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II/ Fitocromo y Crecimiento: Introducción; Respuestas a estímulos lumínicos: La Radiación Solar es fundamental para todos los vegetales, entre otras cosas para realizar la fotosíntesis reduciendo el CO2 y formando materia orgánica. Sin embargo las plantas presentan numerosas respuestas a los estímulos, de distintas clases:

Fototropismo: Respuesta a estímulo direccional.

Fotoperiodo: Respuesta a estímulo periódico.

Fotomorfogénesis: Relacionada con el Fitocromo. Es la modulación del crecimiento por la calidad y cantidad de luz.

Fotonastias: Movimientos vegetales no relacionados con el crecimiento, debidos a estímulos lumínicos (por ejemplo orientación).

Fotosíntesis: Transducción biológica de la energía. La cantidad y calidad de luz solar, su dirección y su periodicidad realizan

un importante papel en el desarrollo de los vegetales, aportándolas además información sobre el ambiente; sobre la latitud, la estación, la presencia de un dosel vegetal,… La conformación final de los órganos de la planta, unos respecto a otros, no está tan determinado genéticamente ya que está fuertemente sujeto a la posible variación ambiental geográfica y estacional, y a la competencia. En ambientes naturales, la competencia por fotones es, tal vez junto con la depredación por herbívoros, uno de los mayores retos de los vegetales. Esa competencia ha llevado a los vegetales a la Etiolación durante los primeros estadíos del desarrollo (carencia de pigmento y de aprovechamiento de la luz).

Los Pigmentos son moléculas con capacidad de absorber fotones para alimentar una cadena de transferencia de electrones que facilita la formación de ATP. La coloración de estos compuestos no es debido al color de la longitud de onda que absorben, sino al color que no absorben; por ejemplo la clorofila verde no absorbe luz verde. Los Fotorreceptores son moléculas que también tienen la capacidad de absorber fotones, pero que sin embargo desencadenan un mecanismo de acción. Entre los principales Fotorreceptores se encuentran:

Fitocromo: Efecto morfogenético. Regulado por radiación roja (R) y rojo lejano (RL).

Criptocromo: Regulado por radiación cercana al visible, entre el azul y el ultravioleta-A.

Fotorreceptor de luz UV: Detecta la radiación más lejana del visible; ultravioleta-B (mutágenesis). La cantidad y calidad de luz que alcanza la superficie de la tierra,

atenuada por la atmósfera, es muy distinta a la emitida por el sol. La radiación útil para los organismos vegatales es la luz visible, ultravioleta y rolo lejano (o intfrarrojo). La eficacia de las especies vegetales se relaciona con su eficacia de absorción de fotones. La competencia por los fotones no solo tiene lugar entre los distintos individuos y especies de un ecosistema, sino que ocurre también entre los Pigmentos vegetales y los Fotorreceptores vegetales.

A/ El Fitocromo: 1.- Generalidades: El Fitocromo presenta dos configuraciones, en función de la longitud de onda máxima de los fotones que absorbe. La forma Pr absorbe fotones de luz de

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longitud de onda cercana al rojo (660 nm), mientras que la forma Pfr (far red) absorbe fotones de longitud de onda del rojo lejano (730 nm). Al absorber fotones ambas formas se interconvierten: FOTOTRANSFORMACIÓN 660 nm

(Inactivo) Pr Pfr (Activo, muy lábil)

730 nm FOTORREVERSIÓN Mecanismo

de acción: Regulación de la expresión génica

El Fitocromo es por excelencia el responsable de las respuestas fotomorfogenéticas de las plantas. Su descubrimiento e identificación es relativamente reciente (1995), aunque existen algunas referencias anteriores inexactas. Flint y col. (1939) estudiaron la germinación de semillas de lechuga, y observaron que en función del tipo de luz al que estuviesen expuestas su tasa de germinación era distinta. En oscuridad la tasa era cero, mientras que con luz roja la tasa era muy elevada. Borthwich y col. (1952) realizaron experimentos muy similares y observaron que aunque la tasa de germinación era muy alta cuando las semillas eran irradiadas con luz R, era sin embargo muy baja cuando las semillas eran irradiadas con luz RL. Butler y col. (1995) trabajaron también con semillas de lechuga y descubrieron la molécula responsable de las diferentes tasas de germinación; el Fitocromo. Estas semillas son fotoblásticas y fotosensibles, y por lo tanto necesitan luz roja para germinar. Descubrieron que el efecto de la luz era reversible (tabla), y que sólo influía la longitud de onda de la última radiación suplementada. Este proceso recibe el nombre de Fotorreversibilidad. La fotorreversibilidad se debe a la capacidad del Fitocromo de cambiar de una configuración a otra hasta que sea degradado:

