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Todos los autores leyeron y comprenden la Política EditorialTodos los autores participan en la construcción de la propuestaTodos los autores aceptan ceder los derechos para un publicación Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CC BY-NC-SA 4.0)La propuesta está estructurada de acuerdo con el formato de la ConferenciaLa propuesta tiene entre 15 y 25 páginasLas citaciones y referencias respetan el estilo IEEENo se utiliza ningún gestor automático de referencias o citas bibliográficasLa propuesta se escribe en español

ResumenLa sericina de seda es una proteína globular obtenida del proceso de desengomado de filamentos de capullos de seda. Debido a sus características biológicas como la permeabilidad al oxígeno, la acción antioxidante, la capacidad reguladora de humedad, la resistencia a los rayos UV, así como propiedades antibacterianas, anticancerígenas y anticoagulantes, esta proteína está siendo empleada en el desarrollo de materiales para aplicaciones biomédicas. Investigaciones recientes han demostrado que las propiedades fisicoquímicas de la sericina tienen efectos positivos sobre la adhesión y proliferación de queratinocitos y fibroblastos, haciéndola útil en el desarrollo de biomateriales para la ingeniería de tejidos. En Colombia es muy incipiente el conocimiento sobre las propiedades de la sericina, las cuales dependen principalmente de las características genéticas del gusano, de las condiciones de extracción y transformación de ésta. Por lo anterior, en este estudio se extrajo sericina a partir de capullos defectuosos suministrados por la Corporación para el Desarrollo de la Sericultura del Cauca-CORSEDA (Colombia), y se fabricaron esponjas empleando la técnica de liofilización, con el fin de obtener información acerca de sus características físicas, químicas y morfológicas. La estructura secundaria, la morfología y la estabilidad térmica de las esponjas se determinaron mediante espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier, microscopía electrónica de barrido, y análisis termogravimétrico, respectivamente. También, se investigó la capacidad de absorción de agua, y la degradación empleando una solución de fluido corporal simulado (SBF pH 7,4). Los resultados indican que las esponjas fabricadas tienen un contenido de estructuras cristalinas del 59,98%, una morfología laminar con poros irregulares pequeños y una alta densidad de poros. Los estudios de absorción mostraron un 688,41% de absorción de agua a las 12 h, junto con una degradación del 48% en el séptimo día. Estos resultados sientan las bases para el uso de la sericina obtenida de capullos de producción colombiana como un biopolímero para la formación de materiales porosos para posibles aplicaciones biomédicas.

1. INTRODUCCIÓN

La sericultura es considerada una actividad agrícola por el cultivo de la morera Morus sp, pecuaria por la cría del gusano de seda doméstico Bombyx Mori, y agroindustrial por la transformación del hilo de seda en la industrial textil [1]. Los hilos de seda son fabricados a partir de filamentos extraídos del capullo, los cuales están constituidos principalmente por dos proteínas, la fibroína (SF) y la sericina (SS), las cuales representan entre un 70-75% y 25-30% del peso total de la seda, respectivamente. Adicionalmente, presenta cantidades pequeñas de sustancias cerosas, sales minerales y materia colorante [2]. El proceso de transformación textil de la seda consta principalmente de 5 etapas: (1) el desborre, donde se retira la borra, una fibra de seda laxa que mantiene amarrados los capullos a una estructura de sostén; (2) secado de capullos, que se realiza para deshidratar las pupas y detener su proceso de metamorfosis; (3) devanado del capullo, etapa donde se obtienen madejas de seda cruda, aquí los capullos son sumergidos en agua caliente para ablandar la sericina y permitir separar el filamento del capullo; (4) desengomado, en esta etapa se elimina la sericina y demás contaminantes naturales para obtener un hilo suave, brillante y fácil de manejar; y (5) procesos tintóreos y acabados [1].

Durante el proceso de transformación de la seda se producen diferentes residuos, entre ellos capullos defectuosos y fibras cortas, que son transformadas en productos textiles y artesanías de bajo valor agregado. Además, se produce SS en la etapa de desengomado [3]. Este proceso se realiza empleando soluciones acuosas que contienen generalmente detergentes, ácidos y sales, los cuales, al igual que la sericina terminan como residuos del proceso textil.

