1-2세부과제

약물대사기반연구사업단


세부과제세부과제세부과제세부과제2009~2011. / 1-22009~2011. / 1-22009~2011. / 1-22009~2011. / 1-2

약물대사체의 독성평가를in vitro

위한 장내미생물총 및

분리장내미생물 효소복합체 개발

세부과제1-2 2222////89898989


목 차목 차목 차목 차

연구개발 내용 및 방법연구개발 내용 및 방법연구개발 내용 및 방법연구개발 내용 및 방법1.1.1.1.

차년도 연구내용차년도 연구내용차년도 연구내용차년도 연구내용1) 11) 11) 11) 1 ·······························································································7

차년도 연구방법차년도 연구방법차년도 연구방법차년도 연구방법2) 12) 12) 12) 1 ·······························································································7

분변수집 및 조제(1) ··································································································7

합성기질을 이용한 효소활성 측정(2) ·····································································9

천연물 분리 성분의 활성 분석 ····································································10

일본인과의 분변효소활성 비교를 위한 효소활성분석(3) ····························12

미국인과의 분변효소활성 비교를 위한 효소활성분석(4) ····························14

상관성 분석(5) ·········································································································14

차년도 연구내용차년도 연구내용차년도 연구내용차년도 연구내용3) 23) 23) 23) 2 ·······························································································15

장내 미생물 배양기술의 개발 및 확립 연구(1) ············································15

차년도 연구방법차년도 연구방법차년도 연구방법차년도 연구방법4) 24) 24) 24) 2 ···································································································15

분변 수집 및 조제(1) ································································································15

합성기질을 이용한 효소활성 측정(2) ································································16

을 이용한 시험(3) Fecalase Ames ··································································19

동물실험(4) ··············································································································20

상관성 분석(5) ········································································································20

(6) IRB ·····················································································································21

차년도 연구내용차년도 연구내용차년도 연구내용차년도 연구내용5) 35) 35) 35) 3 ·································································································24

장내 미생물 배양기술의 개발 및 확립 연구(1) ··············································24

세부과제1-2 3333////89898989


차년도 연구방법차년도 연구방법차년도 연구방법차년도 연구방법6) 36) 36) 36) 3 ·······························································································24

분변수집 및 조제(1) ··································································································24

천연물의 추출(2) ····································································································25

의 제조(3) Fecalase ·······························································································26

천연물 분리성분의 활성분석(4) ················································································26

및 를 이용한 시험(5) Fecalase intestinal bacterial enzyme mix Ames 27

제조 방법(6) Intestinal bacterial enzyme mix ············································27

동물실험(7) ··············································································································30

상관성 분석(8) ········································································································30

연구개발 결과연구개발 결과연구개발 결과연구개발 결과3.3.3.3.

차년도 연구개발 결과차년도 연구개발 결과차년도 연구개발 결과차년도 연구개발 결과1) 11) 11) 11) 1 ·····················································································30

분변조제 방법(1) ····································································································30

합성기질에 대한 의 분변효소활성 측정(2) 74 ·················································33

천연물성분에 대한 분변의 효소활성(3) ····························································34

약물로 사용되는 의(4) acetaminophen, bisacodyl, digoxin

대사 활성 분석··································································································36

방부제 또는 염색시약으로 사용되는(5)

의 대사활성amaranth, sudan I, sudan II, sudan IV ··························37

일본인과의 분변효소활성 비교(6) ······································································39

미국인과의 분변 효소활성 비교(7) ····································································39

의 제조 및 이를 이용한 돌연변이활성 측정(8) Fecalase ·····························40

치자의 대표적인 성분인 와 그 장내세균대사체(9) geniposide

의 돌변변이원성genipin ·················································································41

화장품원료 등으로 사용하는 과 그 장내세균대사체(10) arbutin

의 돌변변이원성hydroquinone ···································································42

천연물 및 한약에 널리 함유하고 있는 과 그 장내세균대사체(11) rutin

의 돌변변이원성quercetin ············································································43

세부과제1-2 4444////89898989


차년도 연구개발 결과차년도 연구개발 결과차년도 연구개발 결과차년도 연구개발 결과2) 22) 22) 22) 2 ·····················································································44

합성기질에 대한 인의 분변효소활성 측정(1) 100 ···········································44

및 의 분변의 장내세균 효소(2) Acetaminophen, digoxin bisacodyl

분획에 의한 대사활성························································································45

천연물 한약포함 함유 주요성분의 분변의 장내세균 효소 분획에(3) ( )

의한 대사활성 ··································································································47

를 이용한 돌연변이활성 측정(4) Fecalase ·······················································48

인삼 분리 성분 과 인삼엑스의 의(5) ginsenoside Rb1 ginsenoside Rb1

장내세균 효소에 의한 대사 활성 비교························································49

사람의 장내세균 효소의 황금분리성분 과 황금엑스 중의(6) baicalin

의 대사활성의 비교baicalin ·········································································50

황금 함유성분 의 장내세균에 의한 대사과정(7) baicalin ·····························51

황금 함유성분 및 이들의 대사체의 약리효능(8) baicalin

항소양 효과 비교( ) ··························································································52

더덕의 의 장내세균총에 의한 대사(9) Lancemaside A ·······························58

차년도 연구결과차년도 연구결과차년도 연구결과차년도 연구결과3) 33) 33) 33) 3 ·······························································································61

합성기질에 대한 분변효소활성 측정(1) ····························································61

천연약물 한약포함(2) Acetaminophen, digoxin, bisacodyl, ( )

함유 주요성분 amygdalin, arctiin, aucubin, geniposide,

ginsenoside Rb1, Rg1, mangiferin, puerarin, ponicirin,

방부제 의 분변의 장내세균 효소hesperidin, methyl paraben

분획에 의한 대사활성······················································································66

장내미생물효소활성의 식이에 의한 영향(3) ····················································69

인삼 분리 성분 과 의 장내세균 대사활성과(4) ginsenoside Rb1 Rg1

합성기질 에 대한 대사활성의 비교······························································70

인삼의 의 장내세균총에 의한 대사와 항대장염효과(5) ginsenoside Rb1 71

세부과제1-2 5555////89898989


황금 함유성분 의 장내세균에 의한 대사과정(6) baicalin ·····························75

황금 함유성분 및 이들의 대사체의 항염증효능 비교(7) baicalin ·············76

항생제에 의한 장내미생물 효소활성에 미치는 효과(8) ································77

를 이용한 돌연변이활성 측정(9) Fecalase ·······················································77

연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론4.4.4.4. ·················································································83

참고문헌참고문헌참고문헌참고문헌5.5.5.5. ·············································································································86

세부과제1-2 6666////89898989


세부과제1-2 7777////89898989


연구개발 내용 및 방법연구개발 내용 및 방법연구개발 내용 및 방법연구개발 내용 및 방법1.1.1.1.

차년도 연구내용차년도 연구내용차년도 연구내용차년도 연구내용1) 11) 11) 11) 1

건강 한국인 성인 인 선별 기준 설정50

건강 한국인 성인을 인 이상의 신선한 분변의 수집하여 성별 분류50

등-Glucuronidase, -glucosidase, arylsulfate sulfotransferase 10β β

개 이상 효소활성을 분석

등 개 이상의 천연 기질 및 의약품에 대한Ginsenoside Rb1 10 fecalase

활성 기질특이성 대사반응분석, ,

한국인 성인 장내세균총의 대사반응계인 표준 활성 기준 확립 및fecalase

개발fecalase

이용 시험법 검증Fecalase in vitro

식품 의약품 등의 성분군별 장내미생물총에 의한 대사전환율 비교,

연령별 성별에 따른 식품 의약품 등의 성분의 장내미생물총에 의한 대사전, ,

환율 비교

차년도 연구방법차년도 연구방법차년도 연구방법차년도 연구방법2) 12) 12) 12) 1

분변수집 및 조제분변수집 및 조제분변수집 및 조제분변수집 및 조제(1) :(1) :(1) :(1) :

연구대상은 임상윤리위원회의 승인을 거쳐 아래와 같이 수집하였다 세에. 15

서부터 세의 한국인 가운데 고혈압 당뇨병 심장질환 위장질환과 기타60 (1) , , ,

질환이 없는 자 최근 주간 항생제에 노출되지 않은 자 식생활 도, (2) 2 , (3) ,

시농촌 문화수준 등을 고려하여 성인을 대표할 수 있는 인 이상을 선별했, 50

다.

검체수집 대상자의 신선한 분변 그램 이상 채취하여 신속하게: 1 - 10 2

세부과제1-2 8888////89898989


배의 생리식염수 희석용 혐기성배지로 현탁하여 분변시료 제조 방법에- 20 ,

따라 처리하였다.

분변시료의 조제

분변시료조제 현탁액을 초음파 처리하여 에서 분간 원심분리(I): 10000xg 20①

하여 상등액을 얻었다.

분변시료조제 분변시료 현탁액을 에서 원심분리하고 초음파(II): 500 rpm②

처리하여 초음파처리 현탁액과 에서 분간 원심분리하여 상등액을10000rpm 10

얻었다.

분변시료조제 현탁액을 그대로 사용하였다(III): .③

세부과제1-2 9999////89898989


천연물의 추출

잘 건조한 행인 인삼 갈화 우방자 치자 황금 감초 진피 지실 갈근을 각, , , , , , , , ,

을 배의 증류수를 얻어 수욕상에서 시간 추출하고 그 잔사에 배을100 g 5 2 , 2

증류수를 넣어 시간 추출하고 합하였다 이 합한 추출액을 동결건조하여 사용1 .

하였다.

의 제조Fecalase

분변시료조제 의 방법에 따라 분변을 배의 생리식염수액을 넣어 분변 초음(II) 3

파처처리 하고 원심분리하여 얻은 상등액 을5 ml Sephacryl S-300 column

의 칼람에 걸어 분획을 받고 각분획 분획사이즈chromatography(2x20 cm) ( ,

에 대해 효소활성을 측정하였다 활성이 가장 높은 분획을 합하여1.5 ml) . 2

밀리포어로 여과멸균하여 로 사용하였다0.45 l fecalase .μ

합성기질을 이용한 효소활성 측정합성기질을 이용한 효소활성 측정합성기질을 이용한 효소활성 측정합성기질을 이용한 효소활성 측정(2)(2)(2)(2)

-Glucuronidase(1), -arabinopyranosidase(2),β α β

-galactopyranosidase(3), -xylopyranosidase(4), lipase(palmitase, 5),β

lipase(stearatase, 6), -arabinopyranosidase(7), -cellobiosidase(8),β β

-fucopyranosidase(9), -fucopyranosidase(10), -maltosidase(11),α β β

-rhamnosidase(12), N-acetyl- -galactosamidase(13), N-acetyl-α α β

-galactosamidase(14), N-acetyl- -glucosamidase(15),β α

-arabinfuranosidase(16), -galactopyranosidase(17),α α

-xylopyranosidase(18), -mannopyranosidase(19), Sulfatase(20),β β

효소활성 측정-glucopyranosidase(21) : 0.1 M sodium phosphate

와 분변효소액 검체 합성기질buffer(pH 7.0) 375 ( ) 25 , 2.5 mM 100㎕㎕

를 넣고 에서 시간 반응시킨 후shaking water bath(37.1±1 ) 1 0.5N㎕ ℃

로 반응을 정지시켜 에서 분간 원심분리하여NaOH 500 3000rpm 10 UV㎕

로 에서 흡광도를 측정하였다spectrophotometer 405 nm .