R Alta [Pfr] Alta tasa de germinación

R>RL Baja [Pfr] Baja tasa de germinación

R>RL>R Alta [Pfr] Alta tasa de germinación

R>RL>R>RL Baja [Pfr] Baja tasa de germinación

R>RL>R>RL>R Alta [Pfr] Alta tasa de germinación

La forma biológicamente activa es Pfr, ya que su concentración es la que realmente desencadena los mecanismos de acción. Los dos únicos tipos de efecto fisiológico que puede presentar el Fitocromo son el Fotocontrol Positivo y el Fotocontrol Negativo, aunque su efecto puede controlar distintos caracteres morfogenéticos: Se dice que están fotocontrolados positivamente aquellos procesos que son estimulados por la radiación roja, es decir, aquellos que se activan ante altas concentraciones de Pfr. En el caso de la semilla de lechuga, se dice que la germinación está controlada por Fotocontrol Positivo. Se dice que son fotocontrolados negativamente aquellos procesos que son inhibidos por la radiación roja, es decir, aquellos que se activan ante bajas concentraciones de Pfr (se puede decir que son estimulados por la radiación del RL, y activadas por altas concentraciones de Pr, aunque es menos exacto). Por ejemplo, en el caso de la elongación de los hipocóticos en determinadas

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especies adaptadas a vivis bajo el dosel de grandes comunidades vegetales se habla de Fotocontrol Negativo. El carácter de reversibilidad de los experimentos realizados sobre morfogénesis permite confirmar que el efecto estudiado está relacionado con el Fitocromo, principal fotorreceptor vegetal. 2.- Estructura y propiedades químicas: Se conocen cinco tipos de Fitocromo (A, B, C, D y E) con sus respectivos genes phy. El Fitocromo A controla la Respuesta de Baja Energía. El Fitocromo B controla la Respuesta de Alta Energía.

El Fitocromo se forma de una base proteica (una Apoproteína) y un Cromóforo (molécula con capacidad de absorber luz). Se trata de una Cromoproteína.

El Cromóforo está formado por cuatro pentosas alineadas unidas por carbonos (fig. 5, 6). Esta Bilina es sintetizada en la Ruta del Acetato-Mevalonato, al igual que la mayoría de Cromóforos y Pigmentos. Su precursor

en la ruta es -amino levulínico, que se transforma posteriormente en Bilina, y finalmente en el Tetrapirrol lineal.

La Apoproteína es sintetizada por expresión génica. La regulación de la biosíntesis de la Aporproteína está regulada por la propia concentración de Fitocromo Pfr, de tal manera que las concentraciones altas reprimen su síntesis. Ambas partes, una vez sintetizadas, se unen formando la Holoproteína; el Fitocromo en forma Pr.

Se trata de una Apoproteína de forma Elipsoidal, con una cavidad hidrofóbica donde se aloja el Cromóforo. Este se une en una Cys cercana al N-terminal, por medio de un enlace Tioeter. La proteína forma un dímero, de manera que una molécula de Fitocromo está formada por dos Holoproteínas. Las regiones de dimerización y las secuencias de localización nuclear (dirigen al Pfr al núcleo) se encuentran en los Dominios PAS, son cercanos al extremo C-terminal, donde están los Dominios Histidina Kinasa responsables de la Autofosforilación. Cada monómero está formado por dos regiones globulares unidas por una Región Bisagra, responsable de cambios conformacionales. También cuenta con Dominios PHY capaces de estabilizar la forma Pfr (fig. 7).

