ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ

Акишев Жигер

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ

- Это перераспределение генетического материала между молекулами или внутри молекулы ДНК, приводящее к появлению новых комбинаций генов или других нуклеотидных последовательностей

• Для всех рекомбинационных процессов общим является этап, на котором молекулы ДНК вступают в контакт в участке, где произойдет обмен полинуклеотидными цепями. Этот этап называется «Синапсис». Однако механизм синапсиса при различных типах рекомбинации принципиально различен

Исходя из этого рекомбинационные процессы можно подразделить на следующие типы:

• Гомологичная или общая рекомбинация (она же кроссинговер) – основан на спаривании

комплементарных цепей ДНК. Она требует общей гомологии между рекомбинирующими ДНК и участие большого набора спец белков. Рекомбинация начинается с возникновения в одном или обоих дуплексах участков из одиночных цепей ДНК, после чего которые с помощью белков находят комплементарные последовательности и образуют гетеродуплекс.

Из гомологичной рекомбинации следует выделить ЭКТОПИЧЕСКУЮ

• Она заключается обменах между отдельными участками гомологичной ДНК, разбросанными по геному, что приводит к различным хромосомным перестройкам (инверсии, делеции, дупликации).

Рассмотрение гомологичной рекомбинации начнем с модели кроссинговера предложенную Холлидеем

Чтобы гомологичные молекулы ДНК поменялись своими частями, сначала должны произойти

разрывы в обоих дуплексах. У Холлидея разрывы происходят в два этапа.

Рекомбинация начинается с разрывов фосфодиэфирных связей ДНК.

• Далее от точек разрывов происходит обмен цепями что приводит к образованию

крестообразной структуры, получившей впоследствии название “полухиазма

Холлидея”.

• Затем, перемещение точки перекреста цепей в полухиазме вдоль рекомбинирующих дуплексов.

• Такое явление описано под названием “миграция ветвления”. От точки перекреста цепей происходит расплетание исходных дуплексов и высвобождающиеся цепи тут же ренатурируют с комплементарными цепями из гомологичных дуплексов, что приводит к образованию и последующему удлинению гетеродуплекса.

• Гетеродуплекс сформирован. Структура должна

разделиться на гомологи. Это называется разрешением

полухиазмы. Для разрешения необходимы еще два

разрыва: вторичные разрывы завершат обмен цепями. Но прежде, полухиазма должна

претерпеть еще одно превращение — изомеризацию.

Изомеризация заключается в изменении структуры

полухиазмы,

• Небольшое отступление по поводу одного важного процесса. От исходных молекул в рекомбинационный гетеродуплекс могут войти разные аллели, и тогда в нем возникнут неспаренные основания, которые локально нарушат

структуру двойной спирали ДНК. Эти нарушения узнаются ферментными системами, эксцизионной репарации.

Они проводят коррекцию неспаренных оснований в гетеродуплексе: удаляют неспаренное основание в одной цепи ДНК и застраивают образующуюся брешь по матрице другого аллеля в комплементарной цепи, тем самым превращая (конвертируя) один аллель в

другой. Это явление было давно известно под названием “конверсия гена”.

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ И МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ

Генетический материал, передаваемый реципиентам при конъюгации и трансдукции, отличается только

размерами. Далее донорный фрагмент должен заменить гомологичную часть хромосомы

реципиента с помощью парных кроссинговеров, проходящих вблизи концов фрагмента.

Рассмотрим механизм самого кроссинговера

• Самый главный белок RecA — продукт гена recA. Белок имеет небольшой размер (всего около 38 кД) и проявляет разнообразные активности. Этот белок участвует не только в рекомбинации, но и

в репарации ДНК.• Основное назначение белка RecA — приводить

во взаимодействие одноцепочечную ДНК с гомологичным дуплексом. В зависимости от

структуры ДНК-субстратов белок может проводить разные рекомбинационные реакции.

Схемы трех рекомбинационных реакций, осуществляемых белком RecA E.coli in vitro

• Важнейшее свойство белка RecA определяется наличием у него двух сайтов связывания с ДНК.

— Первый для первичного связывания с ДНК. В результате возникает нитевидное образование

— RecA-ДНК-филамент. Если оцДНК была в составе двуцепочечной молекулы, то

формирование филамента распространяется на дуплекс. В филаменте двуцепочечная ДНК

изменяет свою конформацию.