합성기질 종 이상(10 ) : 4-nitrophenyl-N-acetyl-α

세부과제1-2 10101010////89898989


-D-galactosaminide, 4-nitrophenyl-N-acetyl- -D-galactosaminide,β

4 - n i t r o p h e n y l - N - a c e t y l - - D - g l u c o s a m i n i d e ,α

4-nitrophenyl-N-acetyl- -D-glucosaminide, 4-nitrophenyl-β α

-L-arabinofuranoside, 4-nitrophenyl- -L-arabinopyranoside,α

4-nitrophenyl- -L-arabinopyranoside, 4-nitrophenyl-β β

-D-cellobioside, 4-nitrophenyl- -L-fucopyranoside, 4-nitrophenyl-α

-D-fucopyranoside, 4-nitrophenyl- -D-galactopyranoside,β α

4-nitrophenyl- -D-galactopyranoside, 4-nitrophenyl-β α

-D-xylopyranoside, 4-nitrophenyl- -D-xylopyranoside,β

4-nitrophenyl- -D-glucuronide, 4-nitrophenyl- -D-maltoside,β β

4-nitrophenyl- -D-mannopyranoside, 4-nitrophenyl plamitate,β

4-nitrophenyl stearate, 4-nitrophenyl phosphate, 4-nitrophenyl-α

-L-rhamnopyranoside, 4-nitrophenyl-1-thio- -D-galactopyranoside,β

4-nitrophenyl- -D-xylopyranoside, 4-nitrophenyl-α β

을 이용하여 측정하였다-D-xylopyranoside .

천연물 분리 성분의 활성 분석천연물 분리 성분의 활성 분석천연물 분리 성분의 활성 분석천연물 분리 성분의 활성 분석

Pura① 및 갈근추출물 행인추출물 등을 이용한rin, amygdalin, arbutin , O-β

및 의 활성분석 갈근추출물 행인-D-glucosidase C-glucosidase : 0.5 mg/ml ,

추출물 또는 을 분변효소액, 0.05 mM puerarin, amygdalin arbutin 0.1 ml, 0.02

인산완충액 을 넣어서 시간 배양하고 같은 양의 을ml 10 mM 380 ml 4 ethanol

첨가여 원심분리하고 농축하여 전개용매, , TLC( -CHCl3 : MeOH : H2O =

또는 를 이용하여 반응생성물의 등의7.5:3:1(v/v)) HPLC puerarin, amygdalin

감소량을 정량하였다.

갈화추출물 진피추출물 지실추출Kakkalide, hesperidin, poncirin, rutin, , ,②

물 등을 이용한 활성 분석 갈화추출물 진피rhamnoglycosidase : 0.5 mg/ml ,

추출물 지실추출물 또는 을, , 0.05 mM hesperidin, poncirin, rutin 0.1 ml,

세부과제1-2 11111111////89898989


분변효소액 인산완충액 을 넣어서 시간 배양하고 같0.02 ml 10 mM 380 ml 4

은 양의 을 첨가여 원심분리하고 농축하여 전개용매ethanol , , TLC( -CHCl3 :

또는 를 이용하여MeOH : H2O = 7.5:3:1(v/v)) HPLC kakkalide,

등의 감소량을 정량하였다hesperidin, poncirin, rutin .

황금추출물 감초추출물 등을 이용한Baicalin, wogonoside, glycyrrhizin, ,③

활성 분석 황금추출물 감초추출물-glucuronidase : 0.5 mg/ml , , 0.05 mMβ

을 분변효소액baicalin, wogonoside, glycyrrhizin 0.1 ml, 0.02 ml 10 mM

인산완충액 을 넣어서 시간 배양하고 같은 양의 을 첨가여 원380 ml 4 ethanol

심분리하고 농축하여 전개용매, , TLC( -CHCl3 : MeOH : H2O =

또는 로 등의 감소7.5:3:1(v/v)) HPLC baicalin, wogonoside, glycyrrhizin

량을 측정하였다.

치자추출물 등을 이용한 효소활Geniposide, catalpol, iridoid glycosidase④

성 분석 치자추출물 또는 을: 0.5 mg/ml , 0.05 mM geniposide, catalpol 0.1

분변효소액 인산완충액 을 넣어서 시간 배양하ml, 0.02 ml 10 mM 380 ml 4

고 같은 양의 을 첨가여 원심분리하고 농축하여 전개용매ethanol , , TLC(

또는 를-CHCl3 : MeOH : H2O = 7.5:3:1(v/v)) HPLC geniposide,

등의 감소량을 측정하였다catalpol .

우방자추출물 등을 이용한 효소활성 분석Arctiin, lignan glycosidase : 0.5⑤

우방자추출물 을 분변효소액mg/ml , 0.05 mM arctiin 0.1 ml, 0.02 ml 10

인산완충액 을 넣어서 시간 배양하고 같은 양의 을 첨가mM 380 ml 1 ethanol

여 원심분리하고 농축하여 전개용매, , TLC( -CHCl3 : MeOH : H2O =

또는 를 이용하여 등의 감소량을 측정하였다7.5:3:1(v/v)) HPLC arctiin .

인삼추출물 등을 이용한 베타글루코Ginsenoside Rb1, ginsenoside Rg1,⑥

시다제 활성 분석 인삼추출물 인 또: 0.5 mg/ml , 0.05 mM ginsenoside Rb1,

는 을 분변효소액 인산완충액ginsenoside Rg1 0.1 ml, 0.02 ml 10 mM 380

을 넣어서 시간 배양하고 같은 양의 을 첨가여 원심분리하고 농축ml 4 ethanol ,

하여 전개용매 또는 를, TLC( -CHCl3 : MeOH : H2O = 7.5:3:1(v/v)) HPLC

세부과제1-2 12121212////89898989


이용하여 등의 감소량을 측정하였다ginsenoside Rb1, Rg1 .

대사활성 측정Bisacodyl, acetaminophen, digoxin : 0.05 mM bisacodyl,⑦

또는 을 분변효소액 을 넣고acetaminophen, digoxin 0.1 ml, 0.02 ml 10mM

를 넣어서 에서 시간 반응시키고 같은 양phosphate buffer 0.38 ml 37±1 1℃

의 을 첨가하여 원심분리하고 농축하여 전개용매ethanol , TLC ( -CHCl3 :

또는 를 사용하여 분리하여 대사체 또MeOH : H2O = 7.5:3:1(v/v)) HPLC

는 원화합물의 감소량을 측정하여 대사량을 계산한다.

의 대사체활성 분석 을Methyl paraben : 0.05 mM methylparaben 0.1 ml,⑧

분변효소액 을 넣고 를 넣어서0.02 ml 10mM phosphate buffer 0.38 ml

에서 시간 반응시키고 같은 양의 을 첨가하여 원심분리하고37±1 4 ethanol ,℃

농축하여 전개용매 또는TLC ( -CHCl3 : MeOH : H2O = 7.5:3:1(v/v))

를 사용하여 분리하여 대사체 또는 원화합물의 감소량을 측정하여 대사HPLC

량을 계산한다.

의 대사활성 분석Amaranth, Sudan I, Sudan II, Sudan IV : 0.05 mM⑨

또는 을 분변효소액amaranth, Sudan I, Sudan II Sudan IV 0.1 ml, 0.02

을 넣고 를 넣어서 에서 분ml 10 mM phosphate buffer 0.38 ml 37±1 10℃

간 반응시키고 같은 양의 을 첨가하여 원심분리하고 농축하여ethanol , TLC

전개용매 또는 를 사용하여( -CHCl3 : MeOH : H2O = 7.5:3:1(v/v)) HPLC

분리하여 대사체 또는 원화합물의 감소량을 측정하여 대사량을 계산한다.

일본인과의 분변효소활성 비교를 위한 효소활성분석일본인과의 분변효소활성 비교를 위한 효소활성분석일본인과의 분변효소활성 비교를 위한 효소활성분석일본인과의 분변효소활성 비교를 위한 효소활성분석(3)(3)(3)(3)

효소활성 분변을-Glucosidase : 0.1M sodium phosphate buffer(pHβ

에 현탁하여 희석하고 을 회 실시 한 후 원심분리 한 것과7.0) , sonication 12

원심분리 과정을 거치지 않은 두 종류를 효소액으로 사용하였다. 50 mM

와 효소액potassium phosphate buffer(pH 7.2) 550 50 ,㎕㎕

최종농도 를 넣고p-nitrophenyl- -D-glucopyranoside 400 ( 3 mM)β ㎕

세부과제1-2 13131313////89898989


수욕상에서 분간 반응시킨 후 로 반응을 정지시37 30 5% Na2CO3 250℃ ㎕

킨 후 에서 흡광도를 측정하였다405 nM .

효소활성 분변을-Glucuronidase : 0.1M sodium phosphate buffer(pHβ

에 현탁하여 희석하고 을 회 실시 한 후 원심분리 한 것과7.0) , sonication 12

원심분리 과정을 거치지 않은 두 종류를 효소액으로 사용하였다. 50mM

와 효소액potassium phosphate buffer(pH 7.2) 550 50 ,㎕㎕

최종농도 를 넣고p-nitrophenyl- -D-glucuronide 400 ( 3 mM) 37β ㎕ ℃

수욕상에서 분간 반응시킨 후 로 반응을 정지시킨 후30 5% Na2CO3 250 ㎕

에서 흡광도를 측정하였다405 nM .

효소활성 위와 동일한 방법으로 얻은 효소액 과Sulfatase : 50 50 mM㎕

potassium phosphate buffer(pH 7.2) 550 , p-nitrophenyl-sulfate 400㎕

최종농도 를 넣고 수욕상에서 시간 동안 반응시키고( 3mM) 37 3 5%㎕ ℃

로 반응을 정지시킨 후 에서 흡광도를 측정하였다Na2CO3 250 405 nM .㎕

효소활성 분변 침전물은Neural urease : 0.1M sodium phosphate

로 현탁한 후 희석하고 을 회 실시 한 후 원심분buffer(pH 7.0) , sonication 12

리 한 것과 원심분리 과정을 거치지 않은 두 종류를 효소액으로 사용하였다.

와 효소액0.1M sodium phosphate buffer(pH 7.0) 50 50 , 5M urea㎕㎕

를 넣고 수욕상에서 시간 반응시킨 후 로 반50 37 4 1 N H2SO4 100㎕ ℃ ㎕

응을 정지시키고 증류수Solution (phenol 5 g, 500 , sodiumⅠ ㎖

nitroprusside 25 mg), Solution (NaOH 2.5 g, sodium phosphateⅡ

증류수 를 각각 씩 가한 후dibasic 26.8g, NaOCl 10 , 490 ) 1 60㎖㎖㎖ ℃

에서 분간 열처리한 후 에서 분간 원심분리하여 에서20 3000 rpm 10 660 nm

흡광도를 측정하였다.

효소활성 를 사용하여Acidic urease : 0.1M citiric acid buffer(pH=3.5)

와 동일한 방법으로 측정하였다Neural urease .

세부과제1-2 14141414////89898989


미국인과의 분변효소활성 비교를 위한 효소활성분석미국인과의 분변효소활성 비교를 위한 효소활성분석미국인과의 분변효소활성 비교를 위한 효소활성분석미국인과의 분변효소활성 비교를 위한 효소활성분석(4)(4)(4)(4)

분변조제 방법 에 따라 조제한 초음파처리하고 원심분리하여 얻은 상등(II)

액을 칼람을 걸어 제조한 분변분획 기질Sephacryl S-300 0.1 ml, 0.3 ml

(1.3 mM O-Nitrophenyl- -D-galactopyranoside, 5 mMβ

O-nitrophenyl- -D-xyloside, 5 mM p-nitophenyl- -D-glucoside,β α

2.5 mM p-nitophenyl- -D-glucuronide, 5 mM p-nitrophenyl-β β

-D-glucoside, 1.5 mM p-nitrophenyl- -L-fucoside), 10mMα

을 넣고 도에서 분간 배양하고Potassium phosphate buffer 1.6 ml 37.8 15 ,

을 넣오 반응을 정지시키고 흡광도 또는1 mM Na2CO3 1 ml , 420 nm 400

에서 측정하여 검량선으로부터 효소활성을 계산하였다nm .

