色氨酸（色氨酸（ trptrp ）操纵子）操纵子

lac 和 ara 操纵子是编码分解代谢途径酶系的操纵子，负责碳源（例如乳糖和阿拉伯糖等）的分解利用，这些操纵子的表达受相应碳源的诱导。

在细菌中还有负责一些物质合成代谢的操纵子，例如色氨酸操纵子（ tryptophan operon,trp operon ）就是负责色氨酸合成的操纵子。 trp 操纵子是由一个启动子和一个操纵基因区组成，该操纵基因区控制一个编码色氨酸生物合成需要的 5 种蛋白的多顺反子 mRNA 的表达。

由于 trp 体系参与生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或 cAMP-CRP 的调控。

色氨酸的合成主要分 5 步完成，有 7 个基因参与整个合成过程。 trpE 和 trpG 编码邻氨基苯甲酸合酶， tr

pD 编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶， trpF 编码异构酶， trpC 编码吲哚甘油磷酸合酶， trpA 和 trpB 则分别编码色氨酸合酶的 α 和 β 亚基。

trpE 基因是第一个被翻译的基因，和 trpE 紧邻的是启动子区和操纵区。另外，前导区和弱化子区分别定名为 trpL 和 trpa （不是 trpA ）。

trp 操纵子中产生阻遏物的基因是 trpR ，该基因距 trp基因簇很远。后者位于大肠杆菌染色体图上 25 分钟处，而前者则位于 90 分钟处。在位于 65 分钟处还有一个 trpS （色氨酸 tRNA 合成酶），它与携带有色氨酸的 tRNATr

p 共同参与 trp 操纵子的调控作用。

弱化子弱化子 在 trp mRNA 5' 端 trpE 基因的起始密码前有一个长 162b

p 的 mRNA 片段被称为前导区，其中 123 ～ 150 位碱基序列如果缺失， trp 基因表达可提高 6-10 倍，而且无论是在阻遏细胞内还是在永久性突变的细胞内都是这样。当 mRNA 合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有 140 个核苷酸的 RNA 分子，终止 trp 基因转录，这就是 123 ～ 150 区序列缺失会提高 trp基因表达的原因。因为转录终止发生在这一区域，并且这种终止是被调节的，这个区域就被称为弱化子。

研究引起终止的 mRNA 碱基序列，发现该区 mRNA 通过自我配对可以形成茎 -环结构，有典型的终止子特点。

前 导 肽前 导 肽

实验表明衰减作用需要负载 tRNATrp 参与，这意味着前导序列的某些部分被翻译了。分析前导序列发现，它包括起始密码子 AUG 和终止密码子 UGA；如果翻译起始于 AUG ，应该产生一个含有 14 个氨基酸的多肽。这个假设的多肽（还未实际观察到）被称为前导肽。

前导序列具有一个非常有意义的特点，在其第 10 和第 11 位上有相邻的两个色氨酸密码子。这一点很重要，因为组氨酸操纵子中，也具有弱化子，也具有一个类似的能编码前导肽的碱基序列，此序列中含有 7 个相邻的组氨酸密码子。苯丙氨酸操纵子中同样存在弱化子结构，其前导序列中也有 7 个苯丙氨酸密码子。这些密码子参与了 trp及其他操纵子中的转录弱化机制。

mRNAmRNA 前导区的序列分析前导区的序列分析 trp 前导区的碱基序列已经全部测定，引人注目的是其

中 4 个分别以 1、 2、 3 和 4 表示的片段能以两种不同的方式进行碱基配对（图 6-22 ），有时以 1-2 和 3-4 配对，有时只以 2-3方式互补配对。 RNaseT1 降解实验（此酶不能水解配对的 RNA ）表明，纯化的 trp 前导序列中确有 1-2 和 3-4 的配对方式，由此定位的 3-4 配对区正好位于终止密码子的识别区，当这个区域发生破坏自我配对的碱基突变时有利于转录的继续进行。

转录弱化作用转录弱化作用 转录的弱化理论认为 mRNA 转录的终止是通过前

导肽基因的翻译来调节的。因为在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以这个前导肽的翻译必定对 tRNATrp 的浓度敏感。

当培养基中色氨酸的浓度很低时，负载有色氨酸的tRNATrp也就少，这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢，当 4 区被转录完成时，核糖体才进行到 1 区（或停留在两个相邻的 trp 密码子处），这时的前导区结构是 2-3 配对，不形成 3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到将 trp 操纵子中的结构基因全部转录。

而当培养基中色氨酸浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在 4 区被转录之前，核糖体就到达 2 区，这样使 2-3 不能配对， 3-4 区可以自由配对形成茎 - 环状终止子结构，转录停止， trp 操纵子中的结构基因被关闭而不再合成色氨酸（图 6-24 ）。所以，弱化子对 RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置。

The trp operon is negatively regulated

by the Trp repressor

Trp repressor binds its target DNA sequence only when it itself is bound by its co-repressor, tryptophan.

