Campus Campos-Centro

Curso Técnico em Química

Microbiologia

Ação de diferentes temperaturas sobre os microrganismos

Áurea, Daniele, Flavia e Ingrid. Módulo II – Tarde

Laci Gonçalves Viana

26 de Abril de 2010.

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Sumário

1- OBJETIVOS................................................................................................................03

2- FUNDAMENTOS TEÓRICOS..................................................................................03

3- MATERIAIS, VIDRARIAS.......................................................................................10

4- EQUIMAMENTOS....................................................................................................11

5- REAGENTES USADOS............................................................................................11

6- MEIOS DE CULTIVO...............................................................................................12

7- AMOSTRA.................................................................................................................12

8- PROCEDIMENTO.....................................................................................................13

9- REAÇÕES..................................................................................................................16

10- CÁLCULOS E RESULTADOS..............................................................................16

11- DISCUSSÕES E CONCLUSÕES..........................................................................17

12-ATIVIDADES DE VERIFICAÇÃO.......................................................................19

13- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................21

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Ação de diferentes temperaturas sobre os microrganismos

1- OBJETIVOS

Preparar meios de cultivo líquidos e solidificados;

Realizar o plaqueamento dos meios de cultivo solidificados, assim como realizar a

esterilização dos mesmos por autoclavação;

Avaliar as alterações promovidas no meio líquido a partir do crescimento de

microrganismos.

Avaliar o efeito de diferentes temperaturas sobre os microrganismos;

Realizar a técnica do esgotamento do inoculo;

Realizar coloração de Gram.

2- FUNDAMENTOS TEÓRICOS

Conceito de esporos

Esporos são formas dormentes de uma célula bacteriana e são produzidos por certas

espécies de bactérias em situações de escassez de nutrientes. O esporo é resistente a condições

adversas, incluindo altas temperaturas e solventes orgânicos. A esporulação, processo pelo qual

alguns gêneros de bactérias formam esporos, ocorre quando estas bactérias estão em situações

críticas para sua sobrevivência, ou seja, as condições ambientais são adversas para o crescimento

bacteriano. De maneira geral, isto ocorre quando há falta de nutrientes, como carbono ou

nitrogênio.

Os esporos apresentam-se sob a forma de corpúsculos esféricos ou ovóides, livres ou no

interior da bactéria. Formam-se pela invaginação de uma dupla camada de membrana celular, que

se fecha para envolver um cromossoma e uma pequena quantidade de citoplasma, garantindo a

sobrevivência da espécie. Esta camada é responsável pela resistência à coloração e ao ataque dos

agentes físicos e químicos da esterilização e desinfecção.

Apresentam algumas características, decréscimo na quantidade total de água em

comparação com o estado vegetativo, refratividade, alta resistência a condições ambientais

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adversas, habilidade de germinar e produzir células vegetativas após longos períodos de

estocagem.

Na fase esporulada, as bactérias não realizam atividade biossintética e reduzem sua

atividade respiratória. Nesta fase também não ocorre multiplicação e crescimento bacteriano.

As bactérias podem permanecer viáveis na forma de esporos durante anos, se mantidos a

temperaturas usuais e em estado seco. Entretanto, assim que o ambiente se torna favorável, estes

esporos podem voltar a se reproduzir e multiplicar.

A estrutura do esporo é constituída de uma primeira camada interna, próximo ao cerne

do esporo – a parede do esporo – composta de peptidoglicano, a qual vai dar origem à parede da

célula vegetativa, por ocasião da germinação. Envolvendo a parede do esporo fica a córtex,

camada espessa, composta de um peptidoglicano diferente que apresenta menos ligações

cruzadas que o peptidoglicano existente na parede da célula que o originou.

Externamente a córtex fica a capa do esporo, estrutura rígida composta de proteína rica

em ligações de dissulfetos intramoleculares; ela confere resistência aos agentes químicos. A

camada mais externa recebe o nome de exósporo e consiste numa membrana lipoprotéica que

contem aminoaçucares.