La SS es una proteína que envuelve las fibras de SF y actúa como aglutinante para mantener la integridad estructural de los capullos [4]. Está compuesta por fuertes cadenas laterales polares, como grupos hidroxilo, carboxilo y amino, que contribuyen a su naturaleza altamente hidrofílica. La sericina se ha utilizado recientemente en aplicaciones cosméticas y biomédicas debido a sus características biológicas, como la excelente permeabilidad al oxígeno, la acción antioxidante, la capacidad reguladora de la humedad, la resistencia a los rayos UV, así como a sus propiedades antibacterianas, anticancerígenas y anticoagulante [5-8]. Investigaciones recientes han demostrado que la SS puede formar con éxito biomateriales para ser implementados en la ingeniería de tejidos y como material para promover la curación de heridas, tema sobre el cual aún se encuentran pocos estudios en comparación con otras proteínas [9]-[18].

Para estas aplicaciones, la sericina debe recuperarse luego del proceso de desengomado y puede fabricarse en diferentes formas, incluyendo geles, esponjas [19], películas y fibras [20], [21]. Entre estas presentaciones, el gel y las esponjas sobresalen porque pueden elaborarse fácilmente y usarse con eficacia en aplicaciones biomédicas. Las esponjas de sericina pueden fabricarse mediante la técnica de liofilización y sus características están influenciadas principalmente por el peso molecular, la concentración de la SS y las condiciones del proceso [22]. Debido a que las esponjas de sericina tienen una alta porosidad, se convierten en elementos potenciales para su aplicación en el desarrollo de materiales biomédicos, incluidos los apósitos para heridas y parches [23], sin embargo, sus propiedades mecánicas débiles han limitado su uso extensivo en esos campos.

En Colombia todavía es muy poco el conocimiento sobre las proteínas de la seda, debido a esto, es esencial generar un conocimiento de biomateriales a base de sericina colombiana, teniendo en cuenta los estudios desarrollados a nivel internacional. Para esto, es importante considerar que las propiedades de la proteína están relacionadas con: las características genéticas y modificables del gusano de seda que se dan por el sitio de producción, y las condiciones de operación como la temperatura, humedad ambiental, aire, iluminación, alimento, entre otras [1], [24].

Por lo anterior, en este trabajo se estudiaron las propiedades de esponjas elaboradas con sericina proveniente de capullos defectuosos de la agroindustria serícola colombiana, usando la técnica de liofilización. Con el fin de conocer algunas de las características de los materiales elaborados, se determinaron sus propiedades morfológicas, mecánicas y estructurales, se determinó su tasa de degradación y su capacidad de absorción de agua.

2. MÉTODO

2.1 Extracción y recuperación de la sericina de seda

Para la extracción de la sericina se utilizaron capullos defectuosos suministrados por CORSEDA, los cuales se cortaron en trozos pequeños. La sericina se extrajo usando la técnica de desengomado a alta temperatura y presión con agua caliente. Para la extracción se empleó una autoclave a una temperatura de 120 °C durante 30 min, en una relación de baño de 1:30 (g de capullos/mL agua). Transcurrido este tiempo la solución de serina obtenida se filtró empleando una bomba de vacío para eliminar material particulado y posibles impurezas presentes en la solución. Posteriormente, se realizó un proceso de deshidratación por aspersión, empleando un equipo marca BUCHI (B 290), manteniendo una temperatura de entrada 160 °C, un flujo de aspersión de 40 m3/h y un caudal de 6,3 mL/min. El polvo de sericina obtenido se almacenó en un desecador.

2.2 Elaboración de esponjas de sericina

Se realizó una disolución del polvo de sericina en agua destilada a una concentración del 2%  (w/v) empleando una autoclave a las mismas condiciones mencionadas anteriormente. La solución obtenida se vertió en recipientes plásticos de 7 mL, se congeló a -80 °C durante 24 h, y posteriormente se liofilizó (liofilizador marca Labconco). Las esponjas obtenidas fueron almacenadas en un desecador hasta su posterior caracterización.