The The trptrp operator is a operator is a palindromicpalindromic

DNA sequenceDNA sequence

trp 操纵子转录的调控是通过 Trp 阻遏物实现的，它结合于 trp操纵基因序列 ，但 Trp 阻遏物的 DNA 结合活性直接受色氨酸调控，色氨酸结合 Trp 阻遏物，并起着一个效应分子的作用（也称之辅阻遏物）。

在有高浓度色氨酸存在时， Trp 阻遏物 -色氨酸复合物形成一个同源二聚体，并且紧密结合于 trp 操纵基因序列，因此可以阻止转录。然而当色氨酸水平低时，缺少色氨酸的 Trp 阻遏物以一种非活性形式存在，不能结合 DNA 。在这样的条件下， trp 操纵子被 RNA聚合酶转录，同时色氨酸生物合成途径被激活。

trp 操纵子的另一种转录调控是称之衰减作用（ a

ttenuation ）的调控机制，这是一种将翻译与转录联系在一起的新的转录调控形式。细胞内 Trp-tRNATrp浓度决定核糖体是否停留在 trp mRNA 中的前导序列内的两个连续的色氨酸密码子处。当色氨酸水平高和 Trp-tRNATrp 可利用时，起转录终止作用的发卡环结构（由区 3和区 4之间）形成， RNA聚合酶刚好在一个聚尿嘧啶的下游处脱离DNA模板，转录终止。

当由于细胞内色氨酸有限， Trp-tRNATrp水平低时，核糖体就停留在 RNA 中连续的一对色氨酸密码子处。核糖体这一瞬间的停留给出时间使得一种替换的发卡结构在新的 RNA 中（由区 2 和区 3之间）形成，是一种抗终止的RNA 结构，它破坏了转录终止信号，使得 RNA聚合酶能够继续沿着 DNA模板滑动完成转录。　　

The The trptrp operon operon

P = promoterT = terminatorO = operator

trpR trpAP OP T T

Polycistronic mRNA (encodes 5 proteins)mRNA

TrpR (repressor)

5 separate proteins that were synthesized from one mRNA

trpBtrpCtrpDtrpE

Attenuator

TrpR

Attenuation in the trp operonAttenuation in the trp operon

Effectively adds a fine tuning to the regulation of the trp operon.

Several key points:1. Transcription & translation are tightly coupled in

bacteria (attenuation requires this).2. Synthesis of a leader sequence rich in Trp

influences whether transcription of the trp operon is complete.

3. If [Trp] is adequate transcription is terminated before the trp operon.

4. If [Trp] is inadequate transcription is completed.5. Termination of transcription is determined by

leader mRNA sequence.

Attenuation – a Attenuation – a transcriptionaltranscriptional form of form of control control

mRNA leader sequenceAttenuator

110 140 trpE

Leader polypeptide14 aa with 2 Trp aa

1 162

Typical stem loopof Termination site

AttenuationAttenuation

1 2 3 4

42

31

mRNA

Trp codons

mRNA sections1 base pairs with 23 base pairs with 4

ONLY 3 + 4 generatethe termination site

Attenuation – Inadequate [Trp]Attenuation – Inadequate [Trp]

1 2 3 4

mRNA

Trp codons

2 3

1 4

Ribosome stalls due to low [Trp]

This large stem loop of 2 + 3 does NOT act as a terminator. Transcription continues!!

RNA polymerase

Attenuation – Adequate [Trp]Attenuation – Adequate [Trp]

1 2 3 4

43

1

Ribosome moves Rapidly along mRNA

mRNA sections3 base pairs with 4 to form a termination site, such that RNApolymeraseprematurely falls off themRNA and aborts furthertranscription.

mRNA

Attenuation works by have the RNA polymerase stop (terminate) before the transcription of the structural genes, but AFTER it has already started to make an RNA.

The key is the region of the operon called trpL (see the figures above).

