緒　　言

ウメ輪紋ウイルス（Plum pox virus、以下「PPV」）は海外においてサクラ属（Prunus spp.）の果樹に大きな被害を与えるとされている（García et al., 2014）。2009年、我が国においても東京都青梅市のウメ（Prunus mume Sieb. et Zucc.）から初確認された（Maejima et al., 2010）が、その後も国内の他の一部地域で発生が確認されており、根絶に向けて緊急防除を実施中である。　2016年 6月、神奈川県横浜市のウメで発見された PPVはそれまでの国内発生系統であった D系統（以後「PPV-D」）とは異なるM系統（以後「PPV-M」）であった (Oishi et al., 2017)。当該 PPVの緊急防除における感染樹の確認検定では、従来用いていた市販キットによる RT-LAMP法の反応が不調であったため、RT-PCR法（Wetzel et al., 1991）を用いたが、RT-LAMP

法と比較し多くの時間と労力を要することが課題であった。PPVの早期根絶に重要である感染樹の早期伐採のためには、より迅速で簡便に検定を行える、従来の RT-LAMP法に替わる

新たなプライマーセットを用いた RT-LAMP法の活用が望まれた。　当所では、2009年に開発された RT-LAMP法（以後「2009法」）があり（横浜植物防疫所、2009）、国内 D系統が検出可能なことが確認されており（藤原ら、2012）活用が期待されたものの、PPV-Mの検定への適用性が未検討であった。　本研究では、2009法のプライマーを用いて新たな国内PPV-M検出のための RT-LAMP法の開発を行ったので報告する。なお、研究概要の一部は平成 29年度日本植物病理学会関東部会で発表済みである。

材料及び方法

1．供試試料　PPV-M陽性試料として、M系統のみの発生が確認されている地域である神奈川県横浜市（Oishi et al., 2017）で採取され、プラムポックスウイルスイムノクロマトキット（ニッポンジーン、以後イムノクロマト法は同手法を示す）で陽性を確認した

───────────────────────────────────────────────────────────1)門司植物防疫所福岡支所

資 料

Development of RT-LAMP Method for Fast and Simple Detection of Plum pox virus strain M and D in Japan. Yoshimi

INOUE, Ryuichi KAGATSUME1), Ryuichiro KASUKABE, Tamami SHUKUYA, Shuichi USHIKU and Yoichi

MOTOKURA（Yokohama Plant Protection Station, 1-16-10, Shin-Yamashita, Naka-ku, Yokohama, 231-0801 Japan. 1）Fukuoka Sub-station, Moji Plant Protection Station） Res. Bull. Pl. Prot. Japan. 54:83-88 (2018).Abstract: Plum pox virus (PPV), one of the most important viral pathogens of stone fruit (Prunus spp.) trees, was found in

Ome, Tokyo in 2009．Immediately after this first detection report in Japan, an eradication program was launched focusing

on strain D (PPV-D) detected in Ome and other areas. Later in 2016, when another PPV strain, M (PPV-M), was first

detected in Prunus spp. trees in Yokohama, molecular detection was initially done by RT-LAMP (Reverse Transcription

Loop-mediated isothermal AMPlification) using a commercial kit. However, the method resulted in weak or no reaction and

did not properly detect the target strain. RT-PCR was used since then as an alternative to detect PPV-M, but it is very time

and labor consuming. In this study, a new RT-LAMP method was tested and improved based on the primer set developed

in 2009 by Yokohama Plant Protection Station. This new method is now in use for actual testing as a simple and rapid

approach.Key words: PPV, Plum pox virus, RT-LAMP, Strain M, Strain D

国内で発生したウメ輪紋ウイルスM及びD系統の迅速・簡便な検出法としてのRT-LAMP法の開発

横浜植物防疫所

植物防疫所調査研究報告（植防研報）第 54号：83～ 88 平成 30年（2018）

井上　佳美・蚊爪　竜一１）・粕壁　隆一郎・宿谷　珠美・牛久　修一・本蔵　洋一

植 物 防 疫 所 調 査 研 究 報 告84 第54号

PPV感染葉を用いた。PPV-D陽性試料として、D系統の発生地である東京都青梅市で採取し、イムノクロマト法で陽性を確認したウメ等宿主植物の PPV感染葉を用いた。陰性試料には当所で保有のウメ等宿主植物の PPV無感染葉を用いた。