Tipos de bactérias no solo

Existem vários tipos de microorganismos que habitam o solo e realizam importantes

mudanças bioquímicas. Eles são essenciais para vários processos bioquímicos que reciclam

importantes elementos como o enxofre, o nitrogênio e o carbono.

O solo pode abrigar microorganismos patogênicos, dependendo da natureza do animal,

dos tecidos das plantas e das excretas presentes nas plantas. A maioria destes vive 10 centímetros

acima do solo onde a matéria orgânica está presente.

As bactérias são alguns dos menores e mais abundantes micróbios no solo. Em um único

grama de solo, há bilhões de bactérias, uma estimativa de 60 mil espécies diferentes de bactérias,

a maioria não nomeada, e cada uma têm sua própria função e capacidade.

Algumas espécies de bactérias são muito frágeis e podem ser mortas por pequenas

mudanças no ambiente do solo. Outras espécies são extremamente resistentes, capazes de resistir

a calor severo, frio ou secagem, podendo permanecer dormentes por décadas à espera de

condições favoráveis.

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As bactérias desempenham um papel importante na decomposição de materiais orgânicos,

especialmente nas fases iniciais de decomposição quando os níveis de umidade são elevados.

Bacillus subtilis e Pseudomonas fluorescens são exemplos de bactérias decompositoras.

A bactéria Rhizobium pode ser inoculada em leguminosa semente para fixar nitrogênio no

solo. Estas bactérias fixadoras de nitrogênio vivem em nódulos de raiz em especial as

leguminosas, tais como o trevo, feijão. . Elas extraem gás nitrogênio do ar e o converte na forma

que as plantas podem usar. Esta forma de fixação de nitrogênio pode adicionar o equivalente a

mais de 100 kg de azoto por hectare por ano. Azotobacter, Azospirillum, Agrobacterium,

Gluconobacter, Flavobacterium, Herbaspirillum Gluconobacter, Flavobacterium e

Herbaspirillum são exemplos de bactérias fixadoras de nitrogênio.

Bactérias actinomicetes, incluindo espécies de Nocardia, Streptomyces, e Micronospora

- em milhões por grama estão presentes nos solos secos e quentes. Esses organismos são

responsáveis pelo odor característico de mofo e de terra seca de um campo arado. Os

actinomicetes podem degradar muitas substâncias complexas e, desta forma, são importantes no

melhoramento da fertilidade do solo.

Os actinomicetes são conhecidos pela capacidade de produzir antibióticos em

laboratório, mas quantidades detectáveis de antibióticos são raramente encontradas no solo. E

possível que os antibióticos possam estar presentes e ativos somente em áreas localizadas

imediatamente junto as das células dos actinomicetes.

Técnica de coloração de Gram

O método de coloração de bactérias foi desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans

Christian Joachim Gram, em 1884, que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço

bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, iodo, etanol-acetona e fucsina

básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-

negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas.

O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de

bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta durante um tratamento com etanol-

acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem.

O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em

meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um

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fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira

idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de

um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com

um solvente orgânico, o etanol-acetona que dissolve a porção lipídica das membranas externas

das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, descorando as

células. Nas Gram-positivas o solvente desidrata as espessas paredes celulares e provoca a

contração dos poros da peptidoglicana, tornando-as impermeáveis ao complexo, o corante

primário é retido e as células permanecem coradas. Em seguida, a amostra é tratada com um

corante secundário, a fucsina básica. Ao microscópio, as células Gram-positivas aparecerão

coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro.

Deve ter atenção na etapa da descoloração, pois a exposição prolongada ao solvente irá

provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados

falsos. A retenção ou não do corante primário é, portanto, dependente das propriedades físicas e

químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e

integridade.

O uso de material fresco é importante, pois células de bactérias Gram-positivas, células

velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos, tendem a perder o

cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas

como Gram-negativas.

Por outro lado, resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento

com etanol-acetona for omitido.

O corante cristal violeta pode ser substituído, com os mesmos resultados, pelo azul de

metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. A fucsina cora

muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina, que por sua vez não cora

prontamente algumas espécies de bactérias. O solvente etanol-acetona pode ser substituído por

álcool 95%.

