07 caceres diagnostico tb pcr genotipificacion mycobacterium tuberculosis
TRANSCRIPT
-
Blgo. M.Sc Omar Cceres R.
Laboratorio de Biotecnologa y Biologa Molecular
Instituto Nacional de Salud
DIAGNOSTICO DE TUBERCULOSIS
POR PCR Y GENOTIPIFICACION DE
Mycobacterium tuberculosis
-
Heminested-PCR para deteccion de M. tuberculosis
UTIL EN:
1. Muestras extrapulmonares
liquidas: LCR, aspirado
bronquial, lavado
bronquioalveolar, aspirado
gstrico entre otros)
2. Muestras extrapulmonares
solidas: Biopsias de piel,
pleura, hgado entre otros
3. Cultivo con colonias
atpicas y escasas
-
Heminested-PCR para deteccion de M. tuberculosis
M 1 2 3 4 5 6 7 8
M.Marcador 100pb1. Paciente 1 Aspirado gstrico2. Control inhibicin paciente 13. Paciente 2 LCR4. Control inhibicin paciente 25. Paciente 3 Liquido ascitico6. Control inhibicin paciente 37. Control Negativo8. Control Positivo H37rv
-
Heminested-PCR para deteccion de M. tuberculosis
M 1 2 3 4 5 6
M. Marcador 100pb1. M. avium2. M. fortuitum3. M. chelonae4. Humano5. Paciente6. Control Positivo H37rv
-
Genotipificacion de M. tuberculosis
-
La discriminacin de cepas patognicas es crucial; desde el punto de vista epidemiolgico, la tipificacin molecular contribuye al conocimiento de la virulencia, transmisibilidad, la efectividad de drogas, etc. (control de las enfermedades)
Identificacin de relaciones no sospechosas entre casos, nuevos casos y casos inusuales de transmisin de la enfermedad
Evaluacin de la transmisin de genotipos entre pacientes con o sin nexo epidemiolgico
Identificacin de reactivacin de TB en pacientes con historia previa de la enfermedad
Estudio de contactos de pacientes y su asociacin con cadenas de transmisin
PORQUE GENOTIPIFICAR MTB?
-
Genotipos conocidos de M. tuberculosis
-
HERRAMIENTAS UTILIZADAS EN LA EPIDEMIOLOGA
MOLECULAR
PCR y Variantes RFLP PCR Fingerprinting (RAPD, ERIC,
DRE, AFLP, etc.) PFGE Ribotipificacin Spoligotyping (solo MTB)MIRU-VNTR (solo MTB) Secuenciamiento de ADN
-
Genoma de Mycobacterium tuberculosis
RFLP IS6110
Spoligotyping
MIRU
SNPs
Genotipificacin:
-
Tcnica de genotipificacin para MTb descrita por primera vez en 1993
Basada en las variaciones generadas por el elemento de insercin IS6110 (Transposicin)
La variacin de las cepas esta basada en el numero de copias del IS6110 y en la posicin donde se inserta en el ADN bacterial
)
-
Brote Epidmico Muestras al Azar de pacientes de una regin
Casos sin nexo epidemiolgico
-
Tcnica de Genotipificacin basada en PCR descrita por primera vez en 1997, identifica y tipifica a MTB en un solo paso
Explota la variacin que existe en el locus DR de MTB (exclusiva de esta bacteria)
El locus DR (Direct Repeat) es una regin cromosmica que consiste de regiones repetidas de 36 nucletidos muy conservados
Cada DR esta separado por secuencias espaciadoras no repetitivas de 34 a 41pb
Las cepas varan en el numero de DRs y en la presencia o ausencia de los espaciadores particulares
La tcnica utiliza 43 diferentes espaciadores para identificar los diferentes genotipos de MTB
-
Spoligotyping de 35 MTb (aislamientos clnicos) y 5 M. bovis.
Presencia de seal indica la presencia del espaciador
Filas 6, 12 y 37 corresponden a genotipo Beijing
-
MIRU-VNTR fingerprinting
VNTR (Variable Number Tandem Repeat): Son secuencias
repetitivas en Tndem similares a minisatlites de eucariotas
que han sido identificados dispersos en las regiones
intergenicas del genoma del complejo de Mycobacterium
tuberculosis.
Estos segmentos repetitivos o minisatelites contienen de 46-
100 bp (pares de bases) y difieren entre las cepas en su
nmero de copias.
Se ha demostrado que la tipificacin por VNTR es muy til
para patgenos cuya poblacin es altamente clonal como MTb
MIRU (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units): VNTR
localizadas en el genoma de M. tuberculosis H37Rv, se han
encontrado 41 posiciones (41 locus) de los cuales 15 son
polimrficos en el nmero de repeticiones de una cepa a otra.
-
Amplificacin por PCR de MIRU en MTb
MIRU 10
DNA
MIRU 4
PCR amplification
Strain 1
3 repeats 2 repeats
MIRU 10
DNA
MIRU 4
PCR amplification
Strain 2
1 repeat2 repeats
-
Genotipos hallados hasta el momento (N=100)
Comparacin por distancia gentica: 0.17 significa
una tolerancia como mximo de 4 locus de diferencia
para MIRU-VNTR o 7 espaciadores en Spoligotyping.
Resultados con Da 0.17 (S=100%, E=79%)
Haarlem 16%
Beijing 6%
No determinado 78%
-
Comparacin por agrupamiento en un rbol filogentico:
Haarlem 28% Beijing 8% Dehli/CAS 2% N.D EAI 3% Uganda 2% N.D Canetti 1% LAM 29% LAM/Cameroon 6% Cameroon 2% N.D Cameroon 2% No match (clster nuevo) 17%
-
Genotipos de MTB-XDR
-
Genotipos de MTB-XDR
-
Genotipos de MTB-XDR
-
Genotipos de MTB-XDR
-
Frecuencia de genotipos de M.Tb en Latinoamerica (%)
Per
Da FilVenezuela2006 2009
Para-
guayBrazil
Paran RGS
Hondu-
ras
Sudfrica
TB-XDR
Haarlem 16 28 3 5 18.2 17.2 16 16.5 2
LAM 29 74 53 52.3 26.9 54 54.9 7
Beijing 6 8 0.4 0.5 0.5 76
T 13 10 11.8 22 16
S 9.5
No
identificado78 17 9 0
RDRio
38%5
N= 100 873 1298 220 93 50 206 41
-
Importancia del genotipo Haarlem
Lopez B. et al. Clin Exp Immunol 2003; 133:3037 Ensayos de infeccin de genotipos en ratones Beijing fue el mas virulento Mostro virulencia intermedia en ratones
Elis R Dalla Costa et al. BMC Microbiology 2009; 9:39 Cepas analizadas de Per, Brasil y Argentina n=224 LAM es el mas frecuente (46.4%), Haarlem es el segundo
(10%) en Sudamrica Resistencia a INH es mas frecuente en Haarlem que en LAM
(82.4% n=34) en Per Haarlem ha sido asociado a la emergencia de TB-MDR en
brotes ocurridos en Argentina, Republica Checa y Tnez