!"#$%&'()*+,$*!-.%,$,/#*01,)+'&%$23*+,*

4,3/,532+#-6*7,-233#$$#*8*9#3:#$#;<2*

!"#$%&'#()*+),%(-%.)/0"&#)

1%23(%43(03)'#)*&43-#&0%)5)60"3-#&0%)

7#843)'#)903"3-:%)

6%;<"4%')'#)=0#&;0%.)

>+)7#)=?0"#)

@76)#&)?A8BCCD%(-%."%2+E3('8(#..+;3F)

1%.)#$4(#F0'%'#.)'#)"3.)4#4(G83'3.)H#&#&);<%4(3)-(<83.)

8(0&;08%"#.))'#)#"#F#&43.)#.I<#"#H;3.)B)

J").45"383'3B)#"#F#&43)<&0;3)8(3$0F%")K9(%L3B)MNF#(3O)@0#(&%B)

6PF<(Q)

J")L#<-383'3B)R)#"#F#&43.)'0.4%")%")#.H"383'3)K9(%L3B)S%'03)5)

>"&%))

@0#(&%B)H20%)5)6:2<"%Q)

J")%<4383'3B)F<T#;%U4320""3O)8%"F%U#F8#0&#))5)'#'3.)

KF#.383'3O)F#4G83'3)5)V%"%&-#.Q))

Brazo

(forelimb)

Pierna

(hindlimb)

Stylopodo

Zeugopodo: Lado anterior (“interno”) Radio-Tibia

Lado posterior (“externo”) Ulna- Fíbula

Aves

Condylo: extremo (articular) del hueso Trochanter: inserciones

musculares del fémur

El mesopodo: número variable de elementos (muñeca-

tobillo) incluyendo 3 elementos proximales (que

articulan con el zeugopodo) Brazo: Radiale, Ulnare e Intermedio , Pierna: Tibiale, Fibulare (tambien

conocidos como astrágalo y calcáneo) e intermedio.

Hay un numero de elementos centrales (4 en el

ancestro de los tetrápodos “modernos” ), y elementos

distales típicamente asociados a los dedos del Metapodio.

El metapodio (mano: palma, pie: empeine) en tetrápodos modernos consiste en 5 elementos o menos

(mano: metacarpos, pie: metatarsos) que constituyen

parte de los “rayos digitales”. Se numeran I a V desde

anterior (pulgar) a posterior (meñique)

Los dígitos se encuentran distales al metapodio y estan

compuestos por falanges.

“tetrapodos modernos” (neotetrapoda): Todos los descendientes del ancestro común mås reciente compartido por los dos principales grupos de tetrápodos vivientes (lisanfibios y amniotos)

Hueso sesamoide: osificación

intratendinosa.

El hueso pisiforme también se origina al interior de un tendón,

sin embargo hay quienes

afirman que corresponde al elemento mesopodial C4

El “pulgar del panda” es un hueso

neomórfico (“nuevo) y sesamoide

7#.%((3""3)'#)"%)#$4(#F0'%')'#)4#4(%83'3.B)J")8(0F3('03)'#)"%)#$4(#F0'%')K"0F2)2<'Q))

.#)'#.%((3""%)%)8%(H()'#)"%).3F%438"#<(%)KW8"%;%)"%4#(%"XQ))

10F2)2<'.B)

1%)#$8(#.0Y&)FG.)%&4#(03()'#)M3$=UZ);30&;0'#);3&)"%)83.0;0Y&)'#)"%.)#$4(#F0'%'#.)

%&4#(03(#.)5)"%)4(%&.0;0Y&)'#)D#(4#2(%.);#(D0;%"#.)%)43(G;0;%.)

M0&'"0F2B)@04$U[))#.)#$8(#.%'3).Y"3)#&)"%).3F%438"#<(%)83.4#(03()

10F2)9<')K8(0F3('03)'#)"%)#$4(#F0'%'Q)J.)"%)<&0;%)L3&%)'3&'#)"%).3F%438"#<(%)

%4(%#)"%)F0-(%;0Y&)'#)F532"%.43.)%)8%(H()'#)"3.)F5343F3.)'#)"3.).3F043.))

