2.3 Uji Aktivitas Enzim Penisilin Asilase Penisilin semisintetik dapat dihasilkan dari bahan dasar asam 6- aminopenisilanat (6-APA). 6-APA merupakan hasil hidrolisis dari penisilin alami oleh aktivitas enzim penisilin G asilase (Kafshnochi et al., 2010). Transformasi benzil penisilin secara enzimatis menggunakan enzim panisilin asilase dapat digambarkan sebagai berikut :

Gambar 1. Transformasi benzil penisilin secara enzimatis menggunakan enzim panisilin asilase (Kafshnochi et al., 2010).

Produksi enzim penisilin G asilase pada E.coli sangat berkaitan dengan habitat dan faktor lingkungan. Habitat yang berbeda akan menyebabkan perbedaan E. coli secara genetic drift. Fenotip suatu organisme dihasilkan dari genotip dan pengaruh lingkungan organisme tersebut. Variasi fenotip suatu organisme disebabkan oleh perbedaan struktur gen atau urutan DNA (Kafshnochi et al., 2010).Untuk uji aktivitas enzim penisilin asilase yang dipengaruhi oleh habitat dan faktor lingkungan dari E. coli menggunakan metode meevootisom. Metode Meevootisom merupakan metode seleksi yang mudah, cepat, dan spesifik untuk menseleksi strain bakteri yang dapat menghasilkan enzim PGA baik secara intraseluler atau secara ekstraseluler. Metode Meevootisom menggunakan bakteri Serratia marcescens yang berwarna merah dan resisten terhadap penisilin dan sensitive terhadap 6-APA. Adanya 6-APA di medium sebagai hasil hidrolisis penisilin G oleh bakteri yang mempunyai aktivitas PGA didalam medium akan menghambat pertumbuhan S. marcescens. Terhambatnya aktivitas S.marcescens akan menghasilkan zona bening di sekitar bakteri yang mempunyai aktivitas PGA (Meevootisom & Saunders, 1987).Penisilin G asilase adalah enzim yang terdapat di ruang periplasmik yang terdiri dari subunit dan subunit . Kedua subunit dihasilkan oleh suatu prekursor tunggal yang dibawa ke ruang periplasmik kemudian akan mengalami proses pemotongan proteolitik untuk menjadi enzim yang aktif. Peptida sinyal berperan dalam proses transfer prekursor enzim ke ruang periplasmik, subunit berperan untuk menentukan spesifitas substrat, endopeptida berperan dalam proses pelipatan prekursor enzim menjadi enzim penisilin asilase yang dewasa, dan subunit berperan dalam menentukan aktivitas katalik enzim (Lindsay dan Pain,1991).Penisilin G asilase dikode oleh gen PGA yang terdapat di dalam genom E. coli dengan panjang 2,4 kb. Perbedaan habitat akan menyebabkan perbedaan struktur gen PGA sehingga menyebabkan perbedaan dalam kualitas dan kuantitas PGA yang dihasilkan. Perubahan struktur gen PGA akan menyebabkan penukaran kerangka baca (roading frame) dari gen PGA. Perubahan roading frame akan menyebabkan perubahan pada sintesa protein atau PGA (Kafshnochi et al., 2010).Aktivitas Enzim Penisilin Asilase juga dipengaruhi oleh pH. Pada masing-masing pH didapatkan aktivitas penisilin G asilase yang berbeda-beda. Pada penelitian yang dilakukan Dini,dkk (2005) diperoleh hasil pada pH yang bervariasi yaitu rentangan 6,5; 7;7,5; 8. Aktivitas enzim tertinggi diperoleh pada pH 7,5 dan ketika pada pH 8 mengalami penurunan. Penurunan aktivitas enzim ini disebabkan oleh salah satu faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim yaitu terjadinya denaturasi enzim karena konformasi enzim tidak berikatan dengan konformasi substrat yang disebabkan oleh pH yang terlalu tinggi. Hubungan aktivitas enzim dengan pH (konsentrasi ion hidrogen) mencerminkan keseimbangan antara denaturasi enzim pada pH yang terlalu tinggi atau rendah dan efek pada keadaan muatan dari enzim, substrat atau keduanya (Murray, 2009). Uji aktivitas penisilin G asilase dari E. Coli B130 hasil PCR mutagenik pernah dilakukan oleh Megahati (2001), hasil Penelitiannya menunjukan bahwa pada klon mutagenik menghasilkan enzim dengan aktivitas tertinggi pada pH 7,5. pH lingkungan enzim yang bersifat basa akan menyebabkan peningkatan konsentrasi OH- dilingkungan enzim. OH- akan membentuk ikatan dengan ion H+ yang terdapat pada gugus karboksil dari asam amino tersebut aktif pada kisaran pH yang relative, asam amino bermuatan negatif ini akan menyebabkan perubahan struktur tersier enzim yang selanjutnya menyebabkan perubahan pada struktur enzim dalam mengkatalisis substratnya. Setiap enzim mempunyai karakteristik pH optimum dan enzim tersebut aktif pada kisaran pH yang relatif (Soeka, 2009). pH optimum pertumbuhan bagi kebanyakan bakteri terletak antara 6,5 dan 7,5. Namun beberapa spesies dapat tumbuh dalam keadaan asam atau alkali (Pelczar dan Chan, 1988).

