荧光定量 PCR 技术在临床检测中的应用

中山大学 中山医学院生物化学教研室

达安基因股份有限公司首席科学家

朱振宇 医学博士、教授、博士生导师

Tel ： 13922430138 ， 020 － 37656430

九十年代中期 PCR 临床应用在国内全面展开1998 年 荧光定量 PCR 技术开始在中国应用于临床检测

PCR 发展简史

PCR (Polymerase Chain Reaction)

1983 Cetus 公司的 Kary Mullis 于 12 月 16 日第一 次成功实验发明了 PCR

1985 关于 PCR 的文章首次由 Kary Mullis 及其同事等人 在《 S

cience 》上 发 表1989 12 月《 Science 》杂志将 PCR 和它所使用的 Taq DNA 聚合

酶命名为第一个“年度分子”。1993 Kary Mullis ， Nobel Prize in Chemistry

1995 Perkin Elmer 公司研制出荧光定量 PCR 技术

循环次数 DNA 的链数 1 　 21 2

2 　 22 4

3 　 23 8

10 　 210 1024

20 　 220 1,048,576

30 230 1,073,741,824 10 亿

PCR 循环次数与 DNA 产量关系

PCR 循环

PCR 特点：高效扩增、忠实复制

• 灵敏度高• 快捷• 简便• 对样品纯度要求低• 可以相对定量

PCR 反应的特点

Ct 值的意义

Ct 值与重复性同一样本在相同条件下同时进行 96 次

扩增

FQ-PCR

Ct 值与浓度不同的模板达到荧光域值时的 Ct

值不同

感染性疾病的诊断 感染性疾病的诊断 母婴传播的控制与观察 母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断 遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断 肿瘤的诊断 法医学鉴定法医学鉴定

荧光定量 PCR 的临床应用

早期诊断 早期诊断 病情评估和预后判断 病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导 抗病毒药物疗效的观察、指导 新药验证新药验证

一 感染性疾病

　 1. 病原体含量与病情之间的关系

　 2. 病原体含量与用药之间的关系

　 3. 药物及疗法的研究与开发

　 4. 新的病原体分子诊断标准

　 5. 新的愈后指标

　 6. 传染病发病的监控、预测与预防

临床应用

临床应用

二 肿瘤1. 肿瘤标志物：癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞

因子、受体等

2. 肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因

三 遗传病

1. 等位基因检测

2. 多基因遗传病的突变检测

3. 基因表达异常所致遗传病检测

荧光定量 PCR 在病原体检测中的应用

一 肝炎病毒定量检测

二 性病病原体检测

三 结核杆菌及呼吸道病原体检测

四 优生优育 (TORCH) 相关项目检测

临床应用

壹　肝炎病毒定量检测

HBV

HCV

临床应用

（一） 乙型肝炎病毒结构及特点HBsAg ：是 HBV 感染的主要标志HBsAb ：保护性抗体

HBcAg ：仅存于感染的肝细胞核内，　　　　一般不存在于血循环中HBcAb: 非保护性抗体， HBcAb-IgM

　　　　提示 HBV 处于复制状态

HBeAg ： HBV 复制及强感染性的指标HBeAb ：有一定的保护作用，预后良好

HBV

HBV

（二） HBV-DNA 与“两对半”

1. “1. “ 两对半” ：机体的免疫反应状态；两对半” ：机体的免疫反应状态；

2. “2. “ 携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能 携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能 反应体内病毒复制水平与感染程度。反应体内病毒复制水平与感染程度。

FQ-PCRFQ-PCR ：检测的是：检测的是 HBVHBV 本身的遗传物质—本身的遗传物质— DNADNA ，是，是 病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。

3. 血清学指标 ( － ) 不能排除 HBV 感染。

HBV

（二） HBV-DNA 与“两对半”

HBsAg( － ) 　HBV-DNA( ＋ )　　　　 　

HBeAg ( － )HBV-DNA( ＋ )

4. 4. 也可能出现也可能出现 HBsAg(HBsAg( ＋＋ )) ，， HBV-DNA(HBV-DNA( －－ )) 。。

5. HBsAb (5. HBsAb ( ＋＋ ) ) 、 、 HBcAb (HBcAb ( ＋＋ ) ) 、 、 HBeAb (HBeAb ( ＋＋ )) 三抗三抗体阳性 体阳性 与与 HBV DNA 2.5× HBV DNA 2.5× 103 copy /ml /ml 结果解释。结果解释。