2．2009 法による M 系統の検出可否の検討　2009法により PPV-M感染葉（ウメ× 2（以後×は供試数を示す）、モモ（P. persica (L.) Batsch）× 1）の核酸抽出液 3試料分を用いて各 2反復で RT-LAMPを行った。核酸抽出は PPV-M

感染葉各0.1gを用い、RNeasy Plant mini kit(QIAGEN)により行った。プライマー配列及びプライマーミックスの濃度は Table 1

に示した。Loopamp RNA増幅試薬キット（栄研化学）を用い、核酸抽出液 2μ lを添加し、トータルの反応液量は 20μlとして 63℃、60分で増幅反応を行った。測定にはリアルタイム濁度測定装置 LoopampEXIAもしくは LA-320C（共に栄研化学）を用い、濁度が 0.1を超えた時間（分）を増幅開始時間とした。以後の検討でも同様の判定とした。

3．粗抽出液使用のための検討イムノクロマトキット付属の抽出液を PPV宿主植物の葉柄

約 30mgと 6mmタングステンビーズと共に 2mlチューブに入れ、シェイクマスター（バイオメディカルサイエンス）を用いて 1,100rpm、2分間の粉砕処理により摩砕後、13,200×g、2 分間遠心し、上清を粗抽出液とした。a．Loop プライマーの設計　2009法のプライマー（Table 1　No.1-4）に追加して使用するための Loopプライマーの設計は、LAMP法プライマー設計支援ソフトウェア「Primer Explorer V5」(FUJITSU Ltd. : https://

primerexplorer.jp/）により、4種類のプライマーの設計時に用いた配列（D系統）を用いて行った。b. オプションとしての蛍光 LAMP の検討蛍光 LAMPは、PPV-M陽性試料の核酸抽出液各反応 1μl

を用い、2009法の LAMP反応組成内に EvaGreen 蛍光色素（20× in water）(Biotium,Inc.)を、2009法の組成内に加えるEvaGreenの濃度を 20×～ 1×、量を 1～ 0.5μlと変化させた組成で RT-LAMP反応を行うことにより行った。検出にはStepOnePlus(Thermo Fisher Scientific) を 用 い、Cycling Stage を63℃ 30秒× 120cycles、Melt Curve Stageを 80℃ 5分、60℃ 1分、60～ 95℃（+0.3℃ずつ段階的に測定）、95℃ 15秒とし、SYBR

Greenの蛍光強度の測定を行った。c．粗抽出液を用いた鋳型調製

　粗抽出液に 5号昆虫針（志賀昆虫）の先端を約 5mm浸し、粗抽出液が付着した針を 0.2mlチューブに 20μlずつ分注した0.1M Tris-HCl（pH8.0）溶液中に浸し混ぜ、針を取り出したのちボルテックスで混合した。これを鋳型溶液とした。d．感度調査及び LAMP 反応時間短縮の検討　段階希釈試料として、PPV-M陽性試料（ウメ又はユスラウメ（P. tomentosa Thunb.））の粗抽出液をそれぞれ健全ウメ、健全ユスラウメの粗抽出液で 1/10、1/100、1/1000に希釈し、それぞれを用いて 3.cの方法により調製した鋳型溶液を作製し、各試料 2反復で Table 2 Aの組成により 2009法による RT-

LAMP（濁度法）を、Table 2 Bの組成及び 3.bの手法により蛍光 LAMP（蛍光法）を行った。なお、蛍光 LAMPでは SYBR

Greenの蛍光強度の測定値（Δ Rn）が 20,000を超えた時点（Ct）を増幅開始時点とし、1サイクル 30秒で等温反応の測定を行っていることから、増幅開始時間は当該 Ctの 1/2として扱った（例：Ct30の場合増幅開始時間は 15分）。

4. 複数の宿主植物試料を用いた検定実用性の検討PPV-Mの検出については、PPV-M陽性試料の葉の粗抽出液

29試料（ウメ× 24、ユスラウメ× 3、ニワウメ（P. japonica

Thunb.）× 2）及び陰性 20試料（ウメ× 9、ユスラウメ× 2、モモ× 3、スモモ（P. salicina）× 3、オウトウ（P. avium (L.)

