列

了解并掌握 PCR 基因扩增的基本原理

熟悉 PCR 基因扩增技术的具体操作过程

实验目的

第三部分, PCR 实验操作

一、概述

PCR :使用一对寡核苷酸引物,以目的序列为模板,利用 DNA 合成 酶和四种脱氧核糖

核酸进行 DNA 的体外合成反应。

PCR技术具有灵敏度高,特异性高、操作方便和重复性好等特点,能够在几个小时内获

得多达几百万拷贝的目的基因。

该技术在上个世纪 80 年代中期由美国 K.Mullis 发明建立,经过近二十年已发展成包括

多种衍生技术,在很多领域中广泛使用, K.Mullis也因此获得 1993 年度的诺贝尔化学奖。

二、 PCR 基本原理 DNA 在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖核酸聚合过程,是 DNA聚合酶、

DNA连接酶、引发酶、 RNA 引物、四种脱氧核糖核酸、 DNA超螺旋酶、离子环境等多成份参与的过程。

PCR 是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的 DNA复制,所以在一个 PCR 中必需成分是

1. 模板 DNA

2. DNA聚合酶

3. 四种脱氧核糖核酸

4. 正向和反向两条引物

5. 适当的缓冲体系。

模板序列:待扩增的 DNA 序列,一般为双链的 DNA 可包括线形双螺旋 DNA ,如

基因组 DNA ,及闭环双链 DNA ,如质粒;

模板的来源很广,如从细胞 / 细菌中提取基因组 DNA 、提取mRNA经反转录得到

cDNA 、质粒、病毒等;

每个反应中模板的量为 1 ng~ 1 μg 。质粒 DNA 和纯化的 DNA 的量可少一些,而

基因组 DNA 的量应多一些。

PCR灵敏度很高,所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染,否则会导致 PC

R 的非特异性扩增。

1 、模板 DNA

引物( primer )也称为寡核苷酸引物,常规的 PCR 反应需要两种引物,分别成为 5′ 端

引物和 3’ 端引物,或称为正向引物和反向引物。

通常 DNA 及 mRNA 序列的写法为 5′→3′ ,所以 5′ 端引物与目的序列的 5′末端序列相同,

而 3′ 端引物与目的序列的 3′末端序列反向互补。

2、引物

它们作为 DNA扩增的起始部分,能限定待扩增 DNA序列的长度。

为了保证扩增的特异性和有效性,引物与模板相匹配部分应至少有 15~ 18 bp。

5′

5′

3′

3′5′

5′

3′

3′

上游引物

下游引物

DNA聚合酶:以 DNA 为模板,以脱氧核糖核酸为底物催化合成新的 DNA 的一种酶。

早期的 PCR 反应使用的 DNA聚合酶为大肠杆菌 DNA聚合酶 I 的 Klenow片段。但该酶在

高温下容易失活,需要在每次合成反应进行时候再加入一份酶。

随着新的耐热 DNA聚合酶的发现及在 PCR 反应中的应用,使 PCR 操作更方便,产量更稳

定。

目前商品化的 DNA聚合酶有 Taq DNA聚合酶和 Pfu DNA聚合酶。

Taq DNA聚合酶最适工作温度为 75-80℃。该酶具有 5′→3′聚合酶活性,在镁离子存在情

况下可催化核苷酸沿 5′→3′方向发生聚合反应。

3 、 DNA聚合酶

4、脱氧核糖核酸

四种脱氧核苷三磷酸即 dATP 、 dTTP 、 dCTP 和 dGTP ,为 PCR 反应中 DNA 合成

原料。

在新的一个反应体系中,这四种脱氧核糖核酸的起始浓度应该都相等,如果其中一种

的浓度明显不同于其他的就会诱发错配,并降低新链合成速度。

缓冲液提供 PCR 反应所必需的合适酸碱度与离子环境。主要成分有 KCl 、 Tri

s-Cl 和 MgCl2 。

其中 Mg2 +的浓度最重要,它能影响 DNA聚合酶的活性,以及模板与 PCR 产

物的解链温度。

5、缓冲液

1. 变性:是指模板的热变性,双螺旋模版 DNA 成为单链的 DNA 分子;在应用 Taq DNA

聚合酶进行 PCR 反应时,变性往往在 94℃~ 95℃条件下进行。这也是 Taq DNA聚合

酶进行 30 个左右的 PCR循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。

2. 退火:是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物

的熔解温度低 5~ 10℃, PCR 实验要对退火温度进行优化。

二、 PCR 基本步骤

3. 延伸:在镁离子存在条件下, DNA聚合酶按碱基互补原则,催化四种脱氧核糖核酸

加在引物的 3′ 端,使引物沿 5′→3′方向生成与模版 DNA 互补的新 DNA链。

双链模版 DNA

变性

退火

5′3′

5′ 3′

5′

5′ 3′

3′

5′

5′

3′

3′5′

5′

3′

3′

上游引物

下游引物

延伸 3′

5′

5′

3′

3′

5′

5′ 3′

多次循环

( 2n 拷贝)

下面为一个典型的 PCR循环参数设置:

备注: * 比两条引物的 Tm值低 5~10℃。

94 5 min ℃

94 30 s ℃

X * 30 s ℃

72 1 kb/min ℃

72 5 min℃

25-35个循环

三、影响 PCR 因素

虽然 PCR 操作很方便,但影响因素也很多,从而影响 PCR 的特异性和高效性。

1. 引物

2. 变性温度和时间

3. 退火温度和时间

4. 延伸温度和时间

5. 循环次数

引物决定了 PCR 产物的长度和特异性。

引物的设计要求请看本实验讲义“引物设计”部分。

1、引物

在 PCR 反应刚开始时,为保证作为模板的双链 DNA 完全变性成单链 DNA ,一般设为

95℃、 5 min;在随后的循环中,可设为 95℃、 30s 。

有些模板 DNA 的 G+C 含量较高,变性温度就越高。太高的变性温度和太长的变性时

间会影响 DNA聚合酶的活性。

2、变性温度和时间

退火温度与引物的 Tm值相关,一般比 Tm值低 5~10℃。

退火温度设置过低,会导致非特异性扩增;退火温度过高,则影响引物与模板的结合

而降低 PCR效率。

在退火时间里,引物与模板相结合,时间太短会使引物与模板未完全结合而导致无法

延伸;时间过长容易产生引物在模板上的非特异性结合或形成引物二聚体。退火时间

设置为 30s 基本上就足够了。

3、退火温度和时间

所用 DNA聚合酶的最佳活性温度决定了延伸温度,如 Taq聚合酶的最佳温度为 7

0~ 80 度,所以延伸温度设为 72℃即可。

在实践中 Taq DNA聚合酶的延伸效率约为 500 bp/30 s ,若待扩增的片段较长,可

适当延长时间,但时间过长又会致非特异性扩增。

4、延伸温度和时间

在经过一定的循环次数后,随着聚合酶活性的降低,引物浓度降低等因素, PCR 产

物不再呈指数增加,此时称为平台效应。

循环次数设为 25~30次,即可满足一般的分子生物学实验要求。过多的循环次数会

导致碱基错配增加和非特异性扩增的出现。

5、循环次数

1. DNA模板:以 pPIC9-NGAL 为模板,来扩增不包含信号肽序列的 NGAL 编码区

2. 引物:

PCR 上游引物( P1 ): 5′-CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA -3′

PCR 下游引物( P2 ): 5′-CGGAATTCTCAGCCGTCGATACACTGGTC -3′

底下有横线的碱基为酶切位点: XholI (P1) , EcoRI(P2)

3. 2×Taq PCR Master Mix (广州佰路生物科技有限公司生产,产品成份为:

0.1 U Taq DNA Polymerase/ml

500 mM dNTP each

50 mM Tris-HCl (pH8.7)

20 mM KCl

4 mM MgCl2

4. 无菌水

5. 100bp plus ladder DNA marker

本实验所用试剂

实验操作

95℃ 2min

94℃ 30s

60℃ 30s

72℃ 30s

72℃ 5min

30 个循环

1. 按以下次序将各成分加 PCR 管中。

2×Taq PCR MasterMix 5 µl

P1 (12.5 µM ) 1 µl

P2 (12.5 µM) 1 µl

无菌水 2 µl

pPIC9-NGAL 1 µl

反应体系: 10 µl混匀,稍加离心并标记。

2. PCR 反应于 ABI 2720 Thermer cycler 进行, PCR 反应条件:

凝胶准备

① 称 1g琼脂糖置三角瓶中,加 100ml 1×TAE;

② 微波炉加热大约 2 分钟,熔化琼脂糖;

③ 熔化的琼脂糖自然冷却到 60~ 70℃时,加入 EB 5μl ,并轻轻混匀。

胶床准备

① 将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内,梳齿底端和床面有 1mm 的间隙;

② 将胶床放在调整好的水平台上;

铺胶:将冷却致 60℃的凝胶倒入准备好的胶床内,凝胶厚度约 5 mm;

室温下静置 30 分钟左右,凝胶固化。将带凝胶 的胶床置于电泳槽中,并使样品

孔位于电场负极;

第四部分, PCR 产物电泳鉴定

向电泳槽中加入 1×TAE 电泳缓冲液,越过凝胶表面即可;

轻轻拔出固定在凝胶中的梳子;

样品准备:向核酸样品中加入约为样品体积 1/6 的上样缓冲液,用加样器轻轻混匀

上样:用加样器吸取样品,轻轻的加入到凝胶的样品孔中,加样量为 10μl

盖上电泳槽,接通电源,开始电泳;

电泳条件:电压 80v;时间 20~ 25 分钟;

电泳结束后,切断电源,取出凝胶;

电泳结果分析:

① 紫外检测仪直接观察电泳条带

② 摄影记录

琼脂糖凝胶电泳预期结果:

500 bp560 bp

PCR 产物的直接测序:从琼脂糖凝胶中回收 PCR 产物后测序。

PCR 产物连接到载体后测序:从琼脂糖凝胶中回收 PCR 产物,利用连接酶将 PC

R 产物连接到载体如 pGEM-T 后,转化大肠杆菌提取质粒后测序。

美国应用生物系统公司 3130 基因分析仪

24 小时无人监控操作

仪器设置更方便更简单

新型自动灌胶系统进行灌胶

检测池加热器改进了温度控制

通过 96 孔和 384 孔板自动进样

多色荧光检测

第五部分, PCR 产物测序鉴定

观看测序结果的软件 Chromas

软件运行界面

打开一个测序结果

峰型排列良好,无高大杂峰,说明测序结果可靠

将测序结果输出为文本文件

虽然现在的 PCR技术使 PCR 扩增有很高的真实性,即 PCR 产物与模板 DNA 的一致

性很高,但由于 PCR 扩增毕竟是在试管内进行的 DNA复制,没有类似细胞内 DNA

错配修复机制,所以,在 PCR 产物扩增以后,仍要分析其与模板 DNA 的是否完全一

致。最好的方法是将 PCR 产物测序,将测序结果与数据库作序列比对分析。

第六部分,目的基因序列变异分析

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

核酸序列比对

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

BLAST 分析界面

输入测序结果

结果界面之一

结果界面之二