HBV

( 三 ) 　 HBV-DNA 定量检测的临床意义

3. HBV-DNA 定量与预后　　　 a. 含量高者急性肝炎患者易慢性化 　　　 b. 癌变的几率明显高于含量低者

1. HBV-DNA 定量与 HBV 复制水平及传染性

2. HBV-DNA 定量与乙肝药物疗效 　 a. 专家提出 <103 copy /ml 做为阴性或临床治愈标准 b. HBV-DNA 定量分析与干扰素治疗 ( 前、中、后 )

c. 拉咪呋啶

HBV 感染与干扰素治疗

治疗前：

a: 治疗前 HBV 低水平复制者对干扰素的反应性明

显优于高水平复制者。

b: 治疗前 HBV DNA 含量特别高者大多没有疗效。

c: HBsAg 转阴的几乎都是那些治疗前血清 HBV

DNA 含量较低者。

HBV 感染与干扰素治疗

治疗中： a: a: 病毒复制水平迅速降低者，有望治愈。 b: b: 相反，治疗期间 HBV DNA 复制水平下降较慢， 或下降幅度较小，或者变化不明显者，大多是 干扰素治疗无效。

•HBV 感染与干扰素治疗

治疗后：• a: 治疗结束后，采用 PCR 定量法检测， HB

V

DNA <103 copy/ml 者，可能不再复发。 b: 终止治疗后 HBV DNA 仍保持较低水平者， 反跳的可能性较大。

ALT

Months after Start of Therapy

0

Normal Alt

治疗前1 2 3 4 5 6 12 24

HBV DNA

HBe Ag

HBs Ag

Poor Response to IFN TherapyPoor Response to IFN Therapy

CHRONIC HEPATITIS BCHRONIC HEPATITIS B

拉咪呋啶： 有显著降低高病毒载量作用，近期疗效

颇有优势，但是长期使用可导致 HBV 变异，患者易出现耐受性，而且容易出现停药后反弹。

HBV 感染与拉咪呋啶治疗

0 -20 -40 -60 -80

-100

治疗周数

拉米夫定

安慰剂

血清 HBV DNA; 中位 % 变化

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52

n=192 n=404

n=171 n=359

拉米夫定抑制血清拉米夫定抑制血清 HBV DNHBV DNAA

HBV

( 三 ) 　 HBV-DNA 定量检测的临床意义

4. HBV-DNA 定量有助于指导怀孕与孕期，哺乳期检查

5. 肝脏移植与 HBV-DNAMazzaferro 等报告： < 103copy /ml 无一例再发肝炎

>105copy /ml 发生了严重 HBV 再感染

6. 血液制品和献血员的筛选

病毒特点： 1. 单正链 RNA 病毒 2. E1 和 E2区基因高度变异性

（一）丙型肝炎病毒特点

HCV

感染特点：1. HCV 在血中含量极微 2. 输血后肝炎主要致病因子3. 免疫学标志仅有抗 -HCV ，非中和抗体，产生时间不一4. 有一部分人感染 HCV 后，不产生抗 -HCV

5. 感染易于慢性化 (50-85%)

6. 疫苗研制尚不成功

单链 RNA

( 二 ) 　 HCV-RNA 定量检测的临床意义

1. 早期诊断

a. 临床以 < 80 copy/ml 做为无感染或治愈标准。

b. HCV 感染 1-3W ，即可检出 HCV-RNA 的存在。 c. 严格筛选献血员 , 提高对窗口期感染者的检出率。 d. 医疗纠纷中的“举证倒置”，病人入院前后进行 HCV-