2.3 Caracterización de esponjas de sericina

Espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR). La estructura química de las esponjas fue analizada mediante la técnica de FTIR con un módulo de reflectancia total atenuada (ATR), en un espectrómetro marca Nicolet 6700 Series. Se realizaron 64 barridos a una resolución de 4 cm-1 y una longitud de onda de 4000-400 cm1. Se efectuó una deconvolución en la región de la amida I (1600-1700 cm-1) empleando el software OMNIC con un ajuste de curvas gaussianas. El porcentaje de estructuras secundarias individuales se determinó en correlación con las estructuras secundarias totales usando la ecuación (1).

%Estructuras secundarias individuales=AmAT

∗100 (1)

Donde Am y AT es el área máxima de estructuras secundarias individuales y el área total de las estructuras secundarias, respectivamente.

Microscopia electrónica de barrido (SEM). La morfología de las esponjas fue examinada por SEM en alto vacío con un detector de electrones secundarios marca JEOL JSM-6490LV. Previo al análisis de las muestras se realizaron cortes horizontales y verticales para su observación (Figura 1) y se hizo un recubrimiento delgado de oro utilizando un equipo marca DENTON VACUUM Desk IV, hasta obtener un espesor de 10 nm.

Figura 1. Corte vertical y horizontal realizado a las esponjas

Análisis termogravimétrico (TGA). El comportamiento térmico se determinó empleando una balanza termogravimétrica Mettler Toledo TGA Q500. Los termogramas se obtuvieron bajo una atmosfera inerte de N2 para evitar procesos oxidativos, con un flujo de 50 mL/min, en un rango de temperatura de 30 a 800 °C y una velocidad de calentamiento de 10 °C/min.

Capacidad de absorción de agua. El estudio de absorción de agua se realizó con base a lo reportado por Mandal, Priya y Kundu [14]. Las esponjas liofilizadas se pesaron en estado seco y luego se sumergieron en 50 mL de agua destilada, sostenidas en una rejilla durante intervalos de 6, 12 y 24 h. Transcurrido cada intervalo de tiempo las esponjas se retiraron cuidadosamente, se removió el exceso de agua de la rejilla y posteriormente fueron pesadas. El porcentaje de absorción de agua de las esponjas se calculó usando la Ecuación (2). Los ensayos se realizaron por triplicado.

% Absorción de agua = Ws−WhWh

∗100 (2)

Donde, ws (g) y wh (g) son el peso de las muestras en estado seco y húmedo, respectivamente.

Degradación in vitro. Las esponjas de sericina fueron inmersas en una solución de fluido corporal simulada (SBF pH 7,4), se incubaron a 37 °C durante 1 y 7 días. Después del intervalo de tiempo específico, las esponjas se secaron durante 24 h para eliminar el exceso de agua y obtener el peso seco final. El porcentaje de degradación se calculó empleando la ecuación (3).

% Degradación = Wi−WfWi

∗100 (3)

Donde, wi (g) y wf (g) son los pesos de la esponja antes y después de la degradación durante el intervalo de tiempo especificado, respectivamente.

3. RESULTADOS

3.1 Estructura química de esponjas de sericina

En la sericina, las unidades de repetición de polipéptidos producen múltiples bandas características de absorción infrarroja incluidas la amida A y B (3000-3500 cm-1), y las amidas I, II y III. Las amidas A y B (3268 cm- 1) están relacionadas con el estiramiento de los enlaces N-H que se sobreponen con aminoácidos hidroxilados como serina y treonina [25]. La amida I (1600-1700 cm-1) se asocia con las vibraciones del estiramiento C=O de los enlaces peptídicos, por lo cual son más sensibles a la orientación molecular y estructura secundaria de la proteína [26]. La amida II (1504-1582 cm-1) está relacionada con la flexión entre los enlaces N-H y la vibración del estiramiento de los enlaces C-N. La amida III

(1200-1300 cm-1) representa principalmente la vibración del estiramiento de enlaces C-N vinculados a la vibración de la flexión N-H en el plano. De éstas, la amida I es la banda más útil para analizar las estructuras secundarias de proteínas [26], [27]. El espectro característico de las esponjas de sericina se muestra en la Figura 2. De acuerdo a los resultados, es posible evidenciar picos principales que corresponden a una estructura -hoja, debido a que la amida I se encuentra en 1637 cm -1, la amida II en 1516 cm-1, y la amida III en 1240 cm-1 [28], [29]. Kim et al. [30] presentan en su investigación resultados similares, donde obtienen una sericina liofilizada con una estructura -hoja. Los autores observaron, además, que para lograr un mayor contenido de estructura a espiral al azar podían agregar lioprotectores.