을 이용한 시험을 이용한 시험을 이용한 시험을 이용한 시험Fecalase AmesFecalase AmesFecalase AmesFecalase Ames

시험관 을 의 항온수조에서 분간 예열시키시고(5 ml) 45 10 top agar 2℃

를 넣고 과 용액을 각각ml , 0.5 mM L-histidine·HCl 0.5mM biotin 0.2 ml

씩 넣는다 미리 배양한 또는 의 세균. Salmonella typhimurium TA98 TA100

현탁액 와 시료 혼합액 또는 와 를 를 가하0.1 ml , S-9 0.5 ml / fecalase 0.5 ml

고 가 고루 섞이도록 잘 흔들어 주었다 미리 만들어둔top agar .

한천평판배지 위에 배양혼합액을 부어 넣고 고루 퍼지도록 한Vogel-Bonner

다 접종된 평판배지는 에서 시간 배양한 후 집락 을 계수하였. 37 48 (colony)℃

다.

상관성 분석상관성 분석상관성 분석상관성 분석(5)(5)(5)(5)

통계방법은 을 이용하여 군간의 비교는SPSS for win 8.0 2 independent

로 하였으며 각군간의 효소활성치 비교는 혹은T-test , Wilcoxon-signed test

세부과제1-2 15151515////89898989


로 사후검정은 로 이하인 경우를 유ANOVA test , Duncan Test P value 0.05

의성 있는 것으로 판단함


장내 미생물 배양기술의 개발 및 확립 연구장내 미생물 배양기술의 개발 및 확립 연구장내 미생물 배양기술의 개발 및 확립 연구장내 미생물 배양기술의 개발 및 확립 연구(1)(1)(1)(1)



등 개 이상 효소활성을-Glucuronidase, -glucosidase, sulfataase 10β β

분석




개발fecalase

이용 시험법 검증Fecalase in vitro

약물의 생리활성 발현에 장내세균의 역할을 에서 규명in vivo



환율 비교



연구대상은 임상윤리위원회의 승인을 거쳐 아래와 같이 수집하였다.①

세에서부터 세의 한국인 가운데20 75

고혈압 당뇨병 심장질환 위장질환과 기타 질환이 없는 자- , , ,

최근 주간 항생제에 노출되지 않은 자- 2

세부과제1-2 16161616////89898989


식생활 도시농촌 문화수준 등을 고려하여 성인을 대표할 수 있는 인- , , 50

이상을 선별했다.

검체수집②

대상자의 신선한 분변 그램 이상 채취하여 신속하게 배의 생1 - 10 2 - 20

리식염수 희석용 혐기성배지로 현탁하여 분변시료 제조 방법에 따라 처리하였,

다.

분변시료의 조제③

분변시료를 4o 의 배의 를 넣고 잘 현탁하고 에서 원심분리하C 3 PBS 500 rpm

고 상등액을 분리하고 초음파처리 하여 초음파처리 현탁액을, (10 min)

에서 분간 원심분리하여 상등액을 얻었다 이를 조 로 사10000rpm 10 . fecalase

용하였다.

천연물의 추출④

잘 건조한 인삼 갈화 우방자 치자 황금 감초 진피 지실 갈근을 각, , , , , , , , 100 g

을 배의 증류수를 얻어 수욕상에서 시간 추출하고 그 잔사에 배을 증류수5 2 , 2

를 넣어 시간 추출하고 합하였다 이 합한 추출액을 동결건조하여 사용하였1 .

다.

합성기질을 이용한 효소활성 측정합성기질을 이용한 효소활성 측정합성기질을 이용한 효소활성 측정합성기질을 이용한 효소활성 측정(2)(2)(2)(2)

-Glucuronidase(1), -arabinopyranosidase(2),① β α β

-galactopyranosidase(3), -xylopyranosidase(4), lipase(palmitase, 5),β

lipase(stearatase, 6), -arabinopyranosidase(7), -cellobiosidase(8),β β

-fucopyranosidase(9), -fucopyranosidase(10), -maltosidase(11),α β β

-rhamnosidase(12), N-acetyl- -galactosamidase(13), N-acetyl-α α β

-galactosamidase(14), N-acetyl -glucosamidase(15),β α


-xylopyranosidase(18), -mannopyranosidase(19), Sulfatase(20),β β

효소활성 측정-glucopyranosidase(21) : 0.1 M sodium phosphate

세부과제1-2 17171717////89898989


와 분변효소액 검체 합성기질buffer(pH 7.0) 375 ( ) 25 , 2.5 mM 100㎕㎕㎕

를 넣고 에서 시간 반응시킨 후shaking water bath(37.1±1 ) 1 0.5N℃

로 반응을 정지시켜 에서 분간 원심분리하여NaOH 500 3000rpm 10 UV㎕

로 에서 흡광도를 측정하였다spectrophotometer 405nm .

합성기질 종 이상(10 ) :

4-nitrophenyl-N-acetyl- -D-galactosaminide,α

4-nitrophenyl-N-acetyl- -D-galactosaminide,β

4-nitrophenyl-N-acetyl- -D-glucosaminide,α

4-nitrophenyl-N-acetyl- -D-glucosaminide,β

4-nitrophenyl- -L-arabinofuranoside,α

4-nitrophenyl- -L-arabinopyranoside,α

4-nitrophenyl- -L-arabinopyranoside,β

4-nitrophenyl- -D-cellobioside,β

4-nitrophenyl- -L-fucopyranoside,α

4-nitrophenyl- -D-fucopyranoside,β

4-nitrophenyl- -D-galactopyranoside,α

4-nitrophenyl- -D-galactopyranoside,β

4-nitrophenyl- -D-xylopyranoside,α

4-nitrophenyl- -D-xylopyranoside,β

4-nitrophenyl- -D-glucuronide, 4-nitrophenyl- -D-maltoside,β β

4-nitrophenyl- -D-mannopyranoside, 4-nitrophenyl plamitate,β

4-nitrophenyl stearate, 4-nitrophenyl phosphate,

4-nitrophenyl- -L-rhamnopyranoside,α

4-nitrophenyl-1-thio- -D-galactopyranoside,β

4-nitrophenyl- -D-xylopyranoside,α

을 이용하여 측정하였다4-nitrophenyl- -D-xylopyranoside .β

천연물 분리 성분의 활성 분석②

및 갈근추출물 행인추출물 등을 이용한Purarin, amygdalin , O-β

및 의 활성분석 갈근추출물 행-D-glucosidase C-glucosidase : 0.5 mg/ml ,

인추출물 또는 을 분변효소액, 0.05 mM puerarin, amygdalin arbutin 0.1 ml,

세부과제1-2 18181818////89898989


인산완충액 을 넣어서 시간 배양하고 같은 양의0.02 ml 10 mM 380 ml 4

을 첨가여 원심분리하고 농축하여 전개용매ethanol , , TLC( -CHCl3 : MeOH :

또는 를 이용하여 반응생성물의H2O = 7.5:3:1(v/v)) HPLC puerarin,

등의 감소량을 정량하였다amygdalin .

갈화추출물 진피추출물 지실추출Kakkalide, hesperidin, poncirin, rutin, , ,

물 등을 이용한 활성 분석 갈화추출물 진피rhamnoglycosidase : 0.5 mg/ml ,

추출물 지실추출물 또는 을, , 0.05 mM hesperidin, poncirin, rutin 0.1 ml,

분변효소액 인산완충액 을 넣어서 시간 배양하고 같0.02 ml 10 mM 380 ml 4

은 양의 을 첨가여 원심분리하고 농축하여 전개용매ethanol , , TLC( -CHCl3 :

또는 를 이용하여MeOH : H2O = 7.5:3:1(v/v)) HPLC kakkalide,

등의 감소량을 정량하였다hesperidin, poncirin, rutin .

황금추출물 감초추출물 등을 이용한Baicalin, woogonoside, glycyrrhizin, ,

활성 분석 황금추출물 감초추출물-glucuronidase : 0.5 mg/ml , , 0.05 mMβ

을 분변효소액baicalin, wogonoside, glycyrrhizin 0.1 ml, 0.02 ml 10 mM

인산완충액 을 넣어서 시간 배양하고 같은 양의 을 첨가여 원380 ml 4 ethanol

심분리하고 농축하여 전개용매, , TLC( -CHCl3 : MeOH : H2O =

또는 로 등의 감소7.5:3:1(v/v)) HPLC baicalin, wogonoside, glycyrrhizin

량을 측정하였다.

치자추출물 등을 이용한 효소활Geniposide, catalpol, iridoid glycosidase

성 분석 치자추출물 또는 을: 0.5 mg/ml , 0.05 mM geniposide, catalpol 0.1

분변효소액 인산완충액 을 넣어서 시간 배양하ml, 0.02 ml 10 mM 380 ml 4

고 같은 양의 을 첨가여 원심분리하고 농축하여 전개용매ethanol , , TLC(

또는 를-CHCl3 : MeOH : H2O = 7.5:3:1(v/v)) HPLC geniposide,

등의 감소량을 측정하였다catalpol .

우방자추출물 등을 이용한 효소활성 분석Arctiin, lignan glycosidase : 0.5

우방자추출물 을 분변효소액mg/ml , 0.05 mM arctiin 0.1 ml, 0.02 ml 10

세부과제1-2 19191919////89898989


인산완충액 을 넣어서 시간 배양하고 같은 양의 을 첨가mM 380 ml 1 ethanol

여 원심분리하고 농축하여 전개용매, , TLC( -CHCl3 : MeOH : H2O =

또는 를 이용하여 등의 감소량을 측정하였다7.5:3:1(v/v)) HPLC arctiin .

인삼추출물 등을 이용한 베타글루코Ginsenoside Rb1, ginsenoside Rg1,

시다제 활성 분석 인삼추출물 인 또: 0.5 mg/ml , 0.05 mM ginsenoside Rb1,

는 을 분변효소액 인산완충액ginsenoside Rg1 0.1 ml, 0.02 ml 10 mM 380

을 넣어서 시간 배양하고 같은 양의 을 첨가여 원심분리하고 농축ml 4 ethanol ,

하여 전개용매 또는 를, TLC( -CHCl3 : MeOH : H2O = 7.5:3:1(v/v)) HPLC

이용하여 등의 감소량을 측정하였다ginsenoside Rb1, Rg1 .

대사활성 측정Bisacodyl, acetaminophen, digoxin : 0.05 mM bisacodyl,

또는 을 분변효소액 을 넣고acetaminophen, digoxin 0.1 ml, 0.02 ml 10mM

를 넣어서 에서 시간 반응시키고 같은 양phosphate buffer 0.38 ml 37±1 1℃

의 을 첨가하여 원심분리하고 농축하여 전개용매ethanol , TLC ( -CHCl3 :

또는 를 사용하여 분리하여 대사체 또MeOH : H2O = 7.5:3:1(v/v)) HPLC

는 원화합물의 감소량을 측정하여 대사량을 계산한다.

의 대사체활성 분석 을Methyl paraben : 0.05 mM methylparaben 0.1 ml,


에서 시간 반응시키고 같은 양의 을 첨가하여 원심분리하고37±1 4 ethanol ,℃

농축하여 전개용매 또는TLC ( -CHCl3 : MeOH : H2O = 7.5:3:1(v/v))

를 사용하여 분리하여 대사체 또는 원화합물의 감소량을 측정하여 대사HPLC

량을 계산한다.