RNA 检测。

HCV

HCV

( 二 ) 　 HCV-RNA 定量检测的临床意义

2. HCV-RNA 载量与抗 -HCV滴度、 ALT 水平之间的相关性。　　　抗 -HCV滴度和 ALT 异常率随着 HCV-RNA 载量升高而增加。

3. HCV-RNA 是评价抗病毒治疗效果的重要指标。

4. 慢性丙型肝炎长期抗 -HCV阳性，这时如果进行 HCV-RNA 定量检测可以鉴别活动性、复制程度。

二　常见性传播疾病病原体一　淋球菌（ NGH ）二　沙眼衣原体（ CT ）三　解脲脲原体（ UU）四　梅毒螺旋体（ TP）五　单纯庖疹病毒（ HSV ）六　乳头瘤病毒（ HPV ）七　人类免疫缺陷病毒（ HIV ）八 EV71 A16 通用型

STD

艾滋病

艾滋病是英文 AIDS （ Acquired Immunity Deficiency Syndrome) 的中文译音，全称是“获得性免疫缺陷综合征”。它可以由人类免疫缺陷病毒（ HIV,Human-being Immunity Deficiency Virus ），又称艾滋病病毒引起的疾病。当病毒侵入人体后，经一段时间的潜伏期，破坏人体的免疫力，从而发病，病死率高，是一种严重的传染病。

艾滋病是一种有明确病原体的可通过人之间一定传播途径传播的慢性传染病，属于《传染病防治法》中规定的乙类传染病

HIV 病毒：多亚型和多变异HIV-1 和 HIV-2M 组、 O 组和 N 组亚性型： A-KCRF ：基因重组亚型，主要是 HIV-1 型毒株亚型监测的意义 不同亚型与不同传播途径的关系： B 主要通过男性同性性