Figura 2. FTIR - ATR de la esponja de sericina

Para un mejor análisis y con el fin de determinar el porcentaje de estructuras secundarias que predominan en la muestra, se realizó un análisis cuantitativo para la región amida I, como se mencionó anteriormente. El análisis de la amida I da lugar a la presencia de 18 picos (Figura 3), los cuales se asocian a las diferentes estructuras secundarias de la sericina (Tabla 1) [30], [31]. El contenido relativo de cada estructura secundaria se calculó como la razón entre el área de los picos asociados a dicha estructura, y el área total de la curva ajustada [32].

Figura 3. Deconvolución de la región amida I (1600-1700 cm-1) de las esponjas de sericina

Teniendo en cuenta estos resultados, se encontró que las esponjas de sericina obtenidas presentan regiones cristalinas (-hoja y giros-) y amorfas [33] (espirales al azar, -hélices, y cadenas laterales) con un 59,98 y 40,02% respectivamente. Estas conformaciones son resultado del proceso de fabricación de la esponja, ya que la temperatura de congelación influye en la conformación de las estructuras dentro del material, como se reportó en un estudio realizado por Tao, Lie y Xie [34]. Los autores observaron que la temperatura de congelación tiene una influencia sobre los picos de absorción de la amida I. A temperaturas más bajas, el número de onda cambia a una posición superior, lo que indica que el contenido de estructuras -hoja disminuye y el de las estructuras amorfas (espirales al azar) aumenta de manera relativa [34], [35]. Además, observaron que la ultracongelación de las esponjas de sericina a -

80 °C produce un mayor contenido de giros- comparadas con las esponjas que se obtuvieron a mayores temperaturas (-20 °C, -50 °C). Este resultado tiene relación con los encontrados en esta investigación (Tabla 1), donde se encuentra que la estructura predominante son los giros- (32,14%).

Tabla 1. Porcentaje de estructuras secundarias contenidas en esponjas de sericina

Estructura secundaria Banda de absorción %

-Hoja1610-1640 cm-1

1695-1700 cm-1 27,84

Espirales al azar 1640-1650 cm-1 22,66-Hélices 1650-1660 cm-1 5,29Giros- 1660-1695 cm-1 32,14Cadenas laterales 1600-1610 cm-1 12,07

Por otro lado, Jang y Um [23] fabricaron esponjas de sericina tratadas con etanol a diferentes concentraciones. En el estudio de la conformación química del material reportaron picos de absorción de IR a 1620 y 1510 cm-1 característicos de la estructura cristalina -hoja. Los autores indican que esta conformación ocurre durante la fabricación de la esponja de sericina mediante la técnica de liofilización, lo cual corrobora lo analizado en esta investigación.

3.2 Morfología de esponjas de sericina- SEM

La Figura 4 muestra las imágenes SEM del corte vertical y horizontal de las esponjas de sericina liofilizadas. Se observa una morfología laminar con poros irregulares, con estructuras tipo panal. En la imagen del corte vertical se evidencia configuraciones tipo lámina que pueden ser atribuidas al tipo de corte realizado [22]. Por otra parte, la imagen del corte horizontal muestra alta densidad de poros, también se observan poros pequeños no interconectados atribuibles a la sublimación y la presión negativa que ejerce el agua durante la liofilización. En las esponjas el tamaño de poro depende del tamaño de los cristales de hielo formados durante la congelación: cuanto mayor sean éstos, mayor será el tamaño de poro [34]. De acuerdo con la literatura, temperaturas bajas de congelación (-80 °C) favorecen la formación de cristales pequeños [22], [34], lo que confirma los resultados obtenidos en la presente investigación.