El Cromóforo es lógicamente la región de la molécula capaz de absorber fotones. Determina las características espectrales y el carácter fotorreversible de la molécula. Esta molécula presenta isomería cis-trans en los tres enlaces entre los ciclos. En la forma Pr los dos primeros enlaces entre pentosas son cis, pero el tercero es trans. Al recibir radiación R el isómero cis-cis-trans se transforma en cis-cis-cis; la forma Pfr, y al recibir radiación RL recupera su forma estereoisomérica inicial. Este cambio en la isomería del Cromóforo desencadena un cambio de conformación en la región bisagra de la parte proteica, que queda estabilizado en su nueva conformación Pfr por medio de los Dominios PHY; así la proteína se autofosforila en el Dominio Histidina Kinasa y se activa (fig. 8). Una gran cantidad de fitocromo Pfr activo penetra al núcleo celular dirigido por los Dominios PAS (de dimerización) donde tiene capacidad de modulación de la expresión del genoma. Además el Fitocromo es capaz de desencadenar mecanismos de acción rápida a nivel de la membrana celular. 3.- Metabolismo del Fitocromo e Influencia de la Radiación: Se diferencian dos tipos de reacciones relacionadas con el metabolismo del Fitocromo: las Reacciones Dependientes de Luz y las Reacciones No Dependientes de Luz. El conjunto de reacciones implicadas en el metabolismo del Fitocromo juega un importante papel en el desencadenamiento de los

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principales mecanismos de acción. Es de hecho decisivo en el balance final de Pr/Pfr. (fig. 10)

Reacciones Dependientes de Luz FOTOTRANSFORMACIONES

Reacciones No Dependientes de Luz

Fotoconversión

Fotorreversión

Síntesis

Degradación

Reversión Oscura

El Espectro de Absorción de luz monocromática de las dos formas de

Fitocromo (fig. 9) muestra que la eficacia máxima de la Fotoconversión tiene lugar con luz de longitud de onda de 660 nm, mientras que la Fotorreversión tiene su máxima eficacia a 730 nm. Entre 600 nm y 700 nm se produce un solapamiento de absorción, y competencia, por lo que en realidad a 660 nm (máximo de absorción de Pr) también se produce cierta Fotorreversión. Sin embargo, a partir de 700 nm sólo se produce absorción por Pfr, por lo que a 730 nm se habla de una eficacia de 100%, que nunca tiene lugar con Pr.

La influencia de la radiación solar sobre el metabolismo del Fitocromo

permite a la vegetación adaptarse y perfeccionándose de manera que son capaces de extraer del balance Pr/Pfr una preciada información sobre el ambiente y la estación del año. En condiciones naturales las plantas reciben una radiación policromática (en experimentos se utilizan focos de luz monocromática), generalmente blanca. El balance de Fitocromo depende por lo tanto en especial de la intensidad de la radiación (velocidad de la fluencia fotónica). La cantidad y calidad de los fotones de luz es muy variable a lo largo del día y a lo largo del año, y lo es en particular la luz roja e infrarroja (RL)

La variación diaria es el Fotoperiodo o Ritmos Circadianos. Durante los amaneceres y atardeceres, cuando la incidencia de la radiación es muy oblícua, hay una radiación RL especialmente elevada, mientras que durante las horas de mediodía esta es minimizada, a favor de la radiación R.

Del mismo modo la variación anual o estacional es conocida como Ciclos Fenológicos. En latitudes moderadas y altas se producen intensas variaciones en el patrón de la radiación solar que alcanza la cubierta vegetal, y no solo en las horas de luz al día, sino que se producen además contínuas fluctuaciones del cociente R/RL. En verano en nuestra latitud el día se alarga, alargándose el mediodía, y la radiación incide casi en ángulo recto con la superficie, por lo que hay mayoritariamente radiación R. En invierno, por el contrario, el mediodía es corto y la radiación siempre es más o menos oblícua, por lo que aumenta la radiación RL.

La degradación del Fitocromo puede producirse tanto en su forma Pr como en su forma Pfr, aunque esta última forma es mucho más labil, y su velocidad de degradación es mucho mayor (fig. 11). Además, la velocidad de degradación de Pfr viene determinada por los niveles de Φ (A/1). Las formas degradadas, P’r y P’fr no son interconvertibles.