行为和静脉注射吸毒传播， C 主要异性性接触传播 流行地理和传播线路的分析：东南亚区域的 C 亚型和 B

亚型 重组亚型传播效力变化及对流行的影响：东欧的 B/A 重

组流行、泰国的 A/E 重组

艾滋病病毒在外界的抵抗力HIV 病毒一旦离开宿主细胞在外界环境中生存能力

很快消失

HIV 对环境中的物理因素和化学因素抵抗力均较弱，比乙型肝炎病毒（ HBV ）的抵抗力低得多

对 HBV 有效得消毒和灭活方法均适用于 HIV

典型进展者： 8-10年潜伏期后成为艾滋病人， 80% -90%

快速进展者： CD4 细胞 2-5年内迅速下降， HIV 病毒载量一直维持较高水平，而且分离的 HIV 有均一性。

长期存活者（又称长期不进展者）：维持 15年以上，而且 CD4计数维持正常，在所有感染者中比例一般在 8%-10% 。

HIV 感染的三种结局

艾滋病的诊断HIV 感染者：确定 HIV 感染的个体 抗体检测：初筛和确认 辅助诊断

艾滋病病人：临床诊断标准见国家标准《 HIV/AIDS的诊断标准和防治原则》

GB16000-1995

荧光定量 PCR 的应用为艾滋病的初筛和辅助

检查提供了有力的工具

NGH

淋球菌感染与致病1. 人是淋球菌的惟一宿主。

2. 发病率最高，在所 STD 疾病中，高达 60% 左右。

3. 发病趋势： a. 男性多于女性。 b. 城市走向农村， c. 高收入阶层向低收入阶层扩展

4. 人对淋球菌感染无天然抵抗力，免疫不持 久，再感染和慢性患者普遍存在。

5. 如母亲为淋病患者，婴儿出生时易患上淋球菌性结膜炎

CT

沙眼衣原体感染与致病

1. 严格的细胞内寄生。

2. 不仅可致眼部感染、肺部感染、也是 STD 的主要 病原体。

3. 近年来在欧美等国，沙眼衣原体的感染率和危害 性已超过淋球菌而居 STD 之首。

4. 在我国，在非淋球菌性尿道炎中，居首位。

5. 泌尿生殖道感染，妨碍妊娠。

6. 盆腔感染，可致生殖能力损害。

UU

解脲脲原体感染与致病

1. 合成尿素酶，分解尿素

2. 在非淋球菌性尿道炎其感染率仅次于衣原 体感染，居第二位。

3. 流产超过 4 次以上者，检出率高达 80% 。

4. 有 30-40% 男性尿道炎是由感染 UU所致。

5. 与男性不育相关。男性不育患者精液中，脲原体检出率高达 66.6 ％。检出率随精子数减少和精子活动力下降而升高。

1. 非培养或形态学检查的诊断技术，快速、特异、敏感。

2. 对无症状或症状轻者，可以早期确诊。

3. 对 NGH 、 CT 、 UU 等混合感染者，诊断和鉴别诊断。

4. 指导用药、考核疗效。

荧光定量 PCR 诊断 NGH/CT/UU 的意义

NGH/CT/UU

NGH/CT/UU

荧光定量 PCR 诊断 NGH/CT/UU 的意义

5. 5. 不孕不育、优生优育。不孕不育、优生优育。

6. 6. 流行病学调查，为性传播疾病的监控提供依据。流行病学调查，为性传播疾病的监控提供依据。

7.7. CTCT 、、 UUUU 是是 FDAFDA批准的批准的 PCRPCR 检测试剂盒，可作为检测试剂盒，可作为

首选 首选

方法，在临床推广应用。方法，在临床推广应用。

人乳头瘤病毒感染与致病

1. HPV具有宿主和组织特异性，只能感染人的皮肤和黏膜上皮细胞，人是 HPV 的惟一宿主。

2. 有 100 多个型。

3. 低危型： HPV 6 、 11引起良性病变 (尖锐湿疣、喉乳头瘤等 )

HPV

人乳头瘤病毒感染与致病

HPV

4. 4. 高危型：高危型： HPV 16HPV 16 、、 1818引起恶性肿瘤 引起恶性肿瘤 ((宫颈宫颈癌癌、 、

肛门癌、口腔癌等肛门癌、口腔癌等 ))

5. 5. 免疫原性低，易形成持续性感染。免疫原性低，易形成持续性感染。

6. 6. 新生儿产道感染。新生儿产道感染。

HPV

1. 对典型病例可以明确诊断。2. 对临床表现和组织病理改变都不典型的病例同样可以做出诊断。

3. 对亚临床和隐性 HPV 感染做出诊断。4. 基因分型。5. 考核疗效与预后。6. 病毒载量与患癌症风险。

HPV

荧光定量 PCR 检测 HPV 的意义

HPV

手足口病（ hand-foot-mouth disease ， HFMD ）

为全球性传染病，世界大部分地区均有流行的报道。 1957 年在加拿大首次报告，新西兰 Seddon 于 1957 年最早

加以描述， 1958 年加拿大 Robinson 从患者粪便和咽拭中分离出 CoxA16 ，同时患者血清抗体有四倍增长 ,初步查明 CoxA16 为本病病原；

1959 年提出 HFMD 命名， HFMD 在全球广泛流行，无明显的地域分布。

之后世界各地均经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒和 EV 71引起的手足口病流行。

发热 , 不适 , 咽喉肿痛 , 口腔、手、脚侧面及掌心、屁股出现小泡

传染性极高

病程约 1周

HFMD 的病原 手足口病可由多种肠道病毒所引起，其中包括

CoxA5,A10, A16, A19, EV71,以及部分埃可病毒和柯萨

奇B组病毒 , 以CoxA16 和 EV71 最为常见 传播途径 : 粪 -口途径传播 : 唾液与粪便 ; 呼吸道传播 : 空气飞沫 ; 接触传播 疱疹液中含大量病毒，疱疹破溃后病毒排出。 HFMD为全球性传染病，在全球广泛分布，无明显的地域分布 , 但

近年 EV71在东南亚一带流行 , 引起较多的重症和死亡病例。 在 80年代和 90年代，中国手足口病的流行主要以

CoxA16为主， 2008年，CoxA16 和 EV71 共循环引起手

足口病爆发 , EV71在大部分省市为优势病毒。

人肠道病毒感染的一般致病机制人肠道病毒感染的一般致病机制进入途径进入途径 口腔口腔 // 呼吸道呼吸道 咽喉及下肠胃道咽喉及下肠胃道

传播传播扁桃体扁桃体、、深层淋巴结深层淋巴结、、肠道淋巴结肠道淋巴结

微病毒血症微病毒血症先天性感染先天性感染

神经系统神经系统心心脏脏肝脏肝脏、、胰脏、胰脏、肾上腺肾上腺

呼吸系统呼吸系统 皮肤及黏膜皮肤及黏膜

病毒血症病毒血症神经系统神经系统

抗体产生抗体产生、、病毒血症消失病毒血症消失，，病毒感染症状改善病毒感染症状改善

飞沫、接触、饮食飞沫、接触、饮食

肌肉肌肉

致病特点

①隐性感染多见，很少引起腹泻，婴幼儿、免疫力低下的成人易感。 ②病毒在机体肠道中增殖，很少引起肠道症状，是以消化道为原发灶的全身感染。③不同人肠道病毒可引起相同症状，同一种