• Формирование филамента завершает пресинаптическую

стадию кроссинговера.• Реакции синаптической стадии

кроссинговера, происходят только внутри филаментов. При этом филаменты могут вступать в

рекомбинацию только с “голой”, не находящейся в филаменте ДНК.

Взаимодействие филамента с голой ДНК осуществляется за счет второго

сайта связывания RecA.

• Гомологичное связывание начинается с образования D-

петли. – одноцепочечная ДНК

внедряется в дуплекс и образует двойную спираль с одной, комплементарной ей

цепью дуплекса, одновременно вытесняя вторую цепь. D-петля может быть закрытой, если в

дуплекс внедряется одноцепочечный хвост (а) ,

– или открытой, если она формируется на конце

линейного дуплекса (в).

На следующем этапе — постсинапсисе гетеродуплекс удлиняется путем миграции

ветвления, которую in vitro также может осуществлять белок RecA.

• В условиях in vivo, вместе с RecA задействованы другие белки, где распределение обязанностей может быть несколько иным. Например, в клетке белок RecA не проводит миграцию ветвления. Это более эффективно делают другие специальные белки. Разнообразие белков, работающих вместе с RecA, отражает разнообразие путей рекомбинации.

Основной путь рекомбинации у E. coli — RecBCD.

• Главную роль здесь играет фермент RecBCD-нуклеаза, которой кодируются генами recB, recC и recD. RecBCD имеет экзонуклеазную и хеликазную активность. Наконец, фермент работает как сайт-специфическая эндонуклеаза: расщепляет одноцепочечную ДНК около особой 8-нуклеотидной последовательности 5'-GCTGGTGG-3', называемой Chi-сайтом.

RecBCD-нуклеаза

• Один из самых ранних белков рекомбинации. Она готовит субстрат для белка RecA: линейный дуплекс донорной ДНК с тупыми концами. Именно такая ДНК необходима для рекомбинации с реципиентной хромосомой с участием RecBCD. Фермент атакует конец дуплекса и начинает расплетать его.

• Продолжая расплетать дуплекс, RecBCD- нуклеаза сохраняет петлю в 3'-цепи и продвигает ее вдоль дуплекса.

Поскольку после прохождения фермента комплементарные цепи ренатурируют (“схлопываются”), в

5'-цепи автоматически возникает вторая петля.

Двойная петля продвигается вдоль дуплекса до тех пор, пока фермент не встретит Chi-сайт в 3'-цепи. Фермент должен

подойти к Chi-сайту справа, с 3'-стороны. На расстоянии 4—6 нуклеотидов до него RecBCD разрывает 3'-цепь

• Дальнейшее расплетание дуплекса приводит к вытеснению рекомбиногенного одноцепочечного 3'-конца, который связывается с белком RecA.

После этого происходит уже известная цепь событий. На 3'-конце сначала формируется филамент, затем образуется D-петля (закрытая, так как возникает в кольцевой хромосоме)

и так далее.

• Последующие этапы — миграцию ветвления и разрешение полухиазмы осуществляют RuvA, RuvB и RuvC. RuvA узнает

крестообразную полухиазму и нацеливает на нее RuvB. Последний узнает комплекс RuvA—полухиазма и, используя

энергию АТФ и работая как ДНК-хеликаза, осуществляет миграцию полухиазмы в том же направлении, что и RecA-белок

in vitro, но гораздо эффективнее. Здесь вступает резолваза RuvC: она узнает комплекс RuvB-полухиазма, связывается с ним

и в определенный момент разрешает полухиазму способом, описанным Холлидеем.

Сайт разрываСайт разрыва

Димер RuvC

Рекомбинантная

цепьинтактная цепь

Реакция разрешения полухиазмы,

катализируемая эндонуклеазой RuvC E.coli

• Перечисленные выше белки далеко не исчерпывают список участников кроссинговера у E. coli. Сюда входят также различные белки,

помогающие RecA, белки, участвующие в альтернативных путях рекомбинации, и белки общего метаболизма ДНК: ДНК-гираза, ДНК-

полимераза, ДНК-лигаза и группа белков, осуществляющих коррекцию неспаренных

оснований в рекомбинационном гетеродуплексе.