A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em

laboratórios de microbiologia, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de

amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias

associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou

Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao

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clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. É possível a análise de

vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos. As lâminas

podem ser montadas permanentemente e preservadas como documentação.

Bactérias coradas pelo método de Gram

Bactéria Gram-positiva Bacillus brevis

Bactéria Gram-negativa Aeromonas hydrophila

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Tipos de crescimento em meio líquido

Aeróbias, que dependem de oxigênio para conseguir energia e não sobrevivem sem esse

gás.

Anaeróbias facultativas, que podem viver com ou sem oxigênio; se houver oxigênio no

ambiente, podem realizar respiração aeróbia; caso contrário, sobrevivem à custa de processos

anaeróbios, embora a quantidade de energia obtida seja inferior à obtida na respiração aeróbia.

Um exemplo são os lactobacilos, que realizam fermentação láctica, usada na produção de

iogurtes, coalhadas, queijos e outros produtos.

Anaeróbias obrigatórias ou estritas, que não possuem as enzimas necessárias ao

aproveitamento do oxigênio e, por isso, morrem com determinada concentração de oxigênio no

ambiente, porque, ficando livre na célula, esse gás pode danificar moléculas importantes, como o

DNA e as enzimas.

Em condições adversas (temperatura muito alta ou muito baixa, meio muito acido ou

básico, presença de substâncias tóxicas no ambiente, etc.), algumas bactérias formam esporos,

estruturas de parede resistente e com pouca água no citoplasma, nas quais a bactéria permanece

em estado de vida latente, com as funções reduzidas ao mínimo.

Mesófilas, psicrófilas e termófilas

Bactérias mesófilas

Bactérias mesófilas apresentam crescimento ótimo em temperaturas variando entre 25ºC e

40ºC, ou seja, a faixa de temperatura mais comum na superfície da Terra e nos organismos

animais.

A maioria dos patógenos humanos apresenta crescimento ótimo em temperaturas

próximas de 37°C. Bactérias termodúricas, tais como Bacillus cereus, Clostridium botulinum e

Listeria monocytogenes, geralmente vivem como mesófilas, mas podem suportar temperaturas

elevadas por curtos períodos de tempo.

Se o processo de aquecimento de alimentos envasados em recipientes metálicos ou de

vidro for inadequado, tais bactérias podem sobreviver e deteriorar o produto, representando uma

séria ameaça à segurança dos alimentos.

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Bactérias psicrófilas obrigatórias

Bactérias psicrófilas obrigatórias requerem baixas temperaturas para seu crescimento. Um

ótimo crescimento se dá em temperaturas abaixo de 15ºC.

Algumas espécies marinhas toleram temperaturas negativas uma vez que a água do mar

permanece líquida em temperaturas abaixo de 0°C. Tais organismos morrem quando expostos à

temperatura ambiente.

Sua adaptação a baixas temperaturas é devido ao alto conteúdo de ácidos graxos

insaturados em suas membranas. Estas moléculas permanecem fluidas em temperaturas nas quais

membranas contendo ácidos graxos saturados não são funcionais.

A bactéria Bacillus globisporus não cresce em temperaturas

acima de 20°C.

Bactérias psicrófilas facultativas

Bactérias psicrófilas facultativas ou psicrotróficas apresentam crescimento ótimo em

temperaturas abaixo de 20ºC, mas podem crescer, embora mais lentamente, em temperaturas de

refrigerador e têm alta probabilidade de contaminar e estragar produtos resfriados tais como

alimentos (por exemplo, Bacillus cereus) e sangue.

Bactérias termófilas

Bactérias termófilas são aquelas cujas taxas de crescimento ótimo estão entre 50ºC e

60ºC; são encontradas em pilhas de adubo orgânico.

Algumas espécies toleram temperaturas de até 110 °C em fontes termais.