人肠道病毒可引起不同临床表现。④感染过程中形成病毒血症。

中国 HFMD 的流行

1981 年，我国在上海首次报道了 HFMD 病例1987 年在中国分离到 CVA16

1995 年以来，我国陆续在武汉、深圳、上海、重庆、山东和安徽等地的 HFMD 患者中分离到 EV71 病毒。

2007 年，山东发生了手足口病爆发流行，累计报告 HFMD病例 39 ， 606例，其中 14例病例死亡。实验室检测发现 EV71 是引起山东临沂 HFMD 的主要病原，同时还检测到 Echo3 和 / 或 CVA16 。

2008 年全国出现 HFMD爆发流行 ,以 HEV71 为优势 ,CVA16还有其它 EV共循环引起

加强 HFMD 病原检测和监测的十分必要

依据台湾 1998-2008 和中国大陆 2007-2008 年的经验

掌握手足口病病原谱，特别是 EV71 感染所占的比例，对析

判断 HFMD 疫情导致重症和死亡的比例有重要的科学参考价值。

手足口病的实验室检测• 手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行基

因检测、抗原检测、血清学抗体检测、病毒分离和病毒鉴定，如果没有采到合格的临床标本，或无法进行实验室检测。

• 很多血清型的肠道病毒能引起手足口病，不同细胞系对不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同时期肠道病毒的流行株也不同。

• 通常用于肠道病毒分离的细胞系为 RD 、 HEp-2 、 Vero等，联合使用上述的两种或更多细胞有助于分离到更多的肠道病毒。

病毒实验室检测类型病毒实验室检测类型 -- 病毒实验室诊断方法病毒实验室诊断方法

检测抗体/抗原

检测病毒

检测核酸

ELISA/HI/PA

蛋白印迹

病毒分离 ELISA

电镜

中和试验

RT-PCR

实时荧光定量 PCR

套式 PCR LAMP

免疫荧光

基因芯片每种方法每种方法各有优势各有优势 ,,依据病毒依据病毒来定检测策略来定检测策略

New molecular tools for epidemiologystudies and diagnosis

三　结核杆菌与呼吸道病原体检测

• TB ： Tubercle bacilli

• CP ： Chlamydia pneumonia

• MP ： Mycoplasmal pneumonia

• SARS ： severe acute respiratory syndrome

• H1N1甲型流感• 呼吸道合胞病毒

结核杆菌流行现状（ 1 ）罗伯特 ·科赫（１８４３——１９１０），德国细菌学家，结核杆菌发现者

结核病是一个全球性的问题，近年来在世界范围内出现流行，且呈增长的趋势

TB

结核杆菌流行现状（ 2 ）• 我国结核病的疫情仅次于印度而居世界第

二位 • 2000 年，全国人口结核感染率为 44.5% ，

其中 15～ 44岁人群占了 53％ ，每年约有 25万人死于结核病

结核杆菌引起的感染

肺部感染：原发性肺结核，开放性肺结核。

肺外感染：脑、肾、骨、关节、生殖结核、肠结核、结核性腹膜炎、全身性结核。

常规结核病实验室诊断方法及不足1. 痰涂片作抗酸染色：阳性率低 、费时2. 细胞培养“金标准”：周期太长 (3-4W)

3. 血清学诊断： a. 接种 BCG 可出现阳性 b. 不能区分活动性结核病和治愈后留下损伤灶的病人

c. 交叉反应，假阳性不能早期诊断！容易漏诊、误诊！

TB

荧光定量 PCR 检测 TB-DNA 的意义

1. 能稳定检测 10copy 的 TB-DNA ，灵敏度高 ，特异性强

2. 早期、快速、准确地诊断结核病。 痰液、肺及支气管灌洗液——肺结核 血液——播散性结核和各脏器的结核病 　 脑脊液——中枢神经系统结核病 宫颈拭子、尿道拭子——泌尿生殖道结核病