Ген Белок Активности

Инициаторы (пресинапсис)

recBRecBCD

АТФаза, ДНК-хеликаза, ДН ДНК экзонуклеаза, ОН ДНК экзонуклеаза,Chi-специфическая эндонуклеаза.Формирует рекомбиногенный 3’-хвост иучаствует в формированииRecA-ДНК-филамента

recC

recD

recE ExoVIII 5’-3’ ДН ДНК экзонуклеаза (изозим экзонуклезы l)

recJ RecJ 5’-3’ ОН ДНК экзонуклеаза

recQ RecQ ДНК-хеликаза

xseA ExoVII 5’- ОН ДНК экзонуклеаза

ssb SSB Белок, связывающийся с ОН ДНК истабилизирующий ее

Гены и белки гомологичной рекомбинации

Ген Белок Активности

Гомологичное спаривание и strand exchange (синапсис)

recA RecA Формирует RecA-ДНК-филамент, которыйкатализирует гомоголичное спаривание иstrand exchange и является копротеазойбелков LexA, репрессора l, UmuD и др.

recF RecF Белок, связывающийся с ОН ДНК; можетфункционировать в комплексе с RecO и RecRи участвовать в формировании RecA-ДНК-филамента

recO

recR

RecO

RecR

Совместно cтимулируют связывание белка RecA с ОН ДНК (участвуют в формировании RecA-ДНК-филамента)

ssb SSB

Ген Белок Активности

Миграция и разрешение полухиазмы (постсинапсис)

ruvA RuvA Специфическое связывание с точкой перекреста вструктуре Холлидея, нацеливает RuvB на ДНК

ruvB RuvB АТФаза, ДНК-хеликаза,осуществляет миграциюполухиазмы (вместе с RuvA)

ruvC RuvC Специфическая эндонуклеаза, разрешающая структуры Холлидея

recG RecG АТФаза, ДНК-хеликаза, специфически связывающаяся с точкой перекреста в структуре Холлидея, осуществляет миграцию полухиазмы

rusA RusA Специфическая эндонуклеаза, разрешающая структуры Холлидея

Принципиально иными являются три других типа рекомбинации, которые основаны не на взаимодействии комплементарных цепей ДНК, а на совершенно иных механизмах и участии иных белков: сайт-специфическая рекомбинация, транспозиции и незаконная рекомбинация.

САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ• Сайт-специфическая

рекомбинация происходит между специфическими последовательностями ДНК в пределах очень коротких участков гомологии, обычно 15—30 п.н. Она обеспечивает интеграцию (включение) ДНК умеренных фагов в хромосомы бактерий, инверсию, а также другие процессы, играющие важную роль в циклах развития фагов и бактерий.

• Наиболее изучена она у умеренного бактериофага лямбда. – После инфекции в клетку E. coli

линейная вирионная двуцепочечная ДНК фага замыкается в кольцо за счет имеющихся на ее концах комплементарных одноцепочечных последовательностей. Последующее развитие фага может идти по пути интеграции в хромосому бактерии между генами gal и bio. Интеграция происходит путем рекомбинации между особыми att (attachment)- сайтами: attP в хромосоме фага и attB в хромосоме бактерии. Интегрированный фаг называется профагом. Он фланкирован рекомбинантными сайтами attL (левый) и attR (правый). Вырезание (эксцизия) профага из хромосомы происходит в обратной последовательности событий.

P, P' и B, B' - последовательности сайтов attP и attB соответственно, окружающие

центральную часть (О). A, J, N и R - гены фага.

• Из нее видно, что в интегративной рекомбинации участвуют сайты attP и attB, продукт фагового гена int (интеграза) и белок IHF (Integration Host Factor) E. coli. Для эксцизии необходимы сайты attL и attR, те же белки и еще продукт фагового гена xis.

Cначала интеграза производит обмен между двумя цепями

одинаковой полярности (разрыв и воссоединение цепей происходят

между строго определенными нуклеотидами в центральной части att-сайтов (а)). Возникает структура

соответствующая полухиазме Холлидея (б). Затем на расстоянии 7

п.н. происходит вторая пара обменов между двумя другими цепями. Вторая пара обменов

приводит к интеграции фага (в); интегрированный профаг

фланкирован рекомбинантными сайтами attL и attR.

• Сайт-специфическая рекомбинация- катализируется инвертазами бактерий и фагов.

• Пример инвертаза фага Mu. • В центральной части своей хромосомы фаг содержит

особый сегмент G размером около 3 т.п.н. Сегмент имеет повторы на которых присутствует специфический рекомбинационный сайт, где инвертаза проводит

рекомбинацию. 4 субъединицы фермента, по одной субъединице на каждую цепь ДНК одновременно расщепляют все цепи, образуя 5'-P и 3'-ОН-концы. Разрывы цепей в каждом дуплексе происходят на

расстоянии 2 п.н., так что 3'-конец выступает. Фермент ковалентно связывается с 5'-Р-концами. Затем одна часть

первого дуплекса меняется местами с такой же частью второго дуплекса, после чего восстанавливаются фосфодиэфирные связи во всех четырех цепях.