을 이용한 시험을 이용한 시험을 이용한 시험을 이용한 시험(3) Fecalase Ames(3) Fecalase Ames(3) Fecalase Ames(3) Fecalase Ames

시험관 을 의 항온수조에서 분간 예열시키시고 를(5 ml) 45 10 top agar 2 ml℃

넣고 과 용액을 각각 씩 넣, 0.5 mM L-histidine·HCl 0.5mM biotin 0.2 ml

는다 미리 배양한 또는 의 세균현탁. Salmonella typhimurium TA98 TA100

세부과제1-2 20202020////89898989


액 와 시료 혼합액 또는 와 를 를 가하고0.1 ml , S-9 0.5 ml / fecalase 0.5 ml

가 고루 섞이도록 잘 흔들어 주었다 미리 만들어둔top agar . Vogel-Bonner

한천평판배지 위에 배양혼합액을 부어 넣고 고루 퍼지도록 한다 접종된 평판.

배지는 에서 시간 배양한 후 집락 을 계수하였다37 48 (colony) .℃

동물실험동물실험동물실험동물실험(4)(4)(4)(4)

경희대학교의 동물윤리규정에 따라 사육하고 윤리위원회의 심의를 거쳐 동물실

험을 진행하였다.



로 하였으며 각군간의 효소활성치 비교는 혹은T-test , Wilcoxon-signed test

로 사후검정은 로 이하인 경우를 유ANOVA test , Duncan Test P value 0.05

의성 있는 것으로 판단하였다.

세부과제1-2 21212121////89898989


(6) IRB(6) IRB(6) IRB(6) IRB

임상연구계획서개요임상연구계획서개요임상연구계획서개요임상연구계획서개요< >< >< >< >

세부과제1-2 22222222////89898989


제 목제 목제 목제 목독성 평가용 장내세균효소복합체 개발을 위한 효(fecalase)

소활성 연구 한국인 표준 작성을 위한 사전연구-

목 적목 적목 적목 적

소화관에 서식하는 장내미생물총은 경구로 섭취하는 약물

한약포함 기능성식품 담즙으로 분비되는 내인성 및 외인( ), ,

성 물질들과 담즙 배설물들을 대사시켜 흡수에 영향을 줄뿐

만 아니라 이 성분들의 약효 및 독성 발현에 관여하고 있다.

이러한 물질의 대사체에 의한 약효 및 독성은 식품 식품첨,

가물 한약 천연물신약 등이 장내세균총에 의해 생성되어지, ,

는 대사체들에 의해 발생할 수 있다.

본 연구에서는 약물 기능성식품 등의 안전성을 확보하기 위,

해 우리나라 사람의 소화관내에서의 약물대사반응을 평가할

수 있는 장내세균총 복합체를 만들기 위해 우리나라 사람의

분변중의 세균기인성 약물효소 대사 활성을 조사한다( ) .

시험 책임자시험 책임자시험 책임자시험 책임자 임성빈 경희의료원 임상약리학과M.D., Ph.D.

대상 피험자대상 피험자대상 피험자대상 피험자 일반 성인남녀 명 대상100

시험방법시험방법시험방법시험방법

피험자에게 연구 참여 여부를 확인 받고 동의서 작성 후 시

험을 진행한다 채변통 채변시트지 채변스푼 등을 나눠주고. , ,

대상자의 신선한 분변 그램 이상 채취한다 분변을 빠른5 .

시간내에 배의 희석혐기성배지로 현탁하여 원심분리하여20

세균총분획을 제조하고 베타글루코시다제 등의 효소활성을,

분석한다.

개 요개 요개 요개 요

우리나라 사람 인 이상의 분변의 수집하여 성별을 분1. 100

류하고 등, -glucuronidase, -glucosidase, sulfataseβ β

개 이상 효소활성을 분석한다10 .

합성 및 천연성분 기질에 대한 효소 활성 기질2. (fecalase) ,

특이성 등을 분석하고 우리나라 사람의 장내세균총의 약물대

사 반응을 평가하기 위한 기초자료로 활용한다.

연령별 성별에 따른 식품 의약품 등의 성분의 장내미생물3. , ,

총에 의한 대사전환율 비교한다.

시험법으로 을 이용하여 등의 유전독4. Ames fecalase rutin

성을 평가한다.

세부과제1-2 23232323////89898989


피험자 스크리닝 기록피험자 스크리닝 기록피험자 스크리닝 기록피험자 스크리닝 기록< >< >< >< >

독성 평가용 장내세균효소복합체개발을 위한 효소활성 연구독성 평가용 장내세균효소복합체개발을 위한 효소활성 연구독성 평가용 장내세균효소복합체개발을 위한 효소활성 연구독성 평가용 장내세균효소복합체개발을 위한 효소활성 연구

피험자 번호 피험자 영문 이니셜

병력 (Medical History)

아래의 항목들 중 해당 사항이 있는 경우 해당란에 표시를 하여 주시기 바랍니다.√

또한 기타 질환이 있는 경우 구체적으로 기술하여 주시기 바랍니다.

현재 임신 중이거나 현재 앓고 있는 부인과 질환의 유무 예 아니오□ □

그 밖에 앓고 있는 질환 예 아니오□ □

예 라면 구체적인 질환명(‘ ’ : )

최근에 복용 중인 약물 예 아니오□ □

예 라면 구체적인 약물명(‘ ’ : )

담당 연구자 성명 서명 검사일: : :

세부과제1-2 24242424////89898989


Subjects Information QuestionnaireSubjects Information QuestionnaireSubjects Information QuestionnaireSubjects Information Questionnaire

성명 이니셜 성별 남 여: : □ □

출생 년도 출생일, :

직업 결혼 미혼 기혼 이혼 사별 동거: : / / / /

식습관 주당 평균 섭취 빈도( ):

육류 위주 식사 예 아니오 섭취빈도 회 주1. ( / )□ □

야채류 위주 식사 예 아니오 섭취빈도 회 주2. ( / )□ □

발효음식 섭취 유무3.

된장등 장류 예 아니오 섭취빈도 회 주( ) ( / )□ □

김치 젓갈류 등 전통발효 식품 예 아니오 섭취빈도 회 주( , ) ( / )□ □

요구르트 치즈 등 유제품 예 아니오 섭취빈도 회 주( , ) ( / )□ □

일반정보 :

키1. : cm

몸무게2. : Kg

흡연 유무 예 아니오: □ □

흡연시 일일흡연량 개피( ) : 1-10 ( )

개피11-20 ( )

개피21-30 ( )

개피 이상31 ( )

음주 유무 예 아니오: □ □

음주시 주당 음주량 맥주 병 주: ___ /

소주 등 증류주 병 주___ /

막걸리등 전통 발효주 병 주___ /

기타 주류 병 주( ) ___ /

채변 주일 이내 설사 등을 포함한 대장 이상 유무 예 아니오1 : □ □

이상 증상 이상 빈도 회 주( ) : ___ /

채변 개월 이내 항생제 혹은 정장제 복용 유무 예 아니오1 : □ □

복용제 정장제 항생제: □ □

세부과제1-2 25252525////89898989



장내 미생물 배양기술의 개발 및 확립 연구장내 미생물 배양기술의 개발 및 확립 연구장내 미생물 배양기술의 개발 및 확립 연구장내 미생물 배양기술의 개발 및 확립 연구(1)(1)(1)(1)



등 개 이상 효소활성을-Glucuronidase, -glucosidase, sulfataase 10β β

분석




개발fecalase

또는 장내세균효소복합체 이Fecalase (intestinal microbial enzyme mix)

용 시험법 검증in vitro

의 안정성 분석Intestinal microbial enzyme mix

약물의 생리활성 발현에 장내세균의 역할을 에서 규명in vivo



환율 비교



연구대상은 임상윤리위원회의 승인을 거쳐 아래와 같이 수집하였다.①

세에서부터 세의 한국인 가운데15 60

고혈압 당뇨병 심장질환 위장질환과 기타 질환이 없는 자- , , ,

최근 주간 항생제에 노출되지 않은 자- 2

식생활 도시농촌 문화수준 등을 고려하여 성인을 대표할 수 있는 인 이- , , 50

상을 선별했다.

세부과제1-2 26262626////89898989


검체수집②

대상자의 신선한 분변 그램 이상 채취하여 신속하게 배의 생1 - 10 2 - 20

리식염수 희석용 혐기성배지로 현탁하여 분변시료 제조 방법에 따라 처리하였,

다.

분변시료의 조제③

분변시료 현탁액을 에서 원심분리하고 초음파처리하여 초음파처리 현500 rpm

탁액과 에서 분간 원심분리하여 상등액을 얻었다10000rpm 10 .

분리균주의 동정④

활성이 우수했던 균주를 선별하여 그람 염색하고 이어서 선별균의,

를 추출하고 원핵생물 로chromosomal DNA , 16S RNA universal primer

를 실시하고 하고 로 균주를 동정한다PCR sequencing NCBI Blast search .

분리 균주의 조효소액의 조제⑤

개 효소에 특이활성을 갖는 균주를 혈액 함유 혐기성배지 에 시간21 (GAM) 24

배양하고 원심분리하고 얻은 균체를 초음파처리 하여 조효소액을 제조한다.

조효소액의 안정성 조사⑥

얻어지는 조효소액을 동결건조 또는 에 녹인 용액으로 제조한 후10% glycerol

각각 또는 일정비율로 혼합한 후 이들의 안정성을 조사한다.

천연물의 추출천연물의 추출천연물의 추출천연물의 추출(2)(2)(2)(2)

잘 건조한 행인 인삼 갈화 우방자 치자 황금 감초 진피 지실 갈근을 각, , , , , , , , ,

을 배의 증류수를 얻어 수욕상에서 시간 추출하고 그 잔사에 배을100 g 5 2 , 2

증류수를 넣어 시간 추출하고 합하였다 이 합한 추출액을 동결건조하여 사용1 .

함

세부과제1-2 27272727////89898989


의 제조의 제조의 제조의 제조(3) Fecalase(3) Fecalase(3) Fecalase(3) Fecalase

분변시료조제 의 방법에 따라 분변을 배의 생리식염수액을 넣어 분변 초음(II) 3

파처처리 하고 원심분리하여 얻은 상등액 을5 ml Sephacryl S-300 column

의 칼람에 걸어 분획을 받고 각분획 분획사이즈chromatography(2x20 cm) ( ,

에 대해 효소활성을 측정하였다 활성이 가장 높은 분획을 합하여1.5 ml) . 2

밀리포어로 여과멸균하여 로 사용함0.45 l fecalaseμ

천연물 분리 성분의 활성 분석천연물 분리 성분의 활성 분석천연물 분리 성분의 활성 분석천연물 분리 성분의 활성 분석(4)(4)(4)(4)