!JS)

!80;%")J;43'#(F%")S0'-#)K(#23('#)#;43'P(F0;3)%80;%"Q)

El mesodermo transplantado

mantiene la identidad de la extremidad

(brazo o pierna)

AER permite el

crecimiento hacia

fuera

J")!JS)#.)(#I<#(0'3)8%(%)#");(#;0F0#&43)?%;0%)V<#(%)83()%'0;0Y&)'#)#"#F#&43.)FG.)'0.4%"#.)

J")F#.3'#(F3)#.)0F83(4%&4#)8%(%)'#4#(F0&%()"%)83"%(0'%')%&4#(3U83.4#(03()

\F8"%&4#.)?#4#(3;(Y&0;3.)'#)!JS)])F#.P&I<0F%)K^Y"3)!JS)&3)?%5)V#&3H83)%"4#(%'3Q)

Identidad brazo o

pierna de primordios

Correlación de la identidad con la

expresión anterior de

Tbx5 y posterior de Tbx4

Posible caso de thomesis epidérmica: Microraptor gui

ZPA: Zone of Polarizing Activity

Las identidad de las

condensaciones digitales permanece indeterminada

hasta estadios tardios, permitiendo la alteracion

experimental de la identidad

de una condensación de acuerdo al mesénquima

interdigital posterior a cada condensación (Dahn and

Fallon 2000).

En una mano pentadáctila tipica de tetrápodos modernos: El primer digito que inicia la formacion de cartilago es el dedo 4, que está espacialmente en línea con el calcáneo/ulnare y la ulna/fíbula, definiendo un ‘eje primario”

Chelydra (tortuga) mano

Gallus (ave) pie

Secuencia altamente conservada de formación de cartílago; El “eje primario” de

formaciíon de cartílago

Burke and Feduccia 1997

Eje primario

Los genes HoxA y HoxD más posteriores se expresan de manera

dinámica en la extremidad, con patrones de expresion tempranos y tardíos distintos (que afectan distintos segmentos proximo-distales)

En la fase tardía (III), los genes HoxD10, D11, D12, D13 y A13 se expresan en los dedos 2-5, en cambio sólo

HoxD-13 y A-13 se expresan en el dedo 1

Origen de las extremidades pareadas

Hipótesis: Las extremidades son homólogas a aletas longitudinales como la aleta media

Los primeros vertebrados sólo poseían la aleta media, que incluye la región caudal (de la cola). No poseían aletas de las

extremidades (aletas pectorales y pelvicas). Las aletas pareadas de las extremidades sólo aparece en gnathostomos

troncales (stem gnathostomes)

Existen varias semejanzas embriológicas

y de expresión genética entre el primordio

de la cola y el de las extremidades, incluyendo la presencia de un VER

(“ventral ectodermal ridge”) semejante al

AER

La expresión de genes Hox posteriores podría deberse a que la

aleta original (la caudal) se encuentra hacia la región posterior del cuerpo.

Aletas pélvicas

Aletas pectorales

Las aletas pareadas pectorales (“brazos”) surgen antes de las pélvicas (“piernas”)

En todas las aletas se puede observar un eje central del cual se proyectan “rayos” (radiales) y que se

argumenta corresponde al eje principal de formación de cartílago de las extremidades de tetrápodos

En sarcopterigios rhipidistianos (en la imagen, sauripteris en adelante) hay un patrón de

“bifurcación del eje metapterygio” que se corresponde con el arreglo observado en tetrápodos

En tetrápodos troncales hacen su aparición los dedos definitivos

Teoría original sobre el origen de los dedos (basado en comparación

de tetrápodos con zebrafish): Los dedos se habrían originado junto con fase tardía de expresión de

genes Hox

(Error en la imagen: La expresión de D-11 es la de D-13 y viceversa)