ТРАНСПОЗИЦИИ• В основе лежат перемещение подвижных генетических

элементов. Транспозиции осуществляются белками, ген которых в основном локализован в самих подвижных элементах. Главный белок транспозиции — транспозаза. Подвижные элементы с короткими обращенными повторами (а) характерны для бактерий, растений и дрозофилы. Элементы с длинными обращенными повторами (б) описаны у бактерий.

• Сначала транспозаза сводит вместе концы и делает разрывы (а). Затем она сводит в контакт концы элемента и дуп лекс ДНК-мишени. При этом она делает в обеих це пях ДНК-мишени ступенчатые разрывы (б).

• Следующий этап — обмен цепями, приводящий к рекомбинации между ДНК элемента и мишени. 3'-ОН-концы элемента соединя ются с 5'-Р-концами мишени, оставляя за счет ступенчатости разрывов бреши между 5'-Р-концами элемента и 3'-ОН-концами мишени (в). На следующем этапе бреши заполняются путем репаративной репликации ДНК по матрице ДНК-мишени (г). Заполнение брешей является причиной возникновения прямых повторов ДНК-мишени на концах элемента (д).

Общий принцип реакций транспозиции:

репликативная транспозиция

нерепликативная транспозиция

перемещение ретротранспозонов

Можно выделить три основных механизма рекомбинации при

транспозициях:

• Репликативная транспозиция — относительно редкий механизм. Он обнаружен у фага Mu и бактериальных транспозонов семейства Tn3 с короткими обращенными повторами.

• Репликативная транспозиция (а) отличается тем, что подвижный элемент, перемещаясь в другую молекулу, оставляет свою копию в исходной ДНК. Произойдет это за счет удвоения элемента. При этом кольцевые ДНК донора и мишени сливаются, образуя коинтеграт, в котором последовательности обеих молекул разделены двумя копиями элемента, расположенными в одной ориентации. Далее происходит разрешение коинтеграта на исходные молекулы. Последняя реакция осуществляется по механизму сайт-специфической рекомбинации ферментом резолвазой.

• Неконсервативная транспозиция заключается в вырезании элемента

и его перемещении в новое место. У ретротранспозонов с длинными

концевыми повторами транспозиция происходит по схеме, включающей РНК-интермедиат. В этом процессе участвуют специальные ферменты,

кодируемые самими ретротранспозонами В их

центральной части расположен ген pol, кодирующий несколько

необходимых для транспозиции ферментов: интегразу, обратную

транскриптазу и РНКазу H, которые первоначально образуются в виде общего белка, а потом нарезаются на отдельные белки под действием

специальной протеазы, также кодируемой геном pol.

• С геномной ДНК элемента транскрибируется РНК-копия, но уже с короткими концевыми прямыми повторами, с нее путем обратной транскрипции синтезируется ДНК-копия с длинными повторами, которая встраивается в новое место с помощью интегразы.

НЕЗАКОННАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ

• Эта рекомбинация происходит без гомологии между молекулами ДНК, и при этом без участия механизмов сайт-специфической рекомбинации или транспозиций. В качестве примеров можно привести захват ретровирусом некоторых клеточных генов при его эксцизии из хромосомы хозяйской клетки.

• Впервые механизм был описан японским исследователем Х. Икедой в 1982 году. В опыте in vitro провели рекомбинацию между полностью негомологичными ДНК плазмиды pBR322 и фага лямбда, катализируемую высокоочищенной топоизомеразой II (ДНК- гиразой) E. coli.

• Согласно модели две молекулы гиразы временно разрывают в обеих молекулах обе цепи ДНК, удерживая их концы. Затем они обмениваются парами субъединиц вместе с удерживаемыми концами разных ДНК-партнеров и сшивают концы дуплексов. Позднее Икеда показал такую рекомбинацию и in vivo в клетках E. coli.

Литература

• В. М. ГЛАЗЕР // ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ БЕЗ ГОМОЛОГИИ: ПРОЦЕССЫ, ВЕДУЩИЕ К ПЕРЕСТРОЙКАМ В ГЕНОМЕ //

• В. М. ГЛАЗЕР // ГОМОЛОГИЧНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ // 1998 год// Соровский журнал.