La Reversión Oscura es una transformación espontánea, no dependiente de luz, por la que Pfr revierte a Pr. La Reversión Oscura Inversa es un proceso exclusivo de algunas semillas en periodo de inhibición, donde Pr se transforma en Pfr en los tejidos etiolados, en ausencia total de radiación. Debe conllevar algún gasto energético.

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A/ El Fotoequilibrio: 1.- Valor de Fotoequilibrio y Estado Fotoestacionario: En la actualidad se conocen 5 moléculas de Fitocromo distintas, aunque se separan en dos grupos: Tipo 1 (Fitocromo A) y Tipo 2 (como el Fitocromo B, y el C). Los modos de acción y mecanismos y efectos fisiológicos son homólogos pero no exactamente iguales. Ajustaremos nuestra descripción a los Fitocromos Tipo 1 (Fig. 13).

El Fotoequilibrio o Valor de Fotoequilibrio (Φ) es un equilibrio dinámico que depende de las concentraciones de las dos formas de Fitocromo expuestas a Fototransformaciones. Depende por lo tanto de las longitudes de onda de la radiación recibida, y sus proporciones: Será alto con tratamiento de luz R y bajo con tratamiento de luz RL. El Estado Fotoestacionario se define como el valor de fotoequilibrio que condiciona el desencadenamiento de la respuesta (umbral).

Φ = [𝑃𝑓𝑟 ]

𝑃𝑓𝑟 + 𝑃𝑟 . 100 =

[𝑃𝑓𝑟 ]

𝑃𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 . 100 (%)

Además, el Valor de Fotoequilibrio controla la velocidad de degradación

de Pfr, de tal manera que cuando el valor de Φ es alto, se dispara la degradación. Cuanto mayor es [Pr], más se estabiliza la concentración de Fitocromo total ([Ptotal]). El Estado de Mínima Estabilidad se alcanza cuando, dentro del equilibrio de reacciones, [Pfr] es suficientemente elevado como para desencadenar el mecanismo de acción.

Ante luz R, [Pfr] es elevado y también lo es el valor de Fotoequilibrio; Este estado favorece la degradación del Pfr activo, pero inhibe la síntesis de Pr por retrocontrol negativo del gen phy. Debido al control indirecto que la luz ejerce sobre la síntesis y la degradación de Fitocromo, en cuanto la calidad de la luz varíe y disminuya la cantidad de luz R (aún en ausencia de luz RL) se verá favorecida la caída del Valor de Fotoequilibrio por la degradación y la reversión oscura del Pfr, lo cual favorecerá la síntesis de Pr y la caída de hasta un nuevo estado de equilibrio. Por ello, en oscuridad siempre se produce síntesis de Pr (fig. 14).

El Valor de Fotoequilibrio nunca alcanza realmente el 0 % ni el 100 %.

Con radiación monocromática roja de 660 nm; Φ = 81%, mientras que con radiación monocromática de 730 nm; Φ = 0,02%. Aunque se sabe que fisiológicamente Pfr es la forma activa desencadenante del mecanismo de acción, se considera el valor Φ como desencadenante ya que marca el umbral de activación del mecanismo de acción (Estado Fotoestacionario).

El Fotoequilibrio depende de varios factores distintos:

El cociente R/RL

Reversión Oscura y Reversión Oscura Inversa

Degradación

Síntesis de Pr Mediante distintos tratamientos con luces monocromáticas en

laboratorio podemos modificar el Valor de Fotoequilibrio y valorar las distintas respuestas fisiológicas del vegetal.

El Valor de Fotoequilibrio viene por lo tanto determinado en condiciones de oscuridad absoluta por 4 reacciones distintas (síntesis, degradaciones y Reversión Oscura), y en presencia de luz por 6 reacciones (Fotoconversión y Fotorreversión).

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Los Tipos de Respuestas inducidas por los distintos Tipos de Fitocromo se diferencian sustancialmente en Reacciones de Alta Irradianza (HIR), irreversible, característico de los Fitocromos Tipo 2, y las Reacciones de Baja Irradianza (LFR), reversible, y de Muy Baja Irradianza (VLFR), irreversible, también llamadas Reaciones de Inducción (LIR), características de los Fitocromos Tipo 1 (fig. 16, 17, 18).