Correción tras observar tiburones y actynoperygios basales: La fase 3 de expresión es mucho más

antigua y perdida secundariamente en el linaje conducente a los teleósteos. Los radiales parecen

corresponderse con el autopodo

Symphysis

Acetábulo

Hay polydactylia ancestral en tetrápodos troncales, luego pérdida de dedos y pentadactilia en

el pie y la mano de los primeros tetrápodos modernos. En estos, el dedo más anterior (dedo

1) es bifalangeal. Se denomina “pollex” en la mano y “hallux” en el pie

Oster et al 1988

En “Lepospóndilos” (Primeros

Batrachomorpha, ancestros de los anfibios

actuales) en la mano ha ocurrido una reducción a 4 dígitos. Estos pueden ser los

digitos 1,2, 3 y 4 pero en ranas, el eje

primario de formación de cartílago sugiere

que son 2,3,4, y 5

Nótese la presencia de aparentes dedos

vestigiales “prepollex”, “postminimus”

Presencia de prepollex y prehallux anterior al dedo 1 en manos (A) y pies

(B) de Xenopus.

Ojo: una sola costilla

sacral en anfibios

Los urodelos poseen extremidades de desarrollo anormal dentro de los

tetrapoda. La secuencia de formacion de cartilago es diferente (ocurre primero hacia anterior, en el dedo 1). No hay AER morfologico y hay expresion

autopodial de HoxA-11

A partir de una diferencia en la secuencia en que se forma el cartílago en las extremidades de las salamandras

respecto a los demás tetrápodos, Holmgren propuso una teoría difilética, en que dos grupos de peces distintos habrían “conquistado la tierra”, evolucionando las extremidades de

manera independiente.

En realidad, hay un sólo origen de las extremidades de los tetrápodos: es el desarrollo el que ha cambiado en

salamandra.

Manus

Pes

En cambio, los tetrápodos mas cercanos a los amniotos que a los anfibios

modernos (“anthracosaurios” o reptiliomorphos) como Seymouria retuvieron la pentadactilia ancestral en la mano y presentan un numero especifico de falanges

en cada dígito: 2-3-4-5-3 en la mano, y 2-3-4-5-4 en el pie

P A

Captorhinus: amniote temprano más cercano a el linaje reptiliano que al

linaje de los mamíferos. También presenta la fórmula 2-3-4-5-3 en la mano y 2-3-4-5-4 en el pie

P A

Manus Pes

Ophiacodon es un amnioto temprano más cercano a los mamíferos que a los

reptiles. Tambien presenta 2-3-4-5-3 en la mano y 2-3-4-5-4 en el pie. Por lo tanbto toda la evidencia indica que esta formula estaba presente en el ancestro

comun mas reciente de los amniotos

Manus Pes

P A

La misma formula falangeal ha sido retenida por varias especies de lagaratijas

desd ele ACMR de los amniotos

P A

Manus Pes

Homeosis en la Evolución del Ala de las Aves Nueva Evidencia Comparativa y Experimental

Dr Alexander Vargas

Departamento de Biología Facultad de Ciencias Universidad de Chile

Alligator mississippiensis

Gallus gallus (chicken)

Burke and Feduccia 1998 Science 278: 666

Ulna

El ala tridáctila de las aves evolucionó a partir de una mano reptiliana ancestral pentadáctila; los dedos

del ala se desarrollan a partir de condensaciones cartilaginosas que en tetrápodos pentadáctilos dan origen a los dedos 2,3 y 4 (índice, medio y anular)

El eje primario de formación de cartílago en pentadáctilos

siempre da origen al dedo 4 y está en línea con la ulna y el

ulnare

Ulnare

Ulna

1

2 3 4 5

Origen del “problema”: Embriología comparada vs. Morfología comparada

Además, es posible observar en el ala

la presencia de pequeñas condensaciones embrionarias que

aparentan ser un pulgar (dedo 1) y meñique (dedo 5) vestigializados

Embrión de avestruz (Struthio)

Nowicki & Feduccia 2002 Naturwissenschaften 89: 391

Sin embargo, la morfología comparada (de taxa fósiles y vivientes)

identifica a los dedos del ala de las aves como 1, 2 y 3

Wagner y

Gauthier 1999 PNAS 96:5111

Solución

propuesta:

1,2,3 = 2,3,4.