L.）× 2、アンズ（P. armeniaca L.）× 1）から 3.の方法により粗抽出液及び 3.cの方法により鋳型溶液を調製し、これを用いて Table 2 の A及び B の組成、並びに Fig. 2の A、B各検出により RT-LAMPを行った。PPV-Dの検出は、PPV-D陽性試料の葉 9試料（ウメ× 5、ユスラウメ× 2、モモ× 2）について、PPV-Mの検出と同じ鋳型調製法及び前文の 3.dと同様の試料及び段階希釈法を用いた。

Table 1. Primers used for RT-LAMP in this paper.

No. Name Sequences(5'→3')Concentration in

Primer MixLength Position

1

1 PPV3-F3 GGAATTCAGCGCAACCTGA 1.25 μM 19 9318-93362 PPV3-B3 GCGGTGTGTCTCTCTGTG 1.25 μM 18 9500-95173 PPV3-FIP GAGCTTCACGTGCCCGTACGCAGACTACAGCCTCGCCAGA 10 μM 40 9395-9414, 9337-93564 PPV3-BIP TCCAGATGAAGGCAGCAGCATCCTCTTCTTGTGTTCCGACG 10 μM 41 9418-9438, 9479-94985 PPV3-LF1 GGTGTCGTTGAAGTCATTTCGTAAA 5 μM 25 9370-93946 PPV3-LB TCGTTTATTTGGCTTGGATGGA 5 μM 22 9455-9476

Primers No.1-4 were used for 2009 method.Primers No.5 and 6 were added as loop primers for 2017 method.1)

Primers design position on GenBank Accession No.LC228949 (9,786bp)

Table 1. Primers used for RT-LAMP in this paper.

Table 2. Composition of RT-LAMP reaction solution.

(A)Turbiditydetection

(B)Fluorescentdetection

2xReaction Mix 10 μl 10 μlPrimer Mix 3.2 μl 3.2 μlDistilled Water 4.4 μl 3.9 μlEnzyme Mix 0.8 μl 0.8 μl5x EvaGreen - 0.5 μlSample 1.6 μl 1.6 μlTotal 20 μl 20 μl

Volume

Reagent

Table 2. Composition of RT-LAMP reaction solution.

井上ら：国内M、D系統 PPVの迅速・簡便な検出法 (RT-LAMP法 )の開発 852018年12月

結果及び考察

1．2009 法による M 系統の検出可否の検討　2009法により検出確認を行ったところ、用いた PPV-M陽性3試料すべて 2反復において 20分以内に増幅が開始され、2009

法が国内M系統の検出に有効であることが分かった（Fig. 1）。

2．粗抽出液使用のための検討　多検体の試料を短時間で検定するため、粗抽出液の原液を 5

号昆虫針（志賀昆虫）で採取し、鋳型として LAMP反応液に混ぜこむ手法を用い、2009法による RT-LAMPを行ったところ、非特異的反応が生じたため、当該粗抽出液を用いても非特異的反応が生じないような 2009法の改良プロトコルについて検討を行った。a．Loop プライマーの設計　非特異的反応は反応時間の後半に生じていたことから、Loopプライマーの設計が非特異的反応の抑制に有効であると考え、PPV3-LF1及び PPV3-LBを新たに設計（Table 1 No.5, 6）し、2009法の 4種類の LAMPプライマーに追加して高速化の事前確認を行ったところ、増幅開始が約 10分早くなり、反応が高速化する傾向がみられた。b．オプションとしての蛍光 LAMP の検討　PPVの調査で採取されるサンプルはウメ、モモ、サクランボ等様々な宿主植物があり、サンプルの採取時期も春から秋に渡るため、多様な種類、採取時期のサンプルでも非特異的反応を生じないことが重要である。また、濁度により増幅を検出する手法においては、特異的反応と非特異的反応の区別は、リアルタイム濁度測定装置を用いても難しい場合もある。その対策として、融解曲線解析での Tm値の比較により非特異的反応を区別することが可能な、インターカレーターを用いた蛍光LAMPについても検討した。2009法の反応組成内にインターカレーターとして EvaGreen蛍光色素 (Biotium,Inc.)を添加し、当該試薬の濃度と量を変えて蛍光強度の増加による検出が可能

Fig. 1. Detection results of PPV-M by 2009 Method.