및 갈근추출물 행인추출물 등을 이용한Purarin, amygdalin, arbutin , O-①

및 의 활성분석 갈근추출-D-glucosidase C-glucosidase : 0.5 mg/mlβ

물 행인추출물 또는 을, , 0.05 mM puerarin, amygdalin arbutin 0.1 ml,

분변효소액 인산완충액 을 넣어서 시간 배양하고0.02 ml 10 mM 380 ml 4

같은 양의 을 첨가여 원심분리하고 농축하여 전개용매ethanol , , TLC(

또는 를 이용하여 반응생-CHCl3 : MeOH : H2O = 7.5:3:1(v/v)) HPLC

성물의 등의 감소량을 정량함puerarin, amygdalin

갈화추출물 진피추출물 지실추출Kakkalide, hesperidin, poncirin, rutin, , ,②

물 등을 이용한 활성 분석 갈화추출물 진rhamnoglycosidase : 0.5 mg/ml ,

피추출물 지실추출물 또는 을, , 0.05 mM hesperidin, poncirin, rutin 0.1

분변효소액 인산완충액 을 넣어서 시간 배양ml, 0.02 ml 10 mM 380 ml 4

하고 같은 양의 을 첨가여 원심분리하고 농축하여 전개용매ethanol , , TLC(

또는 를 이용하여-CHCl3 : MeOH : H2O = 7.5:3:1(v/v)) HPLC

등의 감소량을 정량함kakkalide, hesperidin, poncirin, rutin

황금추출물 감초추출물 등을 이용한Baicalin, wogonoside, glycyrrhizin, ,③

활성 분석 황금추출물 감초추출물-glucuronidase : 0.5 mg/ml , , 0.05β

을 분변효소액mM baicalin, wogonoside, glycyrrhizin 0.1 ml, 0.02 ml

세부과제1-2 28282828////89898989


인산완충액 을 넣어서 시간 배양하고 같은 양의10 mM 380 ml 4 ethanol

을 첨가여 원심분리하고 농축하여 전개용매, , TLC( -CHCl3 : MeOH : H2O

또는 로 등의= 7.5:3:1(v/v)) HPLC baicalin, wogonoside, glycyrrhizin

감소량을 측정함

치자추출물 등을 이용한 효소Geniposide, catalpol, iridoid glycosidase④

활성 분석 치자추출물 또는 을: 0.5 mg/ml , 0.05 mM geniposide, catalpol

분변효소액 인산완충액 을 넣어서 시간0.1 ml, 0.02 ml 10 mM 380 ml 4

배양하고 같은 양의 을 첨가여 원심분리하고 농축하여 전개ethanol , , TLC(

용매 또는 를-CHCl3 : MeOH : H2O = 7.5:3:1(v/v)) HPLC geniposide,

등의 감소량을 측정함catalpol

우방자추출물 등을 이용한 효소활성 분석Arctiin, lignan glycosidase :⑤

우방자추출물 을 분변효소액0.5 mg/ml , 0.05 mM arctiin 0.1 ml, 0.02

인산완충액 을 넣어서 시간 배양하고 같은 양의ml 10 mM 380 ml 1

을 첨가여 원심분리하고 농축하여 전개용매ethanol , , TLC( -CHCl3 : MeOH

또는 를 이용하여 등의 감소량을 측: H2O = 7.5:3:1(v/v)) HPLC arctiin

정함

인삼추출물 등을 이용한 베타글루코Ginsenoside Rb1, ginsenoside Rg1,⑥

시다제 활성 분석 인삼추출물 인: 0.5 mg/ml , 0.05 mM ginsenoside Rb1,

또는 을 분변효소액 인산완충액ginsenoside Rg1 0.1 ml, 0.02 ml 10 mM

을 넣어서 시간 배양하고 같은 양의 을 첨가여 원심분리하380 ml 4 ethanol

고 농축하여 전개용매 또, , TLC( -CHCl3 : MeOH : H2O = 7.5:3:1(v/v))

는 를 이용하여 등의 감소량을 측정함HPLC ginsenoside Rb1, Rg1

대사활성 측정Bisacodyl, acetaminophen, digoxin : 0.05 mM bisacodyl,⑦

또는 을 분변효소액 을 넣고acetaminophen, digoxin 0.1 ml, 0.02 ml

를 넣어서 에서 시간 반응시키10mM phosphate buffer 0.38 ml 37±1 1℃

고 같은 양의 을 첨가하여 원심분리하고 농축하여 전개용매ethanol , TLC (

세부과제1-2 29292929////89898989


또는 를 사용하여 분리하-CHCl3 : MeOH : H2O = 7.5:3:1(v/v)) HPLC

여 대사체 또는 원화합물의 감소량을 측정하여 대사량을 계산함

의 대사체활성 분석 을Methyl paraben : 0.05 mM methylparaben 0.1 ml,⑧


에서 시간 반응시키고 같은 양의 을 첨가하여 원심분리하37±1 4 ethanol℃

고 농축하여 전개용매 또, TLC ( -CHCl3 : MeOH : H2O = 7.5:3:1(v/v))

는 를 사용하여 분리하여 대사체 또는 원화합물의 감소량을 측정하여HPLC

대사량을 계산함

및 를 이용한 시험및 를 이용한 시험및 를 이용한 시험및 를 이용한 시험(5) Fecalase intestinal bacterial enzyme mix Ames(5) Fecalase intestinal bacterial enzyme mix Ames(5) Fecalase intestinal bacterial enzyme mix Ames(5) Fecalase intestinal bacterial enzyme mix Ames

시험관 을 의 항온수조에서 분간 예열시키시고 를(5 ml) 45 10 top agar 2 ml℃

넣고 과 용액을 각각 씩, 0.5 mM L-histidine·HCl 0.5mM biotin 0.2 ml

넣어 미리 배양한, Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA102,

및 의 세균현탁액 와 시료 혼합액TA1535 TA1537 0.1 ml , S-9 0.5 ml

또는 와 또는 를 를 가하고/ fecalase ( fecal microbial mix) 0.5 ml top

가 고루 섞이도록 잘 흔들어 주었고 미리 만들어둔 한agar , Vogel-Bonner

천평판배지 위에 배양혼합액을 부어 넣고 고루 퍼지도록 함 접종된 평판배.

지는 에서 시간 배양한 후 집락 을 계수하였음37 48 (colony) .℃

제조 방법제조 방법제조 방법제조 방법(6) Intestinal bacterial enzyme mix(6) Intestinal bacterial enzyme mix(6) Intestinal bacterial enzyme mix(6) Intestinal bacterial enzyme mix

분리균주의 배양시간 분석①

멸균 에Gam broth 50ml PHS-BL-8, E-BL-8, K-BL-3, Y-BL-10,

를 에BH-GAM-9, JJ-BL-4, Hoon-BL-7, A44, JY6 GAM broth 3

에서 시간 시간 시간 시간별로 배양시켜 시간별로 배양된7 12 , 20 , 24 , 30 ,℃

세부과제1-2 30303030////89898989


배양액을 에서 로 분간 집균 후 배지를 제거한 균체는 무게4 8000×g 30℃

를 측정함 균체의 무게 배의 혐기성 희석액을 넣어 현탁액을 만들고. 10 ,

현탁액을 초음파처리 분씩 회 하여 에서 분간 원심분리하(1 8 ) 10000 x g 20

고 상등액을 모아 로 사용함crude enzyme .

PHS-BL-8 Megasphaera elsdenii

E-BL-8 Bacteroides vulgatus

K-BL-3 Bacteroides uniformis

Y-BL-10 Bifidobacterium bifidum

BH-GAM-9 Bifidobacterium bifidum

JJ-BL-4 Klebsiella pneumoniae

Hoon-BL-7 Bifidobacteriumadolescentis

A44 Eubacterium rectale

JY6 Parabacteroides distasonis

의 제조intestinal bacterial enzyme mix②

배양시간동안 가장 효소활성이 높았던 시간 와, Megasphaera elsdenii

는 시간 와Parabacteroides distasonis 12 , Klebsiella pneumoniae

는 시간 배양하고 배양액을 에서 로Eubacterium rectale 24 , 4 8000×g℃

분간 집균하고 균체의 무게 배의 혐기성 희석액을 넣어 현탁하여 초30 , 10

음파처리 분씩 회 하여 에서 분간 원심분리한 후 상등액(1 8 ) 10000 x g 20

을 모두 모아 평균활성과 비교하여 유의한 차이가 없으면fecalase , 0.22-

필터로 여과 멸균하여 로m cellulose intestinal bacterial enzyme mixμ

사용하였음.

저장조건에 따른 안정성 평가③

멸균한 를 에 씩 분intestinal bacterial enzyme mix eppendorf tube 2ml

주하여 에 저장하였고 분변효소액 과4 , -20 , -80 1.8ml glycerol℃ ℃ ℃

을 멸균된 에 넣어 을 만들어 에0.2ml eppendorf tube 10% glycerol -20℃

서 저장함 또한 의 효소액을 동결건조 후 에서 저장하였고 활. 2 ml -20℃

성 측정시 의 멸균 증류수를 섞어 효소액으로 사용함 각2 ml . 각의 저장된

분변효소액은 저장시간이 일 일이 지난 후 효소활성을 측정하여 제17 , 120

조시의 활성값과 비교하였음.

세부과제1-2 31313131////89898989


동물실험동물실험동물실험동물실험(7)(7)(7)(7)

경희대학교의 동물윤리규정에 따라 사육하고 윤리위원회의 심의를 거쳐 동물

실험을 진행하였음.



로 하였으며 각군간의 효소활성치 비교는 혹T-test , Wilcoxon-signed test

은 로 사후검정은 로 이하인 경우를ANOVA test , Duncan Test P value 0.05

유의성 있는 것으로 판단하였음.

연구개발 결과연구개발 결과연구개발 결과연구개발 결과4.4.4.4.

차년도 연구개발 결과차년도 연구개발 결과차년도 연구개발 결과차년도 연구개발 결과1) 11) 11) 11) 1

분변조제 방법분변조제 방법분변조제 방법분변조제 방법(1)(1)(1)(1)

분변조제 방법 의 방법에 따라 제조한 효소액의 베타글루코(I), (II), (III)

시다제 베타글루쿠로니다제 활성 알파람노시다제를 비교하였음 의 시, , . (III)

료는 분변의 색 이물 때문에 활성을 평가할 수 없었음, .

에서 제조한 초음파 처리한 현탁액과 이를 원심분리한 상등액의 활성은(I)

베타글루코시다제는 현탁액에 비해 베타글루코사다제는 였다 현55%, 32% .

탁액에 비해 상등액으로의 이행이 적은 것은 분변의 이물에 의한 균체의 효

세부과제1-2 32323232////89898989


소가 잘 추출되지 않은 것으로 판단됨.

의 방법으로 제조한 분변 원심분리 상등액 초음파처리한 균체액을 비(II) ,

교하면 침전으로 효소활성이 이상이였다 배 배 배 배로 분변80% . 2 , 3 , 4 , 5

을 희석하여 초음파처리하고 효소의 추출율을 조사하였음 그림 베타글( 1).

루코사다제는 배 희석하였을 때 배의 배였고 베타글루쿠로니다제는4 2 1.5 ,

배 알파람노시다제는 배로 배 희석하였을 때 효소활성의 추출율이1.6 , 1.6 4

가장 높았음.

균체의 효소활성이 초음파 처리 시간에 따른 효소액의 가용화를 측정하였

음 그림 상등액으로의 이행은 분과 분에서 가장 좋아 분간 실( 2). 10 15 10

시함.

개의 샘플에 대해 초음파처리하고 원심분리하여 원심분리전후의 활성을9 ,

비교하였음 그림 개의 효소활성을 초음파처리한 현탁액과 상등액을( 3). 10

비교하면 상등액으로의 이행이 평균 이상이였음 이 연구에서85% .

추출을 위한 방법으로는 분변을 배 현탁하고 원심분리하여 얻은fecalase 4

균체분획을 분의 초음파처리하여 얻은 것을 사용하였음10 .