Inferencia de un

evento de Desplazamiento

Homeótico en Serie (“DHS”)

(Homeotic Frame-

shift ) en la evolución del ala

Feduccia 1999 PNAS

A algunos puede tomarles un tiempo entusiasmarse con el DHS…

(A) Alligator (B) The early ornithischian dinosaur Heterodontosaurus (C) The early theropod Herrerasaurus (D) The Neotheropod Coelophysis (E) The tetanuran Allosaurus (F)The early maniraptoran Ornitholestes (G) the early bird Archaeopteryx (H) the

enanthiornithe Sinornis (I) nestling of the modern Opisthocomus (J) 12.5 day embryo of the duck Anas (K) the adult chicken Gallus gallus (L) Adult Opisthocomus.

Cambios de identidad especificados por mesénquima interdigital posterior a cada dedo A)

Esquema de B) retirada de interdígito (ID) posterior a dedo 2 C) retirada de interdígito posterior a dedo

3 D) Control: injerto de condensación 2 en ID 2 y E) condensación 3 en ID 3. F) Condensación 3 en ID 2 G) Condensación 2 en ID 3

Dahn y Fallon 2000 Science 289: 438

En extremidades en que no hay controversia sobre la identidad de los dedos

(ratón, pie del pollo) la expresión de genes Hox se utiliza para identificar el desarrollo del dedo 1. HoxD-10, HoxD-11 y HoxD-12 están ausentes sólo en el

dedo 1, pero se expresan en todos los demás dedos. HoxD-13 y HoxA-13, en cambio, se expresan en todos los dedos, incluído el dedo 1

HoxD-12 HoxD-13

Brazo

Pierna

11.5 12.5 11.5 12.5

Chiang et al 2001 Dev Biol 236: 421

1

3

2

4 5

1 2

3

4

5

Expresión forzada de HoxD-12 en el dedo 1 de

ratón: transformación a un dedo 2

Expresión forzada de HoxD-12

en pie de pollo (colaboración con Fallon lab) sugiere

conservación funcional de HoxD-12 en ratón y pollo

(pese a 300 millones de años

de divergencia evolutiva)

Expresión forzada de

HoxD-11 en dedo 1 del pie del pollo:

transformación a un dedo 2

EXPERIMENTOS FUNCIONALES

En el ala, HoxD-10, HoxD-11 y HoxD-12 están ausentes sólo en el dedo

bifalangeal anterior del ala. La expresión genética sugiere que este es un dedo 1, pese a

desarrollarse a partir de la posición embriológica del dedo 2.

Vargas & Fallon 2005 JEZB (MOL DEV EVOL) 304:86

Vargas and Fallon 2005 JEZ B (MDE) 304:86

Pie pollo Mano ratón

HoxD-13 HoxD-12 HoxD-13 HoxD-12

Mano de pollo (dias 7 y 8)

¿Qué tal si la ausencia de expresión de HoxD-12 es sólo cosa de ser el dedo más anterior?

Los mutantes de pollo talpid2 y Silkie presentan un pie con un eje antero-posterior alterado. talpid2 muestra un pie “posteriorizado” y polidáctilo, sin

dedo 1. En Silkie, el dedo más anterior no es el dedo 1 sino un dedo 2

ectópico

Silkie Talpid2

Vargas & Fallon 2005 JEZB 304:86

En ratón, HoxA-13 se expresa en todos los dedos, pero sólo el dedo 1 requiere HoxA-13 para su formación. Es el único dedo que desaparece en ausencia de

función de HoxA-13

Image from Fromental-Ramain et al. 1996

Para observar la “función” de HoxA-13 en el ala, un alelo dominante negativo

(putativo) para HoxA-13 fue contruido que comprende una fusion of dominio represor de la transcripción del gen engrailed de drosphila y una región de

HoxA-13 (EnHoxA-13) en un vector retroviral que fue electroporado en el primordio del ala en estadio 17

Datos preliminares: Como resultado, el dedo anterior del ala dejó de

formarse sugiriendo que sólo este dedo requiere HoxA-13, tal como el dedo 1 del ratón.