M-1: PPV-infected P. persicaM-2 and M-3: PPV-infected P.mume

Fig. 1. Detection results of PPV-M by 2009 Method.

M-1: PPV-infected P. persicaM-2 and M-3: PPV-infected P.mume

か検討を行ったところ、反応系に 5×の EvaGreenを 0.5μl添加し、リアルタイム PCR装置で等温反応の SYBR Greenの蛍光強度の測定を行い、蛍光強度の指数関数的な増加を見ることでインターカレーターによる LAMP反応の増幅確認が可能であることを確認した。融解曲線解析での、PPV-Mの陽性試料の特異的 LAMP増幅産物の Tm値は 81.69℃となり、LAMP増幅産物の Tm値が当温度付近からはずれた場合は非特異的増幅であると判断した。c．粗抽出液を用いた鋳型調製　粗抽出液により非特異的反応が生じるのは、粗抽出液中に多く存在する夾雑物の影響が考えられたことから、LAMP反応液への鋳型の添加方法を検討した。夾雑物の濃度を低減する目的で、福田ら（2005）によるウイルス感染葉片を突いた爪楊枝を0.1M Tris-HCl（pH8.0）に懸濁させた溶液を LAMP法の鋳型とする方法を応用した。葉片ではなく粗抽出液を用い、爪楊枝利用では吸着により均一量を採取できないことを考慮し、代わりに 5号昆虫針を用いた鋳型調製法を採用した。ｄ．感度調査及び LAMP 反応時間短縮の検討　濁度法、蛍光法により RT-LAMPを行い、試料の検出可否と増幅開始時間を確認した。その結果、濁度法、蛍光法ともに1/100希釈まで各試料の 2反復で検出され（Table 3）、また、非常に低濃度である 1/1000希釈の試料の増幅開始時間も濁度法、蛍光法ともに 30分以内であり、30分以降に増幅開始されることはなかった。　Loopプライマーの追加で反応が高速化したことにより、陽性の増幅開始時間が早まったと考えられることから、2009法で 60分であった LAMP反応時間を 30分に短縮でき、より迅速な結果判定が可能となった。

(A) Results of Turbidity method.(B) Results of Fluorescent method.

A Dilution rate 1

PPV-M infectedP. mume sample

(Amplification starttime (min))

PPV-M infectedP. tomentosa sample(Amplification start

time (min))

1++

(15,15)++

(13,14)

1/10++

(16,16)++

(15,15)

1/100++

(21,21)++

(18,20)

1/1000+-

(27)++

(24,28)

B Dilution rate 1

PPV-M infectedP. mume sample

(Amplification starttime (min))

PPV-M infectedP. tomentosa sample(Amplification start

time (min))

1++

(10,10)++

(9,9)

1/10++

(10,13)++

(10,10)

1/100++

(14,16)++

(12,13)

1/1000+-

(15)+-(17)

1)Each of the samples were diluted with healthy Prunus spp. crude extract.

Table 3. Detection results and amplification start time of serial dilutedPPV-M infected Prunus spp. samples.

Table 3. Detection results and amplification start time of serial diluted PPV-M infected Prunus spp. samples.

(A) Results of Turbidity method.(B) Results of Fluorescent method.

