06.04.2018

1

FilmArray BioThreat panelErfaringer fra BeredskapslaboratorietNITO BFI kurs 2018

Tone Bjordal Johansen, FHI

NIPH -

BSL3 agens

BSL4 agens - hanskebenk

06/04/2018

Beredskapslaboratoriet

Biosikkerhet

06.04.2018

2

NIPH - 06/04/2018

Nasjonalt Mikrobiologisk Beredskapslaboratorium

Beredskapsvakt 24/7

Nasjonalt beredskapslaboratorium for mikrober knyttet tilbioterror

•Pulverbrev

•Annen mistanke om bioterroragens

•Kliniske prøver med mistanke om høypatogene agens

Tilgjengelig for politi, helseforetak, medisinsk-mikrobiologiske laboratorier og andre offentlige instanser

Tilbyr RT-PCR og dyrkning av en rekke agens, ulike hurtigtester av toksiner og multiplex- analyser av høypatogene agens og toksiner

Nasjonalt referanselaboratorium for Brucella spp., Bacillusanthracis, Burkholderia mallei / pseudomallei

Avtale med Folkhälsomyndigheten i Sverige om ytterligereanalyse av BSL4 agens

NIPH -

•Naturlige utbrudd

•Ebola

•Pest

•Uhell / mislighold

•Laboratorieuhell

•Malpraksis

•Kriminell handling

•Bioterror –intensjonell handling

Biologiskhendelse:

Mistanke om eller bekrefteteksponering

for et biologiskagens som

kreverekstraordinær

handling og beredskap

06/04/2018

Bioterror vs biologisk hendelse

06.04.2018

3

NIPH - 06/04/2018

Bioingeniøren, mars 2018

NIPH -

Bacillus anthracis – anthrax / miltbrann

Yersinia pestis – pest

Coxiella burnetii – Q feber

Burkholderia mallei – snive

Burkholderia pseudomallei – pseudosnive

Brucella sp. – brucellose

Francisella tularensis- tularemi / harepest

Virale hemorragiske febere (Ebola / Marburg / CCHF)

MERS-CoV

Botulinumtoksin

Ricin

06/04/2018

Våre viktigste agens

06.04.2018

4

NIPH -

Varsling av prøve til vakthavende lege

(95214993)

Innsendelse(kategori A eller B

transport)

Mottak av prøve, prøveopparbeidelse i

BSL3 laboratorium

HurtigdiagnostikkFilmArray og RT PCR

Dyrking og verifiserende analyser

AST testing

Slektskapsanalyser / utbruddsetterforskning

06/04/2018

NIPH -

Agens Analyse Referansefunksjon

Bacillus anthracis Real-time PCR og dyrkning Ja

Brucella spp. Real-time PCR og dyrkning Ja

Burkholderia pseudomallei

/mallei

Real-time PCR og dyrkning Ja

Yersinia pestis Real-time PCR og dyrkning Ja*

Francisella tularensis ssp. Real-time PCR og dyrkning

Coxiella burnetii Real-time PCR

MERS CoV Real-time PCR Ja*

CCHFV Real-time PCR

Toksiner

Ricin/agglutinin Hurtigtest

Stafylokokk enterotoksin B

(SEB)

Hurtigtest

Botulinum neurotoksin type A

(BoNT-A)

Hurtigtest

Real-time PCR for BoNT-A,

B, C og E

Multiplex analyser

FilmArrayTM BioThreat panel 16 ulike target,

høypatogene agens og

toksiner

Annet

AST testing Mikrobuljongfortynning

WGS Ved behov

06.04.2018

5

NIPH -

Black box «all-in-one» multiplex PCR system

Kit for «syndromic diagnosis»

Respiratory panel

Blood culture identification panel

Gastrointestinal panel

Meningitis Encephalitis panel

BioThreat panel

Biomerioux

BioFireDefense

FilmArrayTM

NIPH -

• Bacillus anthracis, 3 Targets

• Brucella melitensis, 2 Targets

• Burkholderia mallei / pseudomallei, 2

Targets

• Clostridium botulinum

• Coxiella burnetii, 2 Targets

• Ebola virus (Zaire)