The The trptrp operon of operon of E. coliE. coli

In tryptophan-poor mediumIn tryptophan-poor medium

In tryptophan-rich mediumIn tryptophan-rich medium

Operon SummaryOperon Summary

We have considered in detail three operons: the lac operon, the ara operon, and the trp operon. The first two are operons concerned with the control of catabolic processes (utilization of energy substrates) while the third is concerned with anabolic processes (synthesis of a molecule the cell needs).

All three share negative control features, using repressor proteins binding to operators to place the operon in the "off" state. The first two have positive control features that increase transcription in response to low glucose (CAP-cAMP binding to the CAP site). This is not the case for the tryptophan operon. The tryptophan operon, however, has the additional negative control feature of attenuation. These features are summarized in the following table:

consensus

TATA (Pribnow) box

E. coli Promoters

Allosteric Effectors

Binding can also be required for binding of repressor (e.g. Trp) or can block an activator.

Genomic Organization of the Trp Operon

The Trp Operon

Note that the order of the genes follows the order of the biosynthetic pathway!!

Control of Gene Expression in the Trp Operon

1) The enzyme catalyzing the first step in the pathway is inhibited by Trp (feedback control).

2) In the presence of Trp, a repressor protein binds to an operator upstream of the Trp operon and shuts off transcription

3) Attenuation. There is a 160 base pair region in the Trp mRNA that causes transcription to terminate prematurely if Trp is present.

Feedback Control

Transcriptional Control

Attenuation Control

Attenuation Control

High Trp LevelsRibosome proceeds

Loop 3/4 forms Transcription terminates

Low Trp LevelsRibosome stallsLoop 2/3 forms

Transcription continues

Trp Operon Controlled by AttenuationTrp Operon Controlled by Attenuation

trpR P O 1 2 3 4 trpE trpD trp C trp B trpA

attenuatorLeader

•attenuation can form under certain conditions

•base-pairing can occur between1 - 2 2 - 3 3 - 4

Attenuation

High levels of Tryptophan in CellHigh levels of Tryptophan in Cell

•transcription & translation occur simultaneously in Prokaryotes

•leader transcript (1) has 2 trp codons (UGGUGG)

•ribosomes moves fast along transcript

•stem-loop 3 - 4 forms, poly Us after

•early termination of transcription, translation stops (only leader peptide forms - has no function)

Low Levels of Tryptophan in CellLow Levels of Tryptophan in Cell

•ribosome stalls at UGGUGG in leader transcript (1)

•stem-loop 2 - 3 forms, no poly U after

•transcription continues

Low Levels of other Amino AcidsLow Levels of other Amino Acids

•ribosome stalls way early

•stem-loops 1-2 & 3-4 form, poly U after

•early termination of transcription

The The TrpTrp Operon: Operon:When Tryptophan Is PresentWhen Tryptophan Is Present

STOPRight therePolymerase

Trp

TrpRepressor

Repressor

Repressor Promo. trpD trpBLead.Operator trpAtrpCtrpEAten.RNAPol.

FoiledAgain!

Repressor mRNA

Hey man, I’m constitutive

3’

5’

5’

3’

Transcription And Translation Transcription And Translation In ProkaryotesIn Prokaryotes

Ribosome

Ribosome5’

mRNA

RNAPol.

Met-Lys-Ala-Ile-Phe-Val-AAGUUCACGUAAAAAGGGUAUCGACA-AUG-AAA-GCA-AUU-UUC-GUA-

Leu-Lys-Gly-Trp-Trp-Arg-Thr-Ser-STOPCUG-AAA-GGU-UGG-UGG-CGC-ACU-UCC-UGA-AACGGGCAGUGUAUU

CACCAUGCGUAAAGCAAUCAGAUACCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUU

Met-Gln-Thr-Gln-Lys-ProUUUU-GAACAAAAUUAGAGAAUAACA-AUG-CAA-ACA-CAA-AAA-CCG trpE . . .Terminator

The Trp Leader and AttenuatoThe Trp Leader and Attenuatorr

4

1 2

3

The mRNA Sequence Can FolThe mRNA Sequence Can Fold In Two Waysd In Two Ways

4

1 23

Terminatorharipin

4

1 2

3

3’

5’

5’

3’

The Attenuator The Attenuator When Starved For TryptophanWhen Starved For Tryptophan

41

23

RNAPol.

Ribosome

Help,I need

Tryptophan

3’

5’

5’

3’

The Attenuator The Attenuator When Tryptophan Is PresentWhen Tryptophan Is Present

41

23

RNAPol.

Ribosome

RNAPol.