As enzimas dos organismos termófilos apresentam propriedades de termo-estabilidade

que lhes permitem atingir um pico de atividade entre 60ºC e 80ºC. Dentro dessa categoria

encontram-se os organismos termófilos obrigatórios que só crescem em temperaturas acima de

37°C e os termófilos facultativos que podem crescer em temperaturas abaixo de 37° C.

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A bactéria Bacillus stearothermophillus cresce otimamente entre 65 e 75°C, mas pode

apresentar um pequeno crescimento e deteriorar alimentos em temperaturas em torno de 30°C.

Os esporos dessa bactéria são utilizados para controlar o funcionamento de autoclaves em

laboratórios de microbiologia.

Dentre os termófilos obrigatórios encontram-se as bactérias hipertermófilas que

apresentam crescimento ótimo em temperaturas em torno e acima dos 85°C. Há apenas três

gêneros de bactérias hipertermófilas: Aquifex, Thermocrinis e Thermotoga.

Nenhum psicrófilo sobrevive no corpo humano.Do ponto de vista prático, altas e baixas

temperaturas são utilizadas para evitar o crescimento de microrganismos.

A refrigeração de alimentos a 4°C impede o sua deterioração por organismos psicrófilos e

pela maioria da bactérias. Mas, em casos de armazenamento por longos períodos de tempo, e se o

material suportar congelamento, a temperatura ideal é 30°C negativos.

Altas temperaturas são utilizadas para esterilização de materiais, como aqueles utilizados

em laboratórios e na prática médica.

3- MATERIAIS, VIDRARIAS

Erlenmeyer de 250 mL;

2 Beckers de 250 mL;

4 estantes de tubos de ensaio;

Pinça;

Bucha de algodão hidrofóbico;

7 tubos de ensaios com tampa;

Fósforo;

2 suportes para lâminas;

Bico de Bunsen;

4 Placas de Petri;

4 alças de nichrome;

8 Lâminas;

Papel de filtro;

Tripé;

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Pipeta graduada 10 mL;

Pêra de sucção ou repipetador de plástico com três vias;

Berço de coloração de lâminas;

4- EQUIMAMENTOS

Estufa bacteriológica Olidef CZ 220V – 37ºC;

Microscópio óptico binocular 110V;

Geladeira;

Autoclave;

5- REAGENTES USADOS

Solução salina (NaCl) 0,5 %m/v;

Óleo de cedro (imersão);

Soluções para a coloração de Gram:

I. Cristal violeta: (segundo Hucker) - corante de Gram

a) Cristal violeta 4g

Álcool a 95o 20mL

b) Oxalato de amônio 0,8g

Água destilada 300mL

Para uso, misturar partes iguais de a e b.

II. Lugol - Mordente

a) Iodo metálico 1g

Iodeto de potássio 2g

Água destilada 300mL

III. Descorante - Diferenciador

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a) Álcool etílico a 95o ou partes iguais de acetona e álcool etílico

IV. Fucsina - Contracorante

a) Fuscina básica 0,3g

Álcool a 950 10mL

b) Fenol fundido 5mL

Água destilada 95mL

Para uso, mistura a e b e diluir a 1:10

6- MEIOS DE CULTIVO

Meio sólido

APC – Agar para contagem de microorganismos em placas

Composição g/L

Peptona de caseína 5,0 (fonte de proteína)

Extrato de levedura 2,5 (fonte de vitaminas)

Glicose 1,0 (fonte de carbono e energia)

Agar bacteriológico 15,0 (meio solidificante)

Meio Liquido

Extrato de levedura (nitrogênio)

25g – 1000ml

7- AMOSTRA

Solo 10g;

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8- PROCEDIMENTO

A- Plaqueamento

Derramar o meio de cultivo na quantidade necessária para cobrir o fundo da

placa de Petri (em torno de 20 mL);

Deixar as placas à temperatura ambiente para que haja solidificação (15 min);

Armazenar as placas já embrulhadas em geladeira (+ ou – 4º C) até posterior

utilização;

B- Inoculação da amostra

Transferir 10g de terra de jardim para o caldo nutritivo armazenado em

Erlenmeyer.