En los ensayos de laboratorio, tanto la Intensidad como el tiempo de aplicación de la luz son determinantes para los resultados. La Intensidad de la radiación corresponde a la fluencia fotónica, es decir, a la cantidad de fotones

que fluyen por unidad de superficie (𝜇𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑓𝑜𝑡𝑜𝑛𝑒𝑠/𝑚2). La Irradianza Total

depende tanto de la Intensidad como del tiempo

𝐼𝑟𝑟𝑎𝑑𝑖𝑎𝑛𝑧𝑎 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 =𝐹𝑙𝑢𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑓𝑜𝑡𝑜𝑛𝑒𝑠

𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 (

𝜇𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒𝑓𝑜𝑡𝑜𝑛𝑒𝑠

𝑚2 . 𝑠)

HIR LIR

Luz contínua o de alta Intensidad. Alta Irradianza

Pulsos o Flashes cortos de luz, de baja intensidad. Baja Irradianza.

El Fitocromo A es muy abundante en Plántulas Etioladas, pero escaso en

plantas verdes. Presenta rápida destrucción ante radiaciones intensas. Los Fitocromos B y C se encuentran siempre en bajas concentraciones, pero son estables en presencia de luz. Sus localizaciones son todos los órganos vegetales, aunque destaca su presencia en los tejidos jóvenes, zonas meristemáticas y zonas de elongación. Pr encuentra de forma difusa en el citosol, mientras que Pfr forma gránulos y es capaz de penetrar al núcleo, dirigidos por las regiones PAS (fig. 20, 21).

2.- Efectos fisiológicos del Valor de Fotoequilibrio: Los efectos fisiológicos se explican por el mecanismo de acción

molecular de Pfr, pero dependen del valor Φ. Sus efectos se ejercen a lo largo de toda la ontogenia vegetal; durante la germinación, la desetiolación y abertura del gancho plumular, la floración, y la senescencia (fig. 22, 23). Son efectos muy diversos en función del estadío de desarrollo de la planta, que también depende de las distintas especies vegetales. El Fitocromo tiene capacidad de detectar cambios ligeros en el cociente de R/RL de la luz solar natural. Este cociente recibe el nombre de Razón de

Flujo Cuántico (𝜍). Cuando 𝜍 aumenta lo hace también Φ. Estas diferencias sensibles en 𝜍 pueden aportar información de varios tipos como la proximidad de otras plantas y presencia de dosel, la posición de la semilla en el sustrato o

el paso del tiempo (fig. 24). El valor de 𝜍 varía en función de diversos factores (fig. 25, 26, 27):

De la atenuación cuantitativa y cualitativa al atravesar el sustrato: cuanto mayor es la profundidad menor es la intensidad de radiación, y menor es 𝜍.

De la atenuación cualitativa y cuantitativa al atravesar el dosel:

disminuye la intensidad y 𝜍. La luz que atraviesa el dosel es principalmente verde. A menudo el bajo Φ desencadena la Respuesta de Escape al dosel, para optimizar la captación de luz (fig. 25).

De la inclinación de la radiación a lo largo del día: Cuanto mayor es la

oblicuidad de la radiación menor es 𝜍.

De la inclinación de la radiación y la longitud de los días a lo largo del año: Durante los solsticios la radiación alcanza sus máximas o mínimas perpendicularidad y longitud del día (nuestra latitud).

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Podemos deducir que existen un gran número de parámetros ambientales y bióticos que pueden ejercer su influencia en el balance del Valor de Fotoequilibrio, y que la planta puede detectar:

La atenuación debido al dosel vegetal (o cobertura), por presencia de especies vegetales de mayor porte.

La atenuación de la radiación por el sustrato, factor especialmente importante para la germinación de muchas semillas.

La atenuación de la radiación por la atmósfera: Nubes (reflexión de RL), Capa de ozono (reflexión de UV) y otros gases.

La variación debida a la rotación de la tierra.

La variación debida a la Latitud.