TB

3. 荧光定量 PCR 检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法。

4. TB-DNA浓度可用于判断疗效： 痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势 ，

TB-DNA拷贝数下降。根据病原体 DNA浓度，对药物治疗及疗效观察提供参考依据

TB

荧光定量 PCR 检测 TB-DNA 的意义

CP 、 MP 感染可致咽炎、支气管炎和肺炎，潜伏期约 2-3周，通常起病较缓慢。持续性咳嗽。

肺炎衣原体 (CP) 、肺炎支原体 (MP) 感染与致病

CP/MP

MPMP肺炎约占非细菌性肺炎的肺炎约占非细菌性肺炎的 1/31/3以上，或各种原以上，或各种原因 因 引起的肺炎的引起的肺炎的 l0l0％。％。 MPMP 感染与小儿支气管哮喘密切相关。感染与小儿支气管哮喘密切相关。

CPCP 感染与冠心病存在密切的关系 感染与冠心病存在密切的关系

肺癌、支气管扩张患者中肺癌、支气管扩张患者中 CPCP 感染率相对感染率相对较高较高

荧光定量 PCR 用于非典型性肺炎的诊断

意义： 1. 直接检测病原体，早期、快速、特异诊断非典 型性肺炎。 2. 治疗方案与细菌、病毒感染的治疗方案不同 3. 流行病学调查。

　 TB 、 MP 、 CP已被许多医院尤其是妇幼保健医院和儿童医院纳为肺部感染的常规检测项目

MP/CP/SARS

甲型 H1N1流感

流行性感冒简称流感，是由甲、乙、丙三种流感病毒引起的急性呼吸道传染病。甲型流感病毒根据其表面 (H 和 N) 结构及其基因特性的不同又可分成许多亚型，至今甲型流感病毒已发现的血凝素有 16 个亚型 (H

1-H16) ，神经氨酸酶 9 个亚型 (N1-N9) 。

“猪流感”更名为“甲型 H1N1 流感”世界卫生组织 4月 30日宣布，从当日起，该组织不再使用

“猪流感”一词指代当前疫情，而开始使用“ A（ H1N1）型流感”一词。与之相对应，我国的官方文件从 5月1日起相继用“甲型 H1N1流感”代替原来的“人感染猪流感”。

世界卫生组织发言人说，之所以更改叫法，是因为“猪流感”一词容易误导消费者，美国和墨西哥等国的猪肉及猪肉制品已明显受到其他国家进口禁令影响。

世界卫生组织的声明说，根据目前掌握的科学依据，此次流行的病毒仅在人际间传播，尚无证据表明它在猪群内传播，或由猪向人传播，也无证据表明人因食用猪肉或相关产品染病。

病 原 学

甲型 H1N1流感病毒属于正粘病毒科，典型病毒颗粒呈球状，直径为 80 nm~120 nm ，有囊膜。囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是血凝素 HA 、神经氨酸酶 NA 和 M2蛋白。病毒颗粒内为核衣壳 , 呈螺旋状对称 , 直径为 10nm 。甲型 H1N1流感病毒为单股负链 RNA 病毒，基因组约为 13.6 kb ，由大小不等的 8 个独立片段组成。

流行病学特点

传染源 主要为病猪和携带病毒的猪，感染猪流感病毒的

人也被证实可以传播病毒。感染这种病毒的动物均可传播。

传播途径 主要为呼吸道传播，也可通过接触感染的猪或其粪便、周围污染的环境或气溶胶等途径传播。某些毒株如 H1N1 可在人与人之间传播，其传染途径与流感类似，通常是通过感染者咳嗽或打喷嚏等。

易感人群 普遍易感。患者多数年龄在 25岁至 45岁之间，

目前报道以青壮年为主，应注意老人和儿童。

临床表现潜伏期一般 1至 7天左右，较流感、禽流感潜伏期

长。

人感染甲型 H1N1流感后的早期症状与普通人流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等。

部分患者病情可迅速进展，来势凶猛、突然高热、体温超过 39℃ ，甚至继发严重肺炎、急性呼吸窘迫综合征、肺出血、胸腔积液、全血细胞减少、肾功能衰竭、败血症、休克及 Reye综合征、呼吸衰竭及多器官损伤，导致死亡。