Figura 4. Imágenes SEM corte vertical (A) y corte horizontal (B)

Tao, Lie y Xie [34] muestran en su estudio una morfología similar a las obtenidas en este informe, donde consiguen una estructura porosa, con poros anómalos. Los autores concluyeron que la porosidad y el radio de poro son más pequeños y que la densidad de poro es mayor cuando la temperatura de congelación es menor (-80 °C). Andamios a base de sericina reticulados con acetato de polivinilo (PVA) obtenidos por Aramwit et al. [16] fueron analizados por microscopia electrónica de barrido. Los autores observaron que la sección transversal del andamio presentaba una porosidad no interconectada, con poros abiertos y cerrados, y una distribución de poros heterogénea. Observaron además que al mezclar los andamios con glicerina se obtenía una mejor uniformidad del poro. Por lo anterior, se puede deducir que la técnica de deshidratación y las mezclas que se realicen en el material, influyen significativamente en la morfología y tamaño de poro obtenidos.

3.3 Análisis termogravimétrico - TGA

En las Figuras 5A y 5B se presentan las curvas obtenidas para el ensayo de TGA y su primera derivada (DTG) de las esponjas de sericina. Ambas curvas evidencian una degradación térmica de la muestra en dos fases: una fase de deshidratación, la cual ocurre entre 25 y 103 °C, correspondiente a una pérdida de masa de aproximadamente 5-6%, y que es atribuida a la evaporación de agua remanente presente en la esponja; la segunda fase, correspondiente a la degradación de los compuestos moleculares constitutivos de la muestra, ocurre en el rango entre 220-510 °C, con una temperatura de máxima velocidad de degradación de 305 °C aproximadamente. Esta fase está relacionada con la eliminación de compuestos volátiles, seguido de la degradación de grupos de cadenas laterales de residuos de aminoácidos, así como a la escisión de los enlaces peptídicos de la proteína, y la carbonización de la estructura primaria [36]-[38].

Figura 5. TGA (A) y DTG (B) para las esponjas de sericina liofilizadas

Los resultados obtenidos coinciden con los patrones de pérdida de masa de la sericina reportados por Gupta, Agrawal y Rangi [2]. Adicionalmente, resultados similares han sido obtenidos en el estudio publicado por Lamboni et al [13], en relación con la estabilidad térmica de biomateriales compuestos de sericina y celulosa bacteriana (BC), evaluada mediante la técnica de análisis termogravimétrico. El estudio muestra una degradación en dos eventos térmicos atribuidos a: una fase de deshidratación, desde una temperatura ambiente hasta los 230 °C, y una fase de degradación principal atribuida a la degradación de la sericina, dada entre los 240-400 °C.

3.4 Capacidad de absorción de agua

El grado de absorción de las esponjas de sericina después de la inmersión en agua en diferentes períodos de tiempo se muestra en la Figura 6. Cuando las esponjas se sumergen en agua se hinchan rápidamente en las primeras 4 h, hasta un 510,52%. Debido al gran área superficial y su carácter hidrofílico se observa un aumento adicional de 117,83% en la absorción de agua entre las 4 y 6 h, y de 60,0% entre las 6 y 12 h. Posterior, a las 12 h, se presenta una pérdida de peso. Esto se debe, entre otras razones, a la solubilidad que presenta la muestra por la presencia de estructuras amorfas, lo cual puede llevar a una desintegración parcial del material.

Figura 6. Porcentaje de absorción de agua de esponjas de sericina

Estos mismos resultados son reportados por Posada [39], quien observó una continua absorción de agua hasta las 12 h, lo cual es atribuido al tamaño de poro (26,02 ± 17,68 m) y la concentración de las muestras (2% (w/v)). Al igual que en esta investigación, las esponjas obtenidas por el autor se saturaron a las 12 h con una disminución posterior de su peso. Este efecto es atribuido al alto contenido de estructuras giros- en el material, las cuales le dan una mayor solubilidad a la muestra. Este comportamiento concuerda con los resultados obtenidos en la presente investigación por medio de espectroscopia infrarroja, donde se encontró que la esponja posee una mayor cantidad de giros-(32,14%) en comparación con otras estructuras.