植 物 防 疫 所 調 査 研 究 報 告86 第54号

3．複数の宿主植物試料を用いた検定実用性の検討　上記 2.a～ d.を反映させ 2009法を改良し「2017法」とした。濁度により検出を行う手法を「濁度法」、蛍光により検出を行う手法を「蛍光法」と呼称し、濁度法を通常の検定手法として用い、非特異的反応が懸念される試料の場合は蛍光法を用いた再検定を行うことで、非特異的反応にも対応できる手法を開発した（Fig. 2）。　2種類の手法について多様な試料の検定を行った場合に不具合がないか、複数の PPV-M陽性宿主植物試料及び陰性試料を用いてRT-LAMPを行い、検定実用性の検討を行った。その結果、陽性試料では、濁度法、蛍光法ともにそれぞれの増幅曲線を見ると、29試料とも、反応時間内に指数関数的な立ち上がりを示す増幅曲線となっており、濁度法、蛍光法ともにすべて適切に検出された（Table 4, Fig. 3）。

Making crude extract1. Put petiole and symptoms of Prunus spp. leaves about 30mg into a 2.0ml tube.

3. Centrifuge the tube 13,200xg 2minutes (Use supernatant).

Making template solution1. Dispense 20μl of 0.1 M Tris-HCl (pH8.0) into 0.2ml tubes.2. Take crude extract using the tip of a insect pin (size 5).3. Dip and mix the pin in 20μl of 0.1 M Tris-HCl (pH8.0).4. Vortex and spin down the tube.

RT-LAMP reaction 2

(A) Turbidity detection assay or (B) Fluorescent detection assay

1) Extraction Buffer : The buffer of commercial PPV immunochromato kit (Nippon Gene).

Fig. 2. Procedures of 2017 Turbidity and Fluorescent method.

Perform RT-LAMP withcomposition in Table 2-A usingReal-time turbidiameter (63℃, 30minutes).

Perform RT-LAMP withcomposition in Table 2-B usingReal-time thermal cycler(63℃, 30minutes(Isothermalreaction: 30seconds x60cycles)→Melting curveanalysis).

2. Grind them by a beads crusher with a tungsten bead and 300μl of

Extraction Buffer 1 (1,100 rpm, 2 minutes).

2) Fluorescent dection assay is used optionally when the unspecific reaction

became problem.

Fig. 2. Procedures of 2017 Turbidity and Fluorescent method.

　陰性試料でも、20試料すべてで増幅はなく、濁度法、蛍光法ともにすべて陰性を示す適切な結果となった（Table 5）。　また、既存系統である PPV-Dの検出可否を確認したところ、濁度法、蛍光法ともにすべて適切な結果となった（Table 6,

Fig. 4）。段階希釈試料では濁度法で 1/100希釈まで、蛍光法で1/10希釈まで各試料において検出された（Table 7）。PPV-D及び PPV-Mの陽性 38試料の蛍光 LAMPの増幅産物の Tm値は各系統で大きな差はなく81.84～82.28℃であった。これにより、当該手法は国内 PPV-Dの検定にも利用可能であることが示された。

Fig. 3. Detection results of PPV-M infected Prunus spp. samples by 2017method.(A) Results of Turbidity method.(B) Results of Fluorescent method.Orange curves in B: 29 samples; Red curve in B: PC; Light blue curve: NC

Fluo

resc

ence

inte

nsity

(ΔRn

)Cycle

A

B

Fig. 3. Detection results of PPV-M infected Prunus spp. samples by 2017 method.

(A) Results of Turbidity method.(B) Results of Fluorescent method.Orange curves in B: 29 samples; Red curve in B: PC; Light blue curve: NC

Table 4. Detection results of 29 PPV-M infected Prunus spp. samples.

Sample name(PPV-M infected)

Results ofTurbiditymethod

Results ofFluorescent

method

yk1 P. mume + +yk2 P. tomentosa + +yk3 P. mume + +yk4 P. mume + +yk5 P. mume + +yk6 P. mume + +yk7 P. mume + +yk8 P. japonica + +yk9 P. mume + +yk10 P. tomentosa + +yk11 P. tomentosa + +yk12 P. japonica + +yk13 P. mume + +yk14 P. mume + +yk15 P. mume + +yk16 P. mume + +yk17 P. mume + +yk18 P. mume + +yk19 P. mume + +yk20 P. mume + +yk21 P. mume + +yk22 P. mume + +yk23 P. mume + +yk24 P. mume + +yk25 P. mume + +yk26 P. mume + +yk27 P. mume + +yk28 P. mume + +yk29 P. mume + +

Plant species

Table 4. Detection results of 29 PPV-M infected Prunus spp. samples.