• EEE virus

• F. tularensis, 2 Targets

• Marburg virus, 2 Targets

• Ricinus communis

• Rickettsia prowazekii, 2 Targets

• Variola virus

• VEE virus, 2 Targets

• WEE virus

• Yersinia pestis, 2 Targets

• Orthopox virus, 2 Targets

06.04.2018

6

NIPH -

Prosedyre og prinsipp

NIPH -

Hver pouch har internkontroll (frysetørket Schizosaccharomyces pombe) – target er RNA transkript

Hver PCR analyseres i triplikat. Software evaluerer alle tre replikater ved positivt resultat, to av tre må

være positive for å rapportere som påvist. Tm må ikke avvike mer enn ± 1°C

Flere agens har to eller tre target

Kvalitetskontroll

06.04.2018

7

NIPH -

Fra BioFire Defence:

“The loading buffer contains high

concentrations of Guanadinium salt.

It is very effective at inactivating most

bacteria and virus for samples without

excessive biologic/organic load.

It is NOT effective against sporulated

bacillus. Understand that for pathogens

like Ebola, the viral titers in body fluids of

highly infected patients can be greater

than 10e10/ml. Even with a high log kill

for the buffer, it is hard to guarantee it

will be completely effective against such

numbers. ”

Biosikkerhet• P. aeruginosa

• 5, 10 og 15 min. i sample buffer

• Ingen vekst

• F. tularensis

• 10 min. i sample buffer

• Ingen vekst

In house testing av inaktivering

NIPH -

FilmArray maskinen inne på BSL3 laboratoriet

Prøve tilsettes i sikkerhetsbenk (BSCII)

Hvis mistanke om B. anthracis sporer i pulver eller virale agens i kategori BSL4 - hanskeboks

(BSCIII)

Prosedyre for uhell

Biosikkerhetstiltak

06.04.2018

8

NIPH -

Validering

Spikede prøver, ringtestprøver og pasientprøver

ble analysert

Generelt – svært gode resultater

Seiner DR et al. J Appl Microbiol 2013:

-LOD ≤ 250 genomiske ekvivalenter (GE) per prøve

for Bacillus anthracis, Francisella tularensis og

Yersinia pestis

-kryssreaksjon med nært beslektet DNA ikke påvist

Filmarray brukt som supplement til diagnostikken

siden 2016

NIPH -

Evaluere praktisk bruk og eventuelle

begrensinger med kitet

Ikke mål å bestemme analytisk sensitivitet og

spesifisitet

Raskt og enkelt supplement til diagnostikken ved

beredskapslaboratoriet for deteksjon av aktuelle

BSL3 agens, og at den kan brukes ved analyse av

de ulike prøvematerialer Beredskapslaboratoriet

analyserer

Metoden skal ha en sensitivitet som er i samsvar

med publiserte data og som er sammenlignbar

med resultater oppnådd med realtime PCR og

evt. dyrking.

Metoden skal være spesifikk, dvs at den i minst

mulig grad skal gi falske positive resultater

Begrensninger

Kostnad på kit begrenser antall analyser

Flere agens som kitet detekterer har vi ikke tilgjengelig for testing

Begrenset mengde prøvemateriale

06/04/2018

Krav

06.04.2018

9

NIPH -

Eksempel på kjøringerPrøve Målbakterie Matrix Realtime PCR FilmArray

resultat

Vurdering

FBD14 (05+07+12) Blank+ Y. p + B. mel serum 22,2 (Y.p) 25,2 (B. mel) Y. p og B. mel OK

NBDN15 (01+04+06) B. pinni + F. tul hol + Str. equi vann 27,0 (Bscp31), 27,4 (fopA) 28,3

(IsFtu2)

Brucella sp. + F. tul OK

NBDN15 (09) + inaktivert

kultur

B. abo +B. psm (10-10 fortynning) melk 21,8 (Bscp31)

B.psm i.u

Brucella sp.