La absorción de agua es un factor clave para las propiedades superficiales y mecánicas de las esponjas, de igual forma, influye en la eventual carga/liberación de especies bioactivas en estos materiales, así como en los procesos degradativos [37]. Si se obtiene una alta capacidad de absorción de agua en el material, sin afectar la integridad del mismo, esto sugiere que absorberá fácilmente y mantendrá los medios nutrientes dentro de la matriz, proporcionando así alimento a las células en crecimiento para su proliferación y supervivencia [14]. Teniendo en cuenta que los resultados de la presente investigación sugieren una desintegración del material, se concluye que, si se quiere potencializar el uso de esponjas de sericina en ingeniería de tejidos, es necesario aumentar su porcentaje de estructuras cristalinas para disminuir su solubilidad o realizar mezclas con otros polímeros que mejoren su estabilidad.

3.5 Degradación in vitro

La caracterización del perfil de degradación del material permite saber sí el tiempo de descomposición y otros atributos de degradación del material apoyarán al tejido en regeneración, el tiempo suficiente para que adquiera la integridad funcional y estructural apropiada a medida que se degrada el material [40], [41]. Por lo anterior, se realizó un acercamiento al comportamiento de las esponjas de sericina en contacto con un fluido corporal simulado. El porcentaje de degradación de las esponjas después de la inmersión en SBF (pH 7,4) se muestran en la Figura 7. En el día 1 y 7 las esponjas perdieron 13 y 48% de su peso respectivamente. Los resultados indican que se da una disminución de la masa proteica de las muestras al estar un mayor tiempo en contacto con la solución.

Figura 7. Porcentaje de degradación de esponjas de sericina en solución SBF pH 7,4

En el estudio realizado por Mandal, Priya, y Kundu [14], para esponjas compuestas de sericina y gelatina, se encontró que el porcentaje de degradación varía con la concentración de sericina: entre mayor porcentaje de sericina mayor es el porcentaje de degradación. Los autores encontraron una degradación de aproximadamente 7% para una relación de 2:2 sericina:gelatina en el día 7 [14]. Por otro lado, Siritientong, Srichana y Aramwit [42], en su estudio realizaron andamios de sericina con el fin de evaluar el efecto del proceso de esterilización de éstos por diferentes métodos. Los resultados exhibieron una degradación de aproximadamente el 90% para andamios de SS no esterilizados y del 40% para adamios de SS esterilizados con etanol después de una inmersión en una solución tampón de fosfato (pH 7,4) a 37 °C durante 24 h. Los materiales a base de sericina reportados en la literatura presentan una menor degradación al realizarles tratamientos o mezclas con otros polímeros. Esto sugiere que para obtener un porcentaje de degradación menor en esponjas a base de sericina es necesario realizar mezclas con otros polimeros o tratamientos que favorescan su estabilidad en este tipo de pruebas.

4. CONCLUSIONES

Este estudio muestra las propiedades de esponjas de sericina fabricadas mediante la técnica de liofilización. Los resultados mostraron que el material presenta una estructura principalmente cristalina (59,98%), una temperatura máxima de degradación a los 304 °C, una morfología laminar con poros irregulares y pequeños, una máxima absorción de agua a las 12 h, y una degradabilidad del 48% a los 7 días. De acuerdo con los resultados, es necesario mejorar su estabilidad estructural por medio de tratamientos o mezclas con otros polímeros que favorezcan el uso de la sericina en el desarrollo de biomateriales para aplicaciones en la regeneración de tejidos.

Esto trabajo proporciona un acercamiento al uso de la sericina colombiana, que actualmente es un subproducto de los procesos empleados para la obtención de la seda, como biopolímero natural para la fabricación de materiales porosos con posibles aplicaciones en el campo biomédico.

5. REFERENCIAS

[1] Organizar las referencias de acuerdo con el formato en la opción Envío de Propuestas de la página de la Conferencia.