实验室检查

1. 外周血象：白细胞总数一般不高或降低。重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少，并有血小板降低；

2. 血清学诊断：可使用间接 ELISA 、抗原捕捉 ELISA 、荧光免疫法等；

3. 反转录 - 聚合酶链式反应（ RT-PCR ）：由于 PCR 技术具有简便、快速、灵敏、特异性强等特点，已用于猪流感病毒基因的检测和分子流行病学调查等；

4 病毒分离：从患者呼吸道标本中（咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或气管吸出物、痰或肺组织）分离甲型 H1N1流感病毒。常用的方法有鸡胚接种法和细胞培养法。现有的诊断方法中，病毒分离法是较敏感的，但需要 2-3周时间。

人感染猪流感的诊断标准

1. 医学观察病例：曾到过甲型 H1N1流感疫区，或与病猪及甲型 H1N1流感患者有密切接触史， 1周内出现流感临床表现者。列为医学观察病例者，对其进行 7天医学观察（根据病情可以居家或医院隔离）。

2 疑似病例：曾到过疫区，或与病猪及甲型H1N1流感患者有密切接触史（也可流行病学史不详）， 1周内出现流感临床表现，呼吸道分泌物、咽试子、痰液、血清 H亚型病毒抗体阳性或核酸检测阳性。

3. 临床诊断病例：被诊断为疑似病例，且与其有共同暴露史的人被诊断为确诊病例者。

4. 确诊病例：从呼吸道标本或血清中分离到特定病毒； RT-PCR 对上述标本检测，有甲型 H1N1

病毒 RNA 存在，经过测序证实，或两次血清抗体滴度 4倍升高，可确诊为人感染甲型 H1N1流感。

四　 TORCH 感染特点与检测

TOX : Toxoplasma  gondii

RV: Rubella virus

CMV: Human cytomegalovirus

HSV: Herpes simplex virus

TORCH

TORCH 感染特点

　　

1. 母 -胎传播的主要病原体 　　　 2. 引起胎儿畸形新生儿缺陷的重要原因　　　 3. 自然状态下呈隐性感染　　　 4. 怀孕、多次输血、 AIDS 等易发生显性感染 5. 可致多发性、全身性感染　　　 6. 只有风疹可获得长久的免疫力，可用疫苗预防

TORCH

( 一 ) 弓形虫感染与致病

滋养体如弓形 ，广泛分布，人兽共患。寄生在有核细胞中，猫和猫科动物是终宿主易感者多，免疫者少 我国智力低下儿的弓形虫感染率 28％ 畸形儿的弓形虫抗体 IgM阳性率 12.25％ 艾滋病患者约有 20％～ 80％合并弓形虫感染 ，造成艾滋

病死亡的一个重要并发病

TORCH –TOX

人群自然感染率达到 60-90% ，多为隐性感染免疫功能低下 (怀孕、多次输血、器官移植、 AIDS)