그림 분변의 희석배수효과 상 베타글루코시다제 중 베타글루쿠로니다제1. ( , ; , ;

하 알파람노시다제, )

세부과제1-2 33333333////89898989


그림 초음파처리 시간에 따른 효소활성의 비교 베타글루쿠로니다제2. (Glc, ;

베타글루쿠로니다제 우레아제 설파타제 초음파시간 흰GluA. ; Ure, ; Sul, ) ( -

색 분 회색 분 검정색 분, 5 ; , 10 ; , 15 )

그림 초음파 처리하여 원심분리효과 검정색 원심분리전 흰색 원심분리후3. ( , ; , )

세부과제1-2 34343434////89898989


합성기질에 대한 의 분변효소활성 측정합성기질에 대한 의 분변효소활성 측정합성기질에 대한 의 분변효소활성 측정합성기질에 대한 의 분변효소활성 측정(2) 74(2) 74(2) 74(2) 74

인의 분변의80 -glucuronidase(1), -arabinopyranosidase (2),β α β

-galactopyranosidase(3), -xylopyranosidase(4), lipase(palmitase),β

5), lipase(stearatase), 6), -arabinopyranosidase(7),β β

-cellobiosidase(8), -fucopyranosidase(9),α β

-fucopyranosidase(10), -maltosidase(11), -rhamnosidase(12),β α

N-acetyl- -galactosamidase(13), N-acetyl-α β



-xylopyranosidase(18), -mannopyranosidase(19), Sulfatase(20),β

의 효소활성은 표와 같다-glucopyranosidase(21) .β

표 우리나라 사람의분변의 효소활성. (n=74)

세부과제1-2 35353535////89898989


그림 우리나라 사람의분변의 효소활성. (n=74)

인의 분변 평균 효소활성은 그림 과 같다 효소에 따라 상당한 차이를74 .

보였음.

그림 우리나라 사람의분변의 효소활성. (n=74)

천연물성분에 대한 분변의 효소활성천연물성분에 대한 분변의 효소활성천연물성분에 대한 분변의 효소활성천연물성분에 대한 분변의 효소활성(3)(3)(3)(3)

Amygdalin, arctiin, bicalin, catalpol, geniposide, ginsenoside Rb1,

에 대한 인의 평균효소활성은glycyrrhizin, hesperidin, puerarin, rutin 74

표와 같음.

세부과제1-2 36363636////89898989


표 우리나라 사람의 장내세균총에 의한 천연성분의 대사활성 (n=74)

천연물 분리 성분의 대사가 개인에 따라 상당한 차이를 보였음.

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

amygdalin arctiin baicalin catalpol geniposide ginsenoside Rb1 glycyrrhizin hesperidin puerarin rutin

Metabolic activity (pmol/min/mg)

세부과제1-2 37373737////89898989


약물로 사용되는 의 대사 활성 분석약물로 사용되는 의 대사 활성 분석약물로 사용되는 의 대사 활성 분석약물로 사용되는 의 대사 활성 분석(4) acetaminophen, bisacodyl, digoxin(4) acetaminophen, bisacodyl, digoxin(4) acetaminophen, bisacodyl, digoxin(4) acetaminophen, bisacodyl, digoxin

현재 약물로 사용되는 도 장내세균에acetaminophen, bisacodyl, digoxin

의해 대사됨을 관찰 할 수 있으며 이 약물들의 대사활성도 개인에 따라 상,

당한 차이를 보였음.

표 우리나라 사람의 장내세균총에 의한 약물 대사활성 (n=74)

세부과제1-2 38383838////89898989


0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

acetaminophen digoxin bisacodyl

Metabolic activtiy

(pmol/min/mg)

방부제 또는 염색시약으로 사용되는 의방부제 또는 염색시약으로 사용되는 의방부제 또는 염색시약으로 사용되는 의방부제 또는 염색시약으로 사용되는 의(5) amaranth, sudan I, sudan II, sudan IV(5) amaranth, sudan I, sudan II, sudan IV(5) amaranth, sudan I, sudan II, sudan IV(5) amaranth, sudan I, sudan II, sudan IV

대사활성대사활성대사활성대사활성

현재 방부제 또는 염색시약으로 사용되는 성분도 장내세균에 의해 대사되었으

며 그 대사활성은 높았음, .

개인간에도 상당한 차이를 보였음.

세부과제1-2 39393939////89898989


표 우리나라 사람의 방부제 및 염색시약의 장내세균총 의한 대사활성 (n=74)

세부과제1-2 40404040////89898989


일본인과의 분변효소활성 비교일본인과의 분변효소활성 비교일본인과의 분변효소활성 비교일본인과의 분변효소활성 비교(6)(6)(6)(6)

미국인과 한국인의 분변중의 효소활성을 비교하였다 아래 그림( ). Sulfatase

는 유의한 차이가 없었으나 베타글루코시다제 베타글루쿠로니다제는 유의, ,

한 차이를 보였으며 특히 와 는 우리나라 사람에게는, acidic neutral urease

거의 없었으나 일본의 경우에는 상당히 높은 활성을 보였음, .

한국인 흰색 과 일본인 검정색 의 분변 효소활성 비교( ) ( )

미국인과의 분변 효소활성 비교미국인과의 분변 효소활성 비교미국인과의 분변 효소활성 비교미국인과의 분변 효소활성 비교(7)(7)(7)(7)

미국인과 한국인의 분변중의 효소활성을 비교하였다 아래 그림 베타갈락( ).

토시다제와 베타자일라제는 비슷한 효소활성을 보였으나 글루코시다제 글, ,

루쿠로니다제 알파글루코시자다제 알파퓨코시다제의 활성은 상당한 차이를, ,

보였음.

세부과제1-2 41414141////89898989


한국인 흰색 과 미국인 검정색 의 분변 효소활상 비교( ) ( )

의 제조 및 이를 이용한 돌연변이활성 측정의 제조 및 이를 이용한 돌연변이활성 측정의 제조 및 이를 이용한 돌연변이활성 측정의 제조 및 이를 이용한 돌연변이활성 측정(8) Fecalase(8) Fecalase(8) Fecalase(8) Fecalase

분변조제방법 의 방법에 따라 제조한 를(II) fecalase Sephacryl S-300

를 실시하여 인의 를 제조하였음column chromatography 45 fecalase .

분변조제방법 에 의해 제조 효소의(II) fecalase Sephacryl S-300 column

세부과제1-2 42424242////89898989


패턴 베타글루쿠로니다제 베타글루쿠로니다제chromatography . Gc. ; Gu, ;

알파람노시다제활성 설파다제활성 대표적인Rs, ; St, . ( Specimen No. 25)

치자의 대표적인 성분인 와 그 장내세균대사체 의치자의 대표적인 성분인 와 그 장내세균대사체 의치자의 대표적인 성분인 와 그 장내세균대사체 의치자의 대표적인 성분인 와 그 장내세균대사체 의(9) geniposide genipin(9) geniposide genipin(9) geniposide genipin(9) geniposide genipin

돌변변이원성돌변변이원성돌변변이원성돌변변이원성

과 을 이용하여 시험법으로 돌연변이S. typhimurium TA98 TA100 Ames

성을 측정하였다 는 의 유무와 관련없이 복귀돌연변이. Geniposide S9 mix

수의 변화가 없었음.

그러나 은 에서 의 유무와 관계없이, genipin S. typhimurium TA98 S9 mix

복귀돌연변이원수의 변화가 없었음 그러나 에서. , S. typhimurium TA100

가 없을 때 복귀돌연변이원수가 증가하였으나 가 있을 때는S9 mix , S9 mix

복귀돌연변원이수의 변화가 없었음.

표 및 그 대사체인 의 돌연변이원성에 처리 효과Geniposide genipin S9 mix

Dose

(mM)S9 mix

No of revertant

S. typhimurium TA98 S. typhimurium TA100

Geniposide 0 - 15 139

0.12 - 30 94

0.24 - 26 107

0 + 17 126

0.12 + 22 92

0.24 + 28 88

Genipin 0 - 13 129

0.12 - 28 -

0.24 - 24 -

0 + 26 129

0.12 + 25 99

0.24 + 24 134

세부과제1-2 43434343////89898989


화장품원료 등으로 사용하는 과 그 장내세균대사체 의화장품원료 등으로 사용하는 과 그 장내세균대사체 의화장품원료 등으로 사용하는 과 그 장내세균대사체 의화장품원료 등으로 사용하는 과 그 장내세균대사체 의(10) arbutin hydroquinone(10) arbutin hydroquinone(10) arbutin hydroquinone(10) arbutin hydroquinone



성을 측정하였음 은 의 유무와 관련없이 복귀돌연변이원이. Arbutin S9 mix

수의 변화가 없었음 그러나 은 에서. , hydroquinone S. typhimurium TA98

의 이 있을 때 약간 증가하였으나 가 없을 때는 복귀돌연변S9 mix S9 mix

이원이수의 변화가 없었음 그러나 에서. , S. typhimurium TA100 S9 mix

가 없을 때 복귀돌연변이원이수의 변화가 없었으나 가 있을 때는, S9 mix

복귀돌연변원이 수가 유의적으로 증가하였음.

표 및 그 대사체인 의 돌연변이원성에 처리Arbutin hydroquinone S9 mix

효과

Dose

(mM)S9 mix

No of revertant

S. typhimurium TA98S. typhimurium

TA100

Arbutin 0 - 28 85

0.12 - 18 133

0.24 - 24 126

0 - 21 150

0.12 + 15 116

0.24 + 19 137

Hydroquinone 0 - 17 126

0.12 - 33 149

0.24 - 36 164

0 + 18 123

0.12 + 57 280

0.24 + 45 299

세부과제1-2 44444444////89898989


천연물 및 한약에 널리 함유하고 있는 과 그 장내세균대사체 의천연물 및 한약에 널리 함유하고 있는 과 그 장내세균대사체 의천연물 및 한약에 널리 함유하고 있는 과 그 장내세균대사체 의천연물 및 한약에 널리 함유하고 있는 과 그 장내세균대사체 의(11) rutin quercetin(11) rutin quercetin(11) rutin quercetin(11) rutin quercetin



성을 측정하였다 은 의 유무와 관련없이 복귀돌연변이원이수. Rutin S9 mix

의 변화가 없었음.

그 장내세균대사체인 은 와 에서quercetin S. typhimurium TA98 TA100

의 이 있을 때 유의적으로 복귀돌연변이원이수의 변화가 없었나S9 mix S9

가 없을 때는 복귀돌연변이수의 변화가 없었음 을 분변으로부터mix . Rutin

분리한 와 을 함께 처리하였을 때는 을 투여한 경fecalase S9 mix quercetin

우와 같이 유의적으로 에서 복귀돌연변이원이수가S. typhimurium TA98

유의적으로 증가하였음.

표 및 의 돌연변이원성에 분변의 및 처리Rutin quercetin fecalase S9 mix

효과

세부과제1-2 45454545////89898989


차년도 연구개발 결과차년도 연구개발 결과차년도 연구개발 결과차년도 연구개발 결과2) 22) 22) 22) 2

합성기질에 대한 인의 분변효소활성 측정합성기질에 대한 인의 분변효소활성 측정합성기질에 대한 인의 분변효소활성 측정합성기질에 대한 인의 분변효소활성 측정(1) 100(1) 100(1) 100(1) 100




-cellobiosidase(8), -fucopyranosidase(9),α β

-fucopyranosidase(10), -maltosidase(11), -rhamnosidase(12),β α

N-acetyl- -galactosamidase(13), N-acetyl-α β



-xylopyranosidase(18), -mannopyranosidase(19), Sulfatase(20),β

의 효소활성은 과 같음 인의 분변 평-glucopyranosidase(21) Fig1. . 100β

균 효소활성은 개개인 사이에 상당한 차이를 보였음.

Fig. 1. Fecal enzyme activities of Koreans (n = 100)

세부과제1-2 46464646////89898989


그러나 남녀간 및 나이에 따른 차이를 보이지는 않았음, (Fig, 2).

Fig. 2. The difference of fecal bacterial enzyme activities between males

and females. (male; female).

