I vaccini: metodiche di preparazione

I vaccini

Citochine attive sui B

Attivazione edifferenziazione

Alcuni diventano linfocitI B memoria

Anticorpi

Cellula secernenteanticorpi

Legame con il B

INNESCO DELLA RISPOSTA ANTICORPALE

Antigene rilasciato

Risposta immunitaria specifica indotta(ANTICORPO MEDIATA)

T citotossici

attivati

Citochinefavorenti

l’attivazione

Cellularicevente

Gene eterologo

Plasmide con

vaccino a DNA

Attivazione di T

citotossici

Proliferazionee attacco

Segnali di “killing”

Risposta immunitaria specifica indotta(CELLULO-MEDIATA)

Tipi di vaccini

• Batterici• Viventi attenuati: BCG,

antitifo orale• Uccisi: antipertosse,

colera• Anatossine: antidifterico,

antitetanico• Antigeni di superficie:

antipneumo e meningococco

• Virali• Viventi attenuati: antipolio

orale, antirosolia, antimorbillo, antiparotite, antiamarillico

• Uccisi, completi: antinfluenzale, antipolio iniettabile, antirabbico

• Antigeni di superficie: anti HBV

Costituzione dei vaccini

• Vivi attenuati (virus o batteri). Virali: vaccino orale di Sabin, MPR; batterici: BCG, Ty 21a

• Uccisi (virus o batteri) con mezzi fisici o chimici rispettando l’integrità antigenica. Esempi: antirabbico, antipolio di Salk antinfluenzale, antipertosse

• Frazioni di microrganismi: costituiti da virus frammentati (SPLIT), così allestiti per ovviare a reazioni indesiderate

• Anatossine: esotossine trattate ma che mantengono potere antigenico: bacillo difterico e tetanico

• Anti-idiotipo: i vaccini anti-idiotipo proteici utilizzano come antigene tumore-specifico l’immunoglubulina prodotta dalle cellule neoplastiche, la quale viene iniettata nel paziente al fine di immunizzarlo contro il suo stesso tumore.

Manipolazioni genetiche

•Antigeni purificati: i vaccini antinfluenzali a subunità come EMOAGGLUTININA E NEURAMINIDASI.

Nei vaccini i virus possono essere attenuati

Nei vaccini i virus possono essere attenuati

Linea cellulare di packaging

Usi del DNA ricombinante:

PROTEINE DI INTERESSE TERAPEUTICO ESPRESSE IN SISTEMI RICOSTITUITI:

Vantaggi

- SISTEMI DI ESPRESSIONE MOLTO SEMPLICI DA MANIPOLARE- PRODUZIONE DI PROTEINE IN GRANDI QUANTITA’ E A BASSO COSTO- RISCHIO CONTAMINAZIONE VIRALE NULLO-RISCHIO ALLERGIE RIDOTTO RISPETTO ALLA PURIFICAZIONE DI PROTEINE ETEROLOGHE

Problemi

-E’ DIFFICILE OTTENERE PROTEINE DA USARE COME ANTIGENE CHE MANTENGANO LA CONFORMAZIONE NATIVA DELLE PROTEINE UMANE (i sistemi di folding dei batteri sono molto meno sofisticati che negli eucarioti)

- I BATTERI MANCANO DI ADEGUATI SISTEMI DI MODIFICAZIONE POST-TRADUZIONALE (glicosilazione, tagli proteolitici, fosforilazione, aggiunta di lipidi). IMPORTANTI CONSEGUENZE SULLA ATTIVITA’ BIOLOGICA E SULLA ANTIGENICITA’

Altri bioreattori per ottenere proteine da usare come antigene: cellule di insetto

…piante

Eat the bioreactor Extract from the plant

Che cosa è necessario Che cosa è necessario

Protocolli sperimentali disponibili per produrre un vaccino

Far crescere i virus in uova embrionate

Far crescere i virus in colture cellulari

cellula

Purificazione di proteine

intracellulari o secrete

Espressione transiente in

sistemi specifici

Vettore+

espressione transiente della sola proteina antigenica

cellula

Infezione

infezione Frammentazione, inattivazione, purificazione

Virus

Frammentazione, inattivazione, purificazione

• Crescere i virus in uova embrionate– Inattivarli chimicamente– Frammentarli mediante detergente– Purificare i vari componenti (HA)

• Crescere i virus in colture cellulari– Inattivarli e processarli come sopra

• Crescere virus attenuati o la sola proteina antigenica in uova– Purificarli e produrli per la somministrazione

Protocolli sperimentali disponibili per produrre un vaccino

1x ~ 1x

Tempo di produzione 6 mesiSono necessari circa 6 mesi per avere le uova

Il processo basato su uova embrionate, sebbene molto usato presenta delle

limitazioni

• Sono necessari circa 6 mesi dal’ordine alla consegna delle uova• ~ 1 uovo è richiesto per una dose di vaccino• Una grave limitazione è che le uova possono non essere disponibili (influenza

aviaria)

No polli No uova No vaccino

Colture cellulari: un’alternativa alla produzione in uova

Non ci sono problemi di non disponibilità

Adatte per una produzione industriale come quella dei vaccini

• I virus dell’influenza sono Ortomixovirus - Types A and B – con un envelope che contiene proteine di superficie quali emoagglutinina (HA), Neuraminadasi (NA) and M2 (NB) -– HA e NA sono antigeni e vanno incontro a mutazione

e riassortimento – – L’efficacia dei vaccini è valutata principalmente

dall’abilità di stimolare anticorpi contro HA

• Vaccini disponibili - – Con virus vivi attenuati (piccola percentuale)– Con virus inattivati e alcuni formulati con adiuvante.

Illustrazione schematica delle maggiori attività durante

una tipica campagna vaccinica contro l’influenza

Maggiori attività

Sorveglianza

Selezione del ceppo

Preparazione dell’antigene

Potenziamento preparazione antigenica

Produzione del vaccino

Uscita del vaccino

Distribuzione del vaccino

Somministrazione del vaccino

Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Nov Dec*

Jul Aug Sep Oct Nov Dec Jan Feb Mar Apr May Jun**

Vaccini contro l’influenza a base di HA

• Vaccini costituiti dalla proteina HA– proteina prodotta in cellule di insetto– proteina prodotta in cellule di mammifero– proteina prodotta in cellule vegetali– Proteina prodotta in lieviti– Sequenze della proteina (peptidi) sintetizzate

chimicamente

• Vaccini costituiti da: – DNA nudo codificante HA– Inserimento del gene HA in un vettore virale– Batteri intestinali esprimenti HA