发生显性感染可发生垂直传播，是宫内感染和胎儿畸形的主要病毒

之一围生期感染血、尿、乳汁、精液、分泌物中都可检出病毒

( 二 ) 人巨细胞病毒感染与致病

TORCH-CMV

风疹是一种世界性的病毒传染病， 是造成畸胎及先天性疾病的病毒之一

出疹前 1周至出疹后 5天均有传染性人是风疹病毒的唯一宿主 风疹感染后可获得持久的免疫力，临床显性再感

染并不多见。

( 三 ) 人风疹病毒感染与致病

TORCH-RV

先天性风疹感染往往发生在母体初次感染之时，可致先天性风疹综合症 (CRS) 三联症：白内障、耳聋、心脏病。

妊娠时体内皮质类固醇激素的增加以及细胞免疫功能的减弱，这种对正常人无害的再感染有可能造成病毒蔓延以至影响胎儿。

TORCH-RV

( 三 ) 人风疹病毒感染与致病

HSV 原发感染多为隐性，大多无临床症状或呈亚临床表现

HSV-1 主要引起口唇疱疹，疱疹性结膜炎、脑炎，皮肤性疱疹

HSV-2 主要引起原发性生殖器疱疹 (80%) 。HSV 感染后大多数个体不能彻底消灭病毒，也不

能阻止复发，病毒以潜伏状态长期存在宿主体内。

TORCH-HSV

( 四 ) 人单纯疱疹病毒感染与致病

妊娠期妇女因 HSV-1被激活，可通过胎盘感染胎儿，引起胎儿畸形、智力低下、流产等。

围产期感染可引发新生儿疱疹，死亡率高达 50%以上。

HSV 常与 HIV-1 同时感染，并能促进病情发展，引起严重的局部和播散性感染。目前认为 HSV 是一种调节因素，能激活 HIV 复制

与宫颈癌关系密切。

TORCH-HSV

( 四 ) 人单纯疱疹病毒感染与致病

常规 TORCH 检测方法与不足组织培养或病原体分离：慢，费力，阳性率低。血清学诊断： 　　 IgG ： 人群自然感染率高达 60-90% 。 IgG( ＋ ) 不能区别既住感染与现症感染；　　　　　新生儿 IgG( ＋ ) 不能说明有感染。　　 IgM ： IgM( ＋ ) 可能是原发性感染；　　　　　 IgM( － ) 不能排除感染。

TORCH

局限性： 局限性： 1. 1. 不能定量分析不能定量分析　　　　 　　　　 2. 2. 抗体的产生受多种因素的影抗体的产生受多种因素的影响响　　　　 　　　　 3. 3. 交叉反应，假阳性交叉反应，假阳性

荧光探针检测 TORCH 的优势

原理：直接检测 TORCH 病原体的核酸优点：灵敏、快速，特异

意义：早期诊断，妇幼保健、优生优育

　　　 1. 筛选 TORCH 患者，提高出生人口素质。　

　　　 2. 有利于预测胎儿宫内感染状况及妊娠结局。 　　　 3. TORCH 感染孕妇的治疗效果观察。

　　　 4. 器官移植、免疫系统疾病等病人监控。

5. 建立 TORCH 的分子诊断标准

TORCH

TORCH

　 TOX CMV RV HSV

核测核酸 DNA DNA RNA DNA

检测标本血液、羊水、绒毛膜

血液、尿液、乳汁、唾液、精液、分泌物

咽拭子、血液、尿液、羊水、胎盘、妊娠物

疱疹液、患处刮片、粘膜、血液

TORCH 检测核酸与检测标本的比较

检验报告单结果读取

• 3.637E+06 检测下限 : 1000拷贝 /毫升• 3.637×106 1.000E+03 copy/ml

如果是标本量是可以定量的，如血液、脑脊液等，则检测结果报告为： copy/ml

如果是标本量不能定量，如分泌物等，则结果只能报告为： copy

1.亲子鉴定

2.法医物证

3.PCR-RFLP 技术的法医学应用

4. 罪犯鉴定

法医鉴定法医鉴定

• 免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的“窗口期”，不利于对疾病的早期诊断；PCR方法直接检测病原体的 DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期诊断。

疾病的早期诊断疾病的早期诊断

• 1 乙型肝炎病毒（ HBV ） ; 2. 丙型肝炎病毒（ HCV ）

• 3 淋球菌 (NGH); 4 人类免疫缺陷病毒（ HIV ）

• 5 解脲脲原体 (UU) 6 肺炎支原体 (MP)• 7 单纯疱疹 II 型 8 人巨细胞病毒（ HCM

V ）• 9 人乳头瘤病毒（ HPV ） 6 、 11• 10 高危型人乳头瘤病毒（ HPV 8个型）• 11 沙眼衣原体 (CT) 12 a- 地中海贫

血• 13 结核分支杆菌 (TB) 14 新型冠状病毒 (SAR

S)

已获证书已获证书

荧光定量 PCR 技术中国专利

国家重点新产品

多种荧光 PCR试剂盒新药证书

多项国家、省部级等科技进步奖

三十余项国家、省部级重点科研项目

业务遍布全国 1026 家医疗卫生单位

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