B. m / B. psm not detected

Detekterte ikke lav fortynning

av B. psm

Inaktivert kultur x 4 B. mel+ B. cereus+ BoNTA+BoNTB blod i.u B. mel + C. botulinum OK

M2, pas. prøve B. mel (påvist ved dyrking) Blodkultur Ja, negativ på direkte realtime

PCR. Inhibisjon

B. mel OK

Ikke inhibisjon på FilmArray

Q3 (inaktivert 03+04) B. suis + Y. p blod 25,6(Bscp31) 21,7(ypo393)

17,5(pla) 21,2(Caf1)

Brucella sp. + Y. p OK

RKI E1 01 ringtest B. pinni bakterieopplsemming 32,9 (bscp31), 30,3

(BMeII0466)B. mel Skulle vært rapportert som

Brucella sp. Fikk også resultat

for B. mel på realtime PCR

E1 inakt 01+02+03 B. mel+ B.m + F tul tul Serum+ PBS 33 (Bscp31), 31(BMeII0466),

21 (B. m)

27 (tul4),

27 (fopA),

27 (F.tul tul)

B. mel

B. m / psm

F.tul

OK

Q2-08 B. canis HCA softagar Brucella sp OK

NIPH -

•B. melitensis detekteres med Filmarray

•B. abortus, B. pinnipedialis og B. suisrapporteres som Brucella spp

•FilmArray – positive når vanlig real-time PCR var negativ pga PCR inhibitorer(blodkultur)

•OBS: Et isolat (SLP) av B. pinnipedialisble rapporert som B. melitensis (ID konfirmert med Bruceladder)

Brucella spp.

•Detekterer C. burnetii

Coxiella burnetii

Erfaring

Smeltekurveanalyse - falsk positiv B. pinnipedialis SLP prøve

06.04.2018

10

NIPH -

•F. tularenis tularensis, F. tularensis holarctica og F. tularensis novicida - allerapporteres som F. tularensis

•F. philomiragia ble også rapportert som F. tularensis

•Positiv pasient prøve (BAL), som varanalysert mhp B. pseudomallei. Real-time PCR og dyrking; negativt for begge agens. Diagnose senere bekreftet m/ serologi

Francisella tularensis

•Positiv for pXO1 and pXO2 – rapporteressom B. anthracis detektert

•Hvis en eller begge plasmider mangler–rapporteres som Bacillus sp. detektert ogmed resultatet for hvert plasmid

•Bra resultater når ordinær real-time PCR viste hemming (SLP prøve)

•Beslektede Bacillus spp. – ikke rapportert

Bacillus anthracis

Melt curve analysis - false positive F. philomiragia

NIPH -

• Y. pestis - detekteres

• Y. pseudotuberculosis – ikke rapportert

• Falsk positive pasient prøve (direkte og i oppdyrket buljong). Også positive for pla ved real-time PCR, men ikke for caf1 eller ypo393.

• Ulike enterobakterier detektert ved dyrking (Citrobacter, Enterobacter, E. coli)

• Enterobacteriaceae positive for pla genet er tidlgere beskrevet(Armougom F et al Front Microbiol 2016, Hänsch S et al BMC Res Notes 2015)

Yersinia pestis

06.04.2018

11

NIPH -

•Detekterer begge arter, men skiller ikke mellom dem

Burkholderia mallei/pseudomallei:

•Detekterer C. botulinum type A.

•Vi testet C. botulinum type A, B, E og F - OK

Clostridium botulinum

•Inaktiverte SLP prøver analysert – Marburg virus detektert

Marburg virus

•EBOV Zaire detektert (inaktivert SLP)

•EBOV Sudan ikke detektert

Ebola virus

Andre agens

NIPH -

Bakteriekultur

Blodkultur

Lysert DNA

Ekstrahert DNA og RNA

Pasientprøver (vevsprøver, blod, BAL, CSF, leddvæske mm)

Miljøprøver (pulver, jord)

SLP

06/04/2018

Matriks

06.04.2018

12

NIPH -

Prøve

•pasientprøve

•Miljø / pulver

FilmArray –valgfritt

(unntatt pulver)

Direkte real-time PCR

Dyrking

•Bekreftende tester (PCR, Maldi-tof, andre)

06/04/2018

Diagnostisk flow

Vurdering: prøvetype, klinikk, arbeidstid eller vakt

NIPH -

+

• Enkel, rask og egnet for ulike matriks

• God sensitivitet

• Verdifullt supplemang for diagnostisk panel

• Egnet i vaktsammenheng

-

• Kostnad

• En prøve om gangen

• Skiller ikke mellom alle nært beslektede agens

• Falsk positiv Y. pestis

• Resulter må evalueres og bekreftes med andre metoder

06/04/2018

Oppsummering

FilmArrayTM BioThreat panel

- Raskt og nyttig verktøy