Table 5. Detection results of 20 healthy Prunus spp. samples.

Sample name(Healthy)

Results ofTurbiditymethod

Results ofFluorescent

method

ume1 P. mume - -ume2 P. mume - -ume3 P. mume - -ume4 P. mume - -ume5 P. mume - -ume6 P. mume - -ume7 P. mume - -ume8 P. mume - -ume9 P. mume - -

yusura1 P. tomentosa - -yusura2 P. tomentosa - -momo1 P. persica - -momo2 P. persica - -momo3 P. persica - -

sumomo1 P. salicina - -sumomo2 P. salicina - -sumomo3 P. salicina - -outou1 P. avium - -outou2 P. avium - -anzu1 P. armeniaca - -

Plant species

Table 5. Detection results of 20 healthy Prunus spp. samples

Fig. 3. Detection results of PPV-M infected Prunus spp. samples by 2017method.(A) Results of Turbidity method.(B) Results of Fluorescent method.Orange curves in B: 29 samples; Red curve in B: PC; Light blue curve: NC

Fluo

resc

ence

inte

nsity

(ΔRn

)

Cycle

A

B

井上ら：国内M、D系統 PPVの迅速・簡便な検出法 (RT-LAMP法 )の開発 872018年12月

　2017年度及び 2018年度の緊急防除等の発生調査においては、主に濁度法により多検体の確定検定をすでに行ってきたが、非特異的反応の問題は生じておらず、サンプル到着から結果確定までに要した時間は、従来の RT-PCR法では半日～ 2日であったのが、新手法では 1時間へと大幅に短縮された。当該手法は今後も迅速・簡便かつ高感度な PPV検定手法としての、PPV

に関わる諸調査やあるいはグループ検定等においても活用が期待される。

Fig. 4. Detection results of PPV-D infected Prunus spp. samples by 2017 method.(A) Results of Turbidity method.(B) Results of Fluorescent method.Orange curves in B: 29 samples; Red curve in B: PC; Light blue curve: NC

B

Fluo

resc

ence

inte

nsity

(ΔRn

)

Cycle

Fig. 4. Detection results of PPV-D infected Prunus spp. samples by 2017 method.

(A) Results of Turbidity method.(B) Results of Fluorescent method.Orange curves in B: 9 samples; Red curve in B: PC; Light blue curve: NC

(A) Results of Turbidity method.(B) Results of Fluorescent method.

A Dilution rate 1

PPV-D infectedP. mume sample

(Amplification starttime (min))

PPV-D infectedP. persica sample(Amplification start

time (min))

1++

(13,13)++

(12,12)

1/10++

(16,17)++

(14,14)

1/100++

(17,18)++

(17,18)

1/1000 -- --

B Dilution rate 1

PPV-D infectedP. mume sample

(Amplification starttime (min))

PPV-D infectedP. persica sample(Amplification start

time (min))

1++

(8,8)++

(8,8)

1/10++

(11,13)++

(9,10)

1/100 --++

(11,12)

1/1000 --+-(13)

1)Each of the samples were diluted with healthy Prunus spp. crude extract.

Table 7. Detection results and amplification start time of serialdiluted PPV-D infected Prunus spp. samples.

Table 7. Detection results and amplification start time of serial diluted PPV-D infected Prunus spp. samples.

(A) Results of Turbidity method.

(B) Results of Fluorescent method

1) Each of the samples were diluted with healthy Prunus spp. crude extract.

Table 6. Detection results of PPV-D infected 9 Prunus spp. samples.

Sample name(PPV-D infected)

Plant speciesResults ofTurbiditymethod

Results ofFluorescent

method

ou1 P. tomentosa + +ou2 P. mume + +ou3 P. persica + +ou4 P. mume + +ou5 P. mume + +ou6 P. persica + +ou7 P. mume + +ou8 P. mume + +ou9 P. tomentosa + +

Table 6. Detection results of 9 PPV-D infected Prunus spp. samples.

引用文献

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