La variación estacional debida a la órbita y la inclinación de la tierra. Las especies vegetales de bajo porte, adaptadas a vivir bajo un dosel

vegetal formado por especies de mayor porte reciben el nombre de Orla Forestal o Plantas de Sombra, y se han adaptado al aprovechamiento de este tipo de luz de baja intensidad y calidad mayoritariamente verde, con una gran proporción de RL. En muchas Plantas de Sombra no existe fotocontrol de la elongación, mientras las plantas de sol suelen presentar Fotocontrol -: la reacción de escape al dosel. Las plantas que se encuentran en condiciones no óptimas según su determinismo genético pueden presentar anomalías como Gigantismo y Enanismo, siempre que se encuentren fotocontroladas. Además el Fitocromo controla las respuestas de estrés por ausencia crítica de luz en plantas de sol: mayor alargamiento del tallo, mayor grosor foliar, alto cociente clorofila a/clorofila b, alta fijación de CO2.

Efectos del Fitocromo en elongación del tallo

Fotocontrol + Fotocontrol - (Planta de sol)

Φ elongación Φ elongación

↑ ↑ ↑ ↓

↓ ↓ ↓ ↑

Las semillas fotoblásticas y fotosensibles dependen de la luz durante su

germinación. De nuevo la calidad y cantidad de esa luz aporta información esencial sobre la presencia de dosel, y sobre el enterramiento de la semilla en el sustrato. La calidad y cantidad de luz varía sensiblemente en cada milímetro en profundidad en el sustrato, especialmente en los 5-10 primeros milímetros. Si se produce Fotocontrol negativo, la semilla debe estar suficientemente enterrada para germinar. Si se produce Fotocontrol positivo la semilla debe encontrarse en la superficie para recibir suficiente luz roja.

El Fitocromo Pfr presenta dos tipos de mecanismos de acción; lenta y rápida. Las respuestas al mecanismo de acción rápida es una regulación de las proteínas de membrana y de los flujos iónicos transmembrana. La transducción de esta señal es mediada por Receptores asociados a Proteína G. Por un lado modifican los canales de Ca2+ induciendo un flujo de entrada de calcio a la célula. Se produce una despolarización de la membrana y alteración de los canales, y una modulación de kinasas. Por otro lado se produce la modulación de Adenilato ciclasa induciendo la formación de AMPc, que producirá la activación de los canales de Ca2+ regulados por AMPc. Además el Fitocromo autofosforilado en el Dominio Histidina Kinasa presenta capacidad para fosforilas otras proteínas; el Fitocromo es una proteína Kinasa (fig.28, 29). Las Respuesta al mecanismo de acción lenta dependen de la entrada del fitocromo activo al núcleo y su inducción o represión de la expresión génica (fig. 30, 31, 32).

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Existen multitud de procesos que son controlados por el valor de Fotoequilbrio, además de la germinación o la reacción de escape, como respuestas a estrés o síntesis de Etileno.

3.- Reacciones de Baja Irradianza o de Inducción (LIR): Se trata de la respuesta clásica del Fitocromo. Se produce ante pulsos cortos (unos 5 minutos) de baja intensidad (flashes de luz). Normalemente el fitocromo implicado en estas respuestas presenta Fotorreversibilidad y Reversibilidad. Al intercalarse periodos de oscuridad entre los flashes, el Fitocromo pierde su capacidad de fotorrevertir; cuanto más largo es el periodo de oscuridad mayor es la pérdida.

Según la Ley de Reciprocidad, la respuesta sólo depende de la Irradianza total; se observa igual magnitud de la respuesta siempre que se mantenga constante la multiplicación intensidad x tiempo. En el caso de las LIR, la respuesta debe venir condicionada por el último flash de luz suministrado: si sucede así se confirma que la respuesta es del tipo LIR.

R RL R RL R RL

Φ ↑ Φ ↓ Φ ↑ Φ ↓ Φ ↑ Φ ↓ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’

La magnitud de la respuesta depende del Valor de Fotoequilibrio, en

función de: el espectro de acción de LIR (conversión máxima a 660 nm, reversión máxima a 730 nm), la incidencia de los rayos en la superficie (en función de la latitud, el momento del día y la estación), los tipos de bosque o cultivo y la luz que dejan pasar al suelo, y en el caso de las semillas, la cantidad de luz capaz de atravesar el sustrato hasta determinada profundidad.

0102030405060708090

Φ

Tratamiento

5 minutos