Agitar a mistura por 5 minutos e em seguida, deixar o Erlenmeyer em repouso

por mais 5 minutos.

Utilizando manobra asséptica, transferir 10mL da mistura preparada para 5 tubos

de ensaio previamente esterilizados.

Etiquetar os tubos de ensaio, colocando no rótulo o nome dos alunos, número do

tubo e o volume transferido.

C- Ação de diferentes temperaturas sobre microrganismos

O tubo número I deverá ficar a temperatura ambiente até a próxima aula.

O tubo II deverá ser fervido por 5 minutos em banho-maria e em seguida deverá

ser colocado a temperatura ambiente até a próxima aula.

O tubo III deverá ser autoclavado e em seguida, deverá ser exposto a

temperatura ambiente até a próxima aula.

O tubo IV deverá ir para estufa bacteriológica regulada a 60º C e vai

permanecer nesta temperatura até a próxima aula.

O tubo V irá para a geladeira e lá permanecerá até a próxima aula.

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D- Interpretação do crescimento em caldo nutritivo

Arrumar os tubos de ensaio na estante tendo o cuidado de não agitá-lo. Coloque-

os na ordem crescente numérica.

Comparar os cinco tubos e anotar a ordem crescente de turbidez, película e

avalie o odor após o crescimento microbiano.

Verificar também se houve alteração da cor do meio.

E- Inoculação pela técnica do esgotamento do inóculo

Flambar a alça de Nichome e deixá-la próxima à chama do bico de Bunsen.

A placa de Petri contendo o meio de cultivo a ser inoculado deve ser dividida, ou

mentalmente ou por intermédio do lápis dermográfico (fundo da placa), em quatro quadrantes.

Utilizando a técnica asséptica, coletar uma alçada do material a ser inoculado e,

mantendo a placa de Petri próxima à chama, "riscar" de maneira ordenada, em zigue-zague, sem

ferir o meio, o 1º quadrante, esgotando o conteúdo de microrganismos da alçada na superfície do

meio solidificado.

Imediatamente, tocando-se no zigue-zague do 1º quadrante com a alça,

realizaremos o segundo e assim sucessivamente, até a realização do último quadrante.

Após incubação deste material durante 48 horas a temperatura ambiente

poderemos visualizar colônias isoladas umas das outras atingindo o nosso objetivo que é a

multiplicação a partir de 1 microrganismo e a colônia só possui indivíduos geneticamente

idênticos, isto é, toda a descendência igual.

F- Observação macroscópica das colônias

Em região asséptica, observar as placas de Petri inoculadas. Começar

observando a placa com amostra do tubo I, verifique quantas colônias diferentes aparecem nesta

placa.

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Anote suas características (forma, elevação, cor, tamanho e brilho) e prepare

uma lâmina de cada colônia diferente. Repita o procedimento acima para as demais placas. Não

há necessidade de realizar esfregaços de colônias que se repetem em mais de uma placa.

Fixar as lâminas, identificá-las e em seguida realizar a coloração de Gram.

G- Coloração de Gram

O método consiste em adicionar à lâmina contendo os esfregaços, as seguintes

substâncias, observando a ordem:

1. Solução de cristal violeta - cobrir todo o esfregaço e deixar por 1 minuto. A seguir, lavar com

água corrente.

2. Lugol - (mordente): cobrir todo o esfregaço e deixar por 1 minuto. A seguir, lavar com água

corrente.

3. Álcool-acetona - (diferenciador): lavar a lâmina por 15 segundos e em seguida lavar com

água.

4. Fucsina - (contra-coloração): cobrir todo o esfregaço, deixar por 30 segundos e

lavar com água corrente para retirar o excesso de corante.

Terminada a coloração de Gram, deixar a preparação secar ao ar e observar ao

microscópio com objetiva de imersão (100 x de aumento).