2.4Isolasi dan Pemurnian Enzim Penisilin Asilase Pada tahap isolasi enzim dilakukan sentrifugasi sel E. coli yang masih tercampur dengan mediumnya. Pengujian terhadap sisa medium fermentasi menunjukkan tidak adanya aktivitas enzim penisilin asilase. Hal ini membuktikan bahwa enzim penisilin asilase dari E. coli B104 bersifat intraseluler sehingga untuk memperoleh enzim harus dilakukan pemecahan sel menggunakan ultrasonikator (Firman, 2005). Ekstrak kasar enzim dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya dengan sentrifugasi. Ekstrak enzim yang diperoleh masih merupakan campuran dari berbagai macam enzim sehingga untuk mendapatkan enzim yang lebih murni dilakukan pemurnian dengan fraksinasi menggunakan amonium sulfat. Pemisahan menggunakan amonium sulfat didasarkan pada efek salting out, yaitu amonium sulfat akan menurunkan kelarutan protein sehingga ia akan mengendap. Kadar protein mengalami penurunan, karena protein pengotor telah terpisah, dan diharapkan protease yang diperoleh lebih baik. Untuk menghilangkan sisa-sisa garam amonium sulfat dan molekul-molekul kecil lainnya, maka endapan yang diperoleh didialisis menggunakan tabung selovan (Elvi,2003).

Daftar Pustaka

Lindsay,C.D., dan Pain,R.H. 1991. refolding and assembly of penicillin acylase, an enzyme composed of two polypeptide chains that result from proteolitic activation. J. Biochem 30.Kafshnochi.M, Farajnia.S, Aboshof.R, Babaei.H and Aminolroayaee.M. 2010. Cloning and over-expression of Penicillin G acylase in Escherichia coli BL21. African Journal of Biotechnology Vol. 9(18).Mevootisoom. V, Somsuk. P, Prachaktam.R, Flegel.T 1983. Simpel screening methods for isolation of penicillin acylase producing bacteria : Appl environ microbial 46.Sebayang, Firman. 2005. Amobilasi Enzim Penisilin Asilase dari E. coli B1O4 dengan Poliakrilamida. Jurnal Komonikasi Penelitian Volume 17. Medan : Departemen Kimia FMIPA USU.Susanti, Elvi. 2003. Isolasi dan Karakterisasi Protease dari Bacillus subtilis 1012M15. Biodiversitas volume 4. Surakarta : Jurusan Kimia Jurusan PMIPA FKIP Universitas Sebelas Maret Surakarta.Yusta PN,Dini.,Mades Fifendy, RRP Megahati Siregar. 2005. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Penisilin G Asilase Oleh Isolat Bakteri Dari Air Batang Aru Lubuk Begalung Kota Padang. Padang : Jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri Padang.Murray, R. K. 2009. Biokimia Harper. Jakarta : Buku Kedokteran EGC.Megahati, RRP. 2001. Deteksi Mutasi Gen PGA Dari E. coli B130 Hasil PCR Mutagenik Dengan Mengunakan Metode Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP). Bandung : Prodi Biologi Pasca Sarjana ITB.Soeka, S. Y. 2009. Kondisi Optimum Produksi Kitinase dari Aktinomisetes dengan Karakterisasi pH dan Suhu Enzim. Cibinong: Bidang Mikrobiologi.Pelczar, J Michael dan Chan. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Universitas Indonesia.