및 의 분변의 장내세균 효소 분획에 의한및 의 분변의 장내세균 효소 분획에 의한및 의 분변의 장내세균 효소 분획에 의한및 의 분변의 장내세균 효소 분획에 의한(2) Acetaminophen, digoxin bisacodyl(2) Acetaminophen, digoxin bisacodyl(2) Acetaminophen, digoxin bisacodyl(2) Acetaminophen, digoxin bisacodyl

대사활성대사활성대사활성대사활성

및 도 장내세균효소에 의해 대사되었음Acetaminophen, digoxin bisacodyl .

Fig. 3. Average metabolic activity of acetaminophen and digoxin by

human fecal enzyme mix fraction. (n=100)

세부과제1-2 47474747////89898989


이 및 도 개개인간 에는 상당한 차이를 보acetaminophen digoxin (Fig. 5)

였지만 남녀간 에 따, (Fig. 6) 른 차이는 보이지 않았음 그러나 의 경. , bisacodyl

우에는 개인차이가 적었으며 남녀간에도 차이가 없었음, .

Fig. 4. The difference of fecal bacterial enzyme activities metabolizing

acetaminophen and digoxin between individuals (male, 54; female, 46).


acetaminophen and digoxin between males and females. (male, 54;

female, 46).

세부과제1-2 48484848////89898989


천연물 한약포함 함유 주요성분의 분변의 장내세균 효소 분획에 의한 대사활성천연물 한약포함 함유 주요성분의 분변의 장내세균 효소 분획에 의한 대사활성천연물 한약포함 함유 주요성분의 분변의 장내세균 효소 분획에 의한 대사활성천연물 한약포함 함유 주요성분의 분변의 장내세균 효소 분획에 의한 대사활성(3) ( )(3) ( )(3) ( )(3) ( )

천연 성분의 대사활성은 각 성분에 따라 상당한 차이를 보였으며 (Fig. 6),

사람에 따라서도 상당한 차이를 보였음 (Fig. 7).

Fig. 6. Average metabolic activity of herbal medicine constituents by

human fecal enzyme mix fraction. (n=100)

Fig. 7. Metabolic activity of herbal medicine constituents by human

fecal enzyme mix fraction.

이 천연성분들의 장내세균효소에 의한 대사활성도 남녀간에 따른 차이는 보이

지않았음 (Fig. 8).

세부과제1-2 49494949////89898989



herbal medicine constituents between males and females. (male, 54;

female,46).

를 이용한 돌연변이활성 측정를 이용한 돌연변이활성 측정를 이용한 돌연변이활성 측정를 이용한 돌연변이활성 측정(4) Fecalase(4) Fecalase(4) Fecalase(4) Fecalase

천연물 및 한약에 널리 함유하고 있는 과 그 장내세균대사체rutin

의 돌변변이원성을 측정하였음 그 장내세균대사체인 은quercetin . quercetin

와 에서 의 이 있을 때 유의적으로S. typhimurium TA98 TA100 S9 mix

복귀돌연변이원이수의 변화가 없었나 가 없을 때는 복귀돌연변이수S9 mix

의 변화가 없었음.

을 분변으로부터 분리한 와 을 함께 처리하였을 때는Rutin fecalase S9 mix

을 투여한 경우와 같이 유의적으로 에서quercetin S. typhimurium TA98

복귀돌연변이원이수가 유의적으로 증가하였음.

세부과제1-2 50505050////89898989


표 및 의 돌연변이원성에 분변의 및1. Rutin quercetin fecalase S9 mix

처리 효과

Dose

(mM)S9 mix Fecalase

No of revertant

S. typhimurium TA98 S. typhimurium TA100

Rutin 0 - - 13 141

0 + + 22 117

0.15 + - 81 117

0.15 + + 199 163

Rutin 0 + + 24 -

0.03 + + 45 -

0.06 + + 96 -

0.12 + + 121 -

0.24 + + 193 -

Quercetin 0 - - 28 85

0.12 + - 457 186

0.24 + - 554 250

인삼 분리 성분 과 인삼엑스의 의 장내세균인삼 분리 성분 과 인삼엑스의 의 장내세균인삼 분리 성분 과 인삼엑스의 의 장내세균인삼 분리 성분 과 인삼엑스의 의 장내세균(5) ginsenoside Rb1 ginsenoside Rb1(5) ginsenoside Rb1 ginsenoside Rb1(5) ginsenoside Rb1 ginsenoside Rb1(5) ginsenoside Rb1 ginsenoside Rb1

효소에 의한 대사 활성 비교효소에 의한 대사 활성 비교효소에 의한 대사 활성 비교효소에 의한 대사 활성 비교

인삼함유성분인 에 대한 인의 분변효소의 대사활성은ginsenoside Rb1 100

개개인 사이에 상당한 차이를 보였음 그러나 여성과 남성사이의 차(Fig. 9). ,

이는 보이지 않았다 인삼 분리한 성분에 대한 대사활성이 인삼엑스중의.

대사활성보다 높았음 이는 인삼엑스중의 다양한 사포닌 배ginsenoside Rb1 .

당체들이 경쟁적으로 대사가 진행되기 때문으로 판단됨.

세부과제1-2 51515151////89898989


Fig. 9. Metabolic activity of ginsenoside Rb1 isolated from ginseng

(left) and in ginseng extract (right) by Korean fecal enzyme mix.

사람의 장내세균 효소의 황금분리성분 과 황금엑스 중의 의사람의 장내세균 효소의 황금분리성분 과 황금엑스 중의 의사람의 장내세균 효소의 황금분리성분 과 황금엑스 중의 의사람의 장내세균 효소의 황금분리성분 과 황금엑스 중의 의(6) baicalin baicalin(6) baicalin baicalin(6) baicalin baicalin(6) baicalin baicalin

대사활성의 비교대사활성의 비교대사활성의 비교대사활성의 비교

인삼에서와 같이 분리성분이 엑스에 함유 성분에 비해 대사활성이 높았음

이 역시 황금중의 플라보노이드 배당체들이 장내세균 효소에 의해(Fig. 10).

경쟁적으로 대사되기 때문으로 판단됨 그러나 여성과 남성간 세대 나이 간. , , ( )

차이는 보이지 않았음.

Fig. 10. Metabolic activity of baicalin isolated from Scutellariae Radix

세부과제1-2 52525252////89898989


(black circle) and in Scutellariae radix extract (yellow triangle) by

Korean fecal enzyme mix. Data of left and right columns are the

metabolic activities of male and female in each age.

황금 함유성분 의 장내세균에 의한 대사과정황금 함유성분 의 장내세균에 의한 대사과정황금 함유성분 의 장내세균에 의한 대사과정황금 함유성분 의 장내세균에 의한 대사과정(7) baicalin(7) baicalin(7) baicalin(7) baicalin

을 장내세균총과 염기적 조건에서 대사를 시켰을 때 대사체로Baicalin

과 가 확인 분리 동정되었음 의 대사활성은 남성baicalein oroxylin A , . baicalin

과 여성간 세대간 차이를 보이지않았으나 개인간에는 상당한 차이를 보였음, ,

의 대사체인 및 의 생성량도 상당한(Fig. 12). Baicalin baicalein oroxylin A

차이를 보였음 또한 의 대사활성에 비해서는 및. , baicalin baicalein oroxylin

의 생성량이 적었다 이는 이 대사체들이 더 대사된 류로의 대A . phenolic acid

사가 이루어진 때문으로 판단됨.

Fig. 11.Fig. 11.Fig. 11.Fig. 11. Metabolism of baicalin by human fecal microflora. Identification

of baicalin isolated (a) and baicalin metabolites with LC-MS/MS; (i)

baicalin, (ii) baicalein, and (iii) oroxylin A.

세부과제1-2 53535353////89898989


Fig. 12. Metabolic activity of baicalin (closed circle) by Korean fecal

enzyme mix. The metabolites, produced from baicalin were baicalein

(open square) and oroxylin A (closed triangle). Data of left and right

columns are the metabolic activities of male and female in each age.

은 장내세균총에 의해 을 경유해서 로 대사되며Baicalin baicalein oroxylin A ,

더 나아가는 등으로 대사될 것으로 추정된다 주요 대사체로는phenolic acid .

과 이였음baicalein oroxylin A .

O

HOHO

HOOC

OH O

OH O

O

HO

O

OH O

HO

HO

O

OH O

HO

H3CO

Baicalin Baicalein Oroxylin A

황금 함유성분 및 이들의 대사체의 약리효능 항소양 효과 비교황금 함유성분 및 이들의 대사체의 약리효능 항소양 효과 비교황금 함유성분 및 이들의 대사체의 약리효능 항소양 효과 비교황금 함유성분 및 이들의 대사체의 약리효능 항소양 효과 비교(8) baicalin ( )(8) baicalin ( )(8) baicalin ( )(8) baicalin ( )

의 약리활성에 장내세균총의 역할을 규명하기 위해 과 이의Baicalin baicalein

장내세균 대사체인 과 의 항소양효과를 조사하였음baicalein oroxylin A (Fig.

세부과제1-2 54545454////89898989


또는 으로 유도한 소양모델 동물에서13). Histamine compound 48/80

의 항소양효과는 이의 대사체인 및 에 비해 낮았baicalin baicalin oroxylin A

으며 대사체 중에서는 가 가장 우수했음 그리고 은 투여, oroxylin A . , baicalin

후 시간 후보다는 시간 후가 더 강한 항소양효과를 보였으나1 5 , baicalin,

는 양성대조약물로 사용한 처럼 시간 후보다는 시간oroxylin A azelastine 5 1

후가 더 강한 효과를 보였음.

Fig. 13. Inhibitory effects of orally administered baicalin, its

metabolites, and azelastine, on scratching behavior induced by

histamine or compound 48/80 in mice. The scratching behavior was

induced by histamine and compound 48/80 in ICR and BALB/c mice,

respectively. (up) Effect of baicalin, baicalein, oroxylin A and

azelastine in histamine-induced scratching behavior in ICR mice.

(down) Effect of baicalin, baicalein, oroxylin A and azelastine on

compound 48/80-induced scratching behavior in BALB/c mice. These

agents [10 (gray bar), 20 (white bar) and 50 mg/kg (black bar)]

세부과제1-2 55555555////89898989


were administered orally 1 or 5 h before the intradermal injection of

histamine or compound 48/80. The frequency of scratching behavior in

the normal group treated with saline alone for 1 h were 2 ± 1,

respectively, and the frequency of scratching behavior in the control

group treated with histamine in ICR mice and compound 48/80 in

BALB/c mice was 89 ± 5 and 168 ± 18, respectively. The values

indicate the mean ± S.D. (n=6). *Significantly different (p< 0.05).

그러나 복강으로 투여한 경우에는 의 효과는 경구투여에 비해 낮아졌, baicalin

으나 과 는 효과가 더 우수해졌으며 이 경우에도 가장, baicalein oroxylin A ,

우수한 효과를 보인 것은 였음oroxylin A (Fig. 14).

Fig. 14. Inhibitory effects of baicalin, its metabolites, and azelastine

administered intraperitonelly on histamine-induced scratching behavior

in mice. The scratching behavior was induced by histamine in ICR

mice. Mice were treated with or without intraperioneal administration

of the test agents [5 (gray bar), 10 (white bar) and 20 mg/kg (black

bar)] 1 or 5 h before the intradermal injection of 300 g/ml ofμ

histamine into the skin on the backs of mice. The frequency of

scratching behavior in the normal (treated with saline alone) and

control groups (treated with histamine) for 1 h was 2 ± 1 and 85 ±

4, respectively. The values indicate the mean ± S.D. (n=6).

*Significantly different (p< 0.05).