H-Técnica de observação por imersão:

Colocar uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço;

Fixar a lâmina na platina;

Mover a lâmina com o auxílio do charriot de forma que o óleo de imersão fique

na direção da objetiva;

Girar o revólver e posicionar a objetiva de 100x;

Olhando pela lateral, girar o macrométrico até que a objetiva mergulhe no óleo

de cedro e encoste na lâmina;

Girar o macrométrico no sentido contrário até achar o foco inicial;

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Se necessário mova o charriot para analisar toda a lâmina;

Ao final da observação limpe a objetiva com solvente apropriado (Xileno ou

álcool/eter).;

9- REAÇÕES

Não houve reações nesta prática.

10- CALCULOS E RESULTADOS

Observação do crescimento de microorganismos nos tubos

I- Temperatura ambiente

II- Fervura/temperatura ambiente

III- Autoclave

IV- Estufa bacteriológica 60ºC

V- Geladeira

Tubo Turvação Película Odor Outros aspectos observados

I + + + + + + + + + Houve crescimento em todo o tubo:

Bactérias aerófilas facultativas

II + - + + Crescimento do meio do tubo para

baixo: Bactérias micro-aerófilas

III - - - Não houve crescimento.

IV + + - + Crescimento em todo o tubo:

Bactérias aerófilas facultativas

V - - - Não houve crescimento.

Legenda:

+ + + Muito

+ + Médio

+ Pouco

– Nenhum

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Esfregaço Tubo Forma Arranjo Gram

1 I Bacilos Paliçada Positovo

2 Cocos Estafilococos Negativo

3 Bacilos e esporos Isolados Negativo

4 Bacilos e esporos Isolados Negativo

Esboço das visualizações:

11- DISCUSSÕES E CONCLUSÕES

Os meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial dos microorganismos. Estes meios

fornecem os princípios nutritivos indispensáveis ao seu crescimento. As exigências nutritivas

estão relacionadas a uma fonte de carbono, de nitrogênio, de energia e de sais minerais. Alguns

microorganismos também necessitam de fatores de crescimento que são substâncias que eles não

podem sintetizar, tais como vitaminas, aminoácidos etc.

Outras condições inerentes ao meio de cultura necessário ao desenvolvimento são as

condições de pH, pressão osmótica e grau de umidade.

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As bactérias representam a maior parte da população microbiana do solo, tanto em

quantidade e quanto em variedade. Pela contagem por meio de cultura em placa de uma amostra

fornece apenas uma fração desse numero(milhões).

A quantidade e os tipos de microorganismos no solo dependem de muito fatores

ambientais:

1.Quantidade e tipo de nutrientes disponíveis.

2.Umidade disponível.

3.Grau de aeração.

4.Temperatura.

5.pH

6.Praticas e eventos que podem introduzir grande numero de microorganismos no solo,

como a aplicação de adubos ou dejetos de esgoto e a ocorrência de enchentes, ou aqueles que

podem remover os microorganismos, como as tempestades de poeiras.

O esporo bacteriano é uma célula de parede espessa formada no interior de algumas

bactérias. É muito resistente ao calor, à dessecação e a outros agentes químicos e físicos; é capaz

de permanecer o estado latente por longos períodos e, em seguida, dando origem a uma nova

célula vegetativa.

A finalidade da coloração é facilitar a observação microscópica das bactérias e

diferenciá-las de acordo com suas características tintoriais.

Em todo método de coloração há vários fatores que podem influenciar nos resultados

como, por exemplo, o pH das soluções de lavagem, a limpeza das lâminas, a pureza dos

reagentes, o modo de preparação do corante e mesmo o tempo dispendido na preparação desse

corante.

A coloração de Gram é muito utilizada por que a maioria das bactérias cora-se por este

método, permitindo observar sua morfologia e fornecendo informações a respeito do

comportamento do material celular diante de corantes básicos (corantes de Gram).

Foi observado que apenas um tubo conteve crescimento de microorganismos Gram-

positivos. Este mesmo tubo apresentou película – formação de esporos – forte odor e crescimento

uniforme. Conclui-se que este teve melhores condições de temperatura e pH, além de nutrientes.

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12-ATIVIDADES DE VERIFICAÇÃO

a) Por que precisamos ferver os meios solidificados?