Desplazamiento

Homeótico en Serie:

Identidad y

expresión de HoxD10-12

hacia posterior

Ratón Pollo

Pero, el ratón es sólo un

pariente lejano de las

aves. Los crocodylia son los parientes vivos más

cercanos a las aves.

Aproximación

comparativa:

Si el dedo más anterior

del ala es un dedo 2, es

posible que en los

crocodilia el dedo 2 no

exprese HoxD-10, HoxD-11 y HoxD-12

Si, de acuerdo al DHS, la

ausencia de HoxD-10, HoxD-11 y HoxD-12 en el

en el ala de las aves

indica, como en el ratón,

el desarrollo del dedo 1, la

ausencia de expresión debiera observarse sólo

en el dedo 1 de parientes

más cercanos de las aves

Clonamos un fragmento del exon 1 de HoxD-11 de Alligator

mississippiensis para observar su expresión en dedos embrionarios.

Vargas et al 2008 PLoS ONE 3(10): e3325

Como en el ratón, en Alligator, HoxD-11 está ausente sólo en el dedo 1

bifalangeal; el dedo anterior del ala se parece exclusivamente al dedo 1 de Alligator

Esto es consistente con el DHS, que mantiene que los dedos del ala son 1,2 y 3 pese a desarrollarse a partir de las condensaciones 2,3,y 4

Vargas et al 2008 PLoS ONE 3(10): e3325

La transformación homeótica de dedos se ha

documentado, pero sólo para dedos

individuales

Dahn y Fallon 2000 Science 289:438

La evidencia experimental: ¿Es posible un DHS

en el lab?

Sin embargo, nunca se ha demostrado el desplazamiento en serie,

simultáneo de más de un dígito. ¿Podemos inducir un DHS de manera experimental?

Scherz et al. 2007 Dev Biol 308:343

La aplicación de cyclopamina en estadios 18-20 produce alas bidáctilas

con dedos 1 y 2.

¿Dónde está el eje primario

de formación de cartílago en estas alas experimentales?

Cyclopamine

=2*>8&$#12?')2*')@'5,*$2*-,A2$'B2&'()*+,*C@@D*%)*?#3:(;,)#*.%,*-,*/32)-&3'5,*

,)*%)2*3,;'()*1#-/,3'#3D*+,-+,*+#)+,*-%*13#/,<)2*+'-?')%8,*-%*&#)&,)/32&'()*

,)*;32+',)/,*@2&'2*2)/,3'#3*

En 9/54 casos, las alas bidáctilas presentaron un cartílago anterior al

dedo 1 que no se desarrolla en un dígito. Esta puede corresponder a células con potencial condrogénico que normalmente producen un

dígito pero que quedan “vacantes” (sin identidad especificada) tras el DHS hacia posterior

Wildtype

Cyclopamine-Treated

La expresión de

HoxD-12 también está desplazada, una

posición digital más cerca del eje

primario de

formacion de cartílago

La pérdida del dedo posterior, el

desplazamiento de la morfología y de

la expresión de

HoxD-12, y la aparición de un

cartílago anterior “vestigial”, fueron

todas previamente

implicadas para el DHS evolutivo. Esto

sugirie que el mecanismo del DHS

se sobrepone con el

de la vía de señalización de Shh

Conclusiones

La ausencia de HoxD-12, HoxD-11 y HoxD-10 en dedo 1 es ancestral para amniotos y conservada en ratón y pollo

El caso del ala de las aves ejemplifica cómo el origen embriológico

puede no ser infalible como indicador de homología (pese a que generalmente funciona)

Como previamente no se habían

descrito desplazamientos homeóticos en serie experimentales,

la aplicación de cyclopamina confirma una posibilidad mecanística

que previamente había sido inferida

mediante comparaciones evolutivas.

(La naturaleza no hace distinción

entre ciencias experimentales y comparativas; los mismos

mecanismos se ven reflejados en

ambas)