Para que o Agar se dissolva uniformemente em todo o meio.

b) Agar é um nutriente utilizado pelos microrganismos?

Não. O Agar é apenas um meio solidificante.

c) Como sabemos que há crescimento de microrganismos em meio líquido e solidificado?

Basta observarmos a aparência do meio. Em meios líquidos, a turvação e odor são

características aparentes, já em meios sólidos a mudança de cor do meio e a aparição de

colônias nos garantem crescimento.

d) Qual a diferença básica entre preparo de meio de cultivo líquido e preparo de meio de

cultivo solidificado?

A diferença é que o meio líquido não precisa ser aquecido, pois não contém Agar a ser

dissolvido, o que ocorre com o meio solido.

e) Qual a função do banho-maria nesta prática?

O banho-maria serve para evitar que o meio em preparo entre em ebulição e não dissolva

completamente o Agar, também para que o Agar não concentre caso superaqueça.

f) Por que não devemos aquecer o meio solidificado em excesso?

Para evitar que o meio fique concentrado.

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g) Qual a finalidade de realizarmos a técnica do esgotamento do inóculo?

Para que possamos conseguir colônias isoladas com microorganismos geneticamente

idênticos.

h) Quanto à temperatura de crescimento, a espécie é termófila, mesófila ou psicrófila?

Mesófila

i) Defina inoculação.

Inoculação é a introdução de um microorganismo em um meio a fim de conseguir

produzir uma colônia com microorganismos geneticamente idênticos.

j) Definir esfregaço e alçada.

Esfregaço é uma leve camada de matéria orgânica colocada sobre lâmina de vidro para ser

examinada ao microscópio.

Alçada é a retirada de uma parte da cultura para a inoculação em outro meio ou para

visualização.

k) Citar os critérios de segurança a serem observados quanto à realização do esfregaço.

O esfregaço deve sempre ser feito próximo a zona de assepsia do bico de Bunsen. Deve-

se flambar a alça de Nichrome constantemente, a fim de evitar contaminações.

l) Em que se baseia o método de Gram?

O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de

bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta durante um tratamento com etanol-

acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem.

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13- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Sites

http://ube-164.pop.com.br/repositorio/4488/meusite/micro/ microbiologia_pratica2.htm#Coloração de Gram

Dia: 30/04/2010 http://translate.google.com/translate?hl=pt-BR&langpair=en%7Cpt&u=http://

www.dpi.nsw.gov.au/__data/assets/pdf_file/0017/41642/Soil_bacteria.pdfDia: 02/05/2010

http://www.ucg.br/ACAD_WEB/professor/SiteDocente/admin/arquivosUpload/3909/ material/Crescimento%20Populacional%20de%20Bact%C3%A9rias.pdf

Dia: 02/05/2010 http://www.knoow.net/ciencterravida/biologia/esporulacao.htm#vermais

Dia: 26/04/2010 http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/

bacterias.htmDia: 26/04/2010

http://ube-164.pop.com.br/repositorio/4488/meusite/micro/esporulacao.htm Dia: 26/04/2010

http://pathmicro.med.sc.edu/Portuguese/chapter_1_bp.htm Dia: 26/04/2010

http://www.hospvirt.org.br/enfermagem/port/esporo.htm Dia: 26/04/2010

http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2004/microorganismos/ BACTERIAS.htm

Dia: 26/04/2010 http://translate.google.com/translate?hl=pt-BR&langpair=en%7Cpt&u=http://

www.dpi.nsw.gov.au/__data/assets/pdf_file/0017/41642/Soil_bacteria.pdfDia: 26/04/2010

Livros

Ribeiro, Mariangela Cagnoli; Microbiologia prática: Roteiro e manual. Editora

Atheneu. Rio de Janeiro, 1993, p. 5 a 39.

PELCZAR, M.J.,CHAN ,E.C.S., KRIEG,N.R. Microbiologia: Conceitos e

aplicações.2.ed.São Paulo: MAKRON Books, 1996, p.

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