세부과제1-2 56565656////89898989


실험동물에 항생물질을 투여하여 소화관의 장내세균총을 일부 제거한 실험동

물에서 항소양효과를 조사하였음 및 이의 대사체들은 모(Fig. 15). Baicalin

두 경구투여하였음 은 항생물질을 투여한 실험동물에서 효능이 낮아. Baicalin

졌으나 과 는 효과가 더 강해지는 경향을 보였음, baicalein oroxylin A .

Fig. 15. Inhibitory effects of baicalin, baicalein, and azelastine

administered orally on histamine-induced scratching behavior in mice

treated with or without antibiotics. The scratching behavior was

induced by histamine in ICR mice treated with or without antibiotics.

The antibiotics were administered orally 1 day before histamine

treatment. Oral administration of test agents [10 (gray bar), 20 (white

bar), and/or 50 mg/kg (black bar)] was treated 1 h before the

intradermal injection of 300 g/50 l of histamine into the skin onμ μ

the backs of mice. The frequency of scratching behavior in the normal

group treated with saline alone in normal and antibiotics-treated mice

for 1 h were 2 ± 2 and 2 ± 1, respectively, and the frequency in

the control group treated with histamine in normal and

antibiotics-treated mice was 84 ± 4 and 87 ± 5, respectively. Ba,

baicalin; ABa, baicalin with antibiotics; Be, baicalein; ABe, baicalein

with antibiotics; Oa, oroxylin; AOa, oroxylin A with antibiotics; A,

azelasitine; AA azelastine with antibiotics. The values indicate the

mean ± S.D. (n=6). *Significantly different (p< 0.05).

세부과제1-2 57575757////89898989


혈관 투과성을 억제하는 효과도 보다는 이들의 대사체인 과baicalin baicalein

가 높았으며 가 가장 높은 효과를 보였음oroxylin A , oroxylin A (Fig. 15).

Normal Control Baicalin (50mg/kg) Baicalein (50mg/kg) Oroxylin A (50mg/kg) Azelastine (50mg/kg)

Fig. 16. Inhibitory effects of baicalin, its metabolites, and azelastine

administered orally on vascular permeability increased by histamine in

mice. (A) Effect in vascular permeability. The vascular permeability

was increased by histamine in ICR mice. Mice were treated with or

without the oral administration of test agents [10 (gray bar), 20

(white bar), and/or 50 mg/kg (black bar)] 1 h before the intradermal

injection of 300 mg/50 ml of histamine into the skin on the backs of

mice. In the vascular permeability assay, the amount of Evan blue

extravasated from the dorsal skin (1 x 1 cm) of the control group

stimulated with histamine and the vehicle-treated group was 12 ± 3

µg and 4 ± 2 µg, respectively. The values indicate the mean ± S.D.

(n=6). * P< 0.05 versus baicalin (50 mg/kg) treated group. (B)

Histologic photograph. The skin tissues were stained with hematoxylin

eosin and assessed by light microscopy.

세부과제1-2 58585858////89898989


항히스타만 효과도 보다는 이들의 대사체인 과baicalin baicalein oroxylin A

가 높았으며 가 가장 높은 효과를 보였음, oroxylin A (Fig. 17).

Fig. 17. Anti-histamine effect of baicalin, its metabolites, and

azelastine in Magnus test using guinea pig ileum. The ileal strip was

set in a 10 ml Magnus tube (32oC,95%O2+5%CO2) containing Tyrode

solution. Each test agent [0.1 mM (gray bar) and 0.4 mM (blackbar),

dissolved in 2% trition X-100] was added to the preparation 30 s

before treatment with histamine (1x10-6M).The values indicate mean

± S.D. (n=3). #P < 0.05 versus 0.1 mM baicalin treated group, * P<

0.05 versus 0.4 mM baicalin treated group.

세부과제1-2 59595959////89898989


더덕의 의 장내세균총에 의한 대사더덕의 의 장내세균총에 의한 대사더덕의 의 장내세균총에 의한 대사더덕의 의 장내세균총에 의한 대사(9) Lancemaside A(9) Lancemaside A(9) Lancemaside A(9) Lancemaside A

더덕의 을 생쥐에 경구투여하여 혈액중으로 이행되는 성분을lancemaside A

조사하였음 더덕의 원 함유 성분인 는 흡수되지않(Fig. 18). lancemaside A

고 이의 대사체인 만이 흡수되었음, echninocystic acid .

Fig. 18. Mean plasma concentration time profile of lancemaside A and

its metabolites in mice after oral administration of lancemaside A (60

mg/kg). Lancemaside A, lancemaside X and EAG were not detected,

but echinocystic acid (closed square) was detected. (each point

represents mean±S.D., n = 4). Structures of lancemaside A (A) and

its metabolites, lancemaside X (B), echinocystic acid 3-O-β

-D-glucuronopyranoside (EAG, C) and echinocystic acid (D).

세부과제1-2 60606060////89898989


를 경구투여한 생쥐에서 혈액중에서 검출된lancemaside A echinocystic acid

가 어떻게 어디에서 대사되었는지를 규명하기 위해 생쥐에 를lancemaside A

경구투여하고 경시적으로 생쥐의 소화관에서의 대사체를 조사하였음 (Fig.

위에서는 대사체를 확인 할 수 없었으나 소장 맹장 및 대장에서는19). , ,

등이 검출되었음lancemaside X, echinocystic acid .

Fig. 19. ESI-MA analysis of lancemaside A and its metabolites in the

digestive tract contents of mice orally administered lancemaside A.

Three main peaks were detected: The ion peak at m/z 1189 is

lancemasideA, another ion peak at m/z 1014 is lancemaside X, the

other ion peak at m/z 471 is echinocysticacid (5 h after oral

administration of lancemaside A; A, stomach contents; B, small

intestine contents; C, cecumcontents; D, colon contents).

세부과제1-2 61616161////89898989


사람의 분변을 이용한 의 대사체 및 그 대사과정을 조사한 결lancemaside A

과도 비슷한 결과를 보였음 (Fig. 20).

Fig. 20. Metabolism of lancemaside A by human fecal suspension. (A)

LC-MS/MS chromatogram of the reaction mixture incubated with

human fecal microflora (before incubation, 1 h after incubation and 3 h

after incubation). The reaction mixture was extracted with butanol and

analyzed by LC-MS/MS. (B) The mass spectra of lancemaside A and

its main metabolites.

의 대사과정은 와 같이 를 거쳐Lancemaside A Fig. lancemaside X

로 진행될 것으로 추정됨echinocystic acid .

세부과제1-2 62626262////89898989


차년도 연구결과차년도 연구결과차년도 연구결과차년도 연구결과3) 33) 33) 33) 3

합성기질에 대한 분변효소활성 측정합성기질에 대한 분변효소활성 측정합성기질에 대한 분변효소활성 측정합성기질에 대한 분변효소활성 측정(1)(1)(1)(1)




-cellobiosidase(8), -fucopyranosidase(9), -fucopyranosidase(10),α β

-maltosidase(11), -rhamnosidase(12), N-acetyl-β α α

-galactosamidase(13), N-acetyl- -galactosamidase(14), N-acetylβ β

-glucosamidase(15), -arabinfuranosidase(16),α α

-galactopyranosidase(17), -xylopyranosidase(18),α β

의-mannopyranosidase(19), Sulfatase(20), -glucopyranosidase(21)β

효소활성은 과 같음 인의 분변 평균 효소활성은 개개인 사이에 상Fig. 1. . 135

당한 차이를 보였다 년도의 인을 추가하여도 비슷한 결과를 보였음. 2010 12 .

세부과제1-2 63636363////89898989


Fig. 1. Fecal enzyme activities of Koreans (n = 148: 136 (2011) +

12 (2010)

세부과제1-2 64646464////89898989


그러나 성별과 나이에 따른 차이는 보이지는 않았음, (Fig, 2).

세부과제1-2 65656565////89898989


Fig. 2. The difference of fecal bacterial enzyme activities between

males and females (n = 148: 136 (2011) + 12 (2010).

세부과제1-2 66666666////89898989


세부과제1-2 67676767////89898989


천연약물 한약포함 함유 주요성분천연약물 한약포함 함유 주요성분천연약물 한약포함 함유 주요성분천연약물 한약포함 함유 주요성분(2) Acetaminophen, digoxin, bisacodyl, ( )(2) Acetaminophen, digoxin, bisacodyl, ( )(2) Acetaminophen, digoxin, bisacodyl, ( )(2) Acetaminophen, digoxin, bisacodyl, ( )

amygdalin, arctiin, aucubin, geniposide, ginsenoside Rb1, Rg1, mangiferin,amygdalin, arctiin, aucubin, geniposide, ginsenoside Rb1, Rg1, mangiferin,amygdalin, arctiin, aucubin, geniposide, ginsenoside Rb1, Rg1, mangiferin,amygdalin, arctiin, aucubin, geniposide, ginsenoside Rb1, Rg1, mangiferin,

방부제 의 분변의 장내세균 효소방부제 의 분변의 장내세균 효소방부제 의 분변의 장내세균 효소방부제 의 분변의 장내세균 효소puerarin, ponicirin, hesperidin, methyl parabenpuerarin, ponicirin, hesperidin, methyl parabenpuerarin, ponicirin, hesperidin, methyl parabenpuerarin, ponicirin, hesperidin, methyl paraben

분획에 의한 대사활성분획에 의한 대사활성분획에 의한 대사활성분획에 의한 대사활성

천연 성분의 대사활성은 각 성분에 따라 상당한 차이를 보였으며 사람에,

따라서도 상당한 차이를 보였음

도 장내세균효소에Acetaminophen, digoxin, bisacodyl, methyl paraben

의해 대사되었으며 개인간의 상당한 차이를 보였음, .

Fig. 3. Average metabolic activity of acetaminophen, bisacodyl, digoxin,

methylparaben and natural product constituents by human fecal enzyme

mix fraction (n = 148: 136 (2011) + 12 (2010)).

및 천연약물성분도acetaminophen, digoxin, bisacodyl, methyl paraben

개개인간에는 상당한 차이를 보였지만 성별 및 나이에 따, 른 차이는 보이지

않았음.

세부과제1-2 68686868////89898989


세부과제1-2 69696969////89898989


세부과제1-2 70707070////89898989


Fig. 4. The difference of fecal metabolic activities of acetaminophen,

bisacodyl, digoxin, methylparaben and natural product constituents

between males and females (n = 148: 136 (2011) + 12 (2010).

장내미생물효소활성의 식이에 의한 영향장내미생물효소활성의 식이에 의한 영향장내미생물효소활성의 식이에 의한 영향장내미생물효소활성의 식이에 의한 영향(3)(3)(3)(3)

생쥐에게 또는 함유식이를 주간 투여하여 소화관 미생물의 효10% fat 60% 4

소활성을 측정한 결과 함유식이에 의해 섬유소분해효소활성이 약, fat 60%

정도 낮아졌음50% .

Fig. 5. Effect of fat diet on fecal bacterial enzyme activities in mice.

세부과제1-2 71717171////89898989


인삼 분리 성분 과 의 장내세균 대사활성과 합성기질에인삼 분리 성분 과 의 장내세균 대사활성과 합성기질에인삼 분리 성분 과 의 장내세균 대사활성과 합성기질에인삼 분리 성분 과 의 장내세균 대사활성과 합성기질에(4) ginsenoside Rb1 Rg1(4) ginsenoside Rb1 Rg1(4) ginsenoside Rb1 Rg1(4) ginsenoside Rb1 Rg1

대한 대사활성의 비교대한 대사활성의 비교대한 대사활성의 비교대한 대사활성의 비교

베타글루코시다제의 합성기질인 p-nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside,

인삼함유성분인 및 에 대한 인의 분변효소의 대사ginsenoside Rb1 Rg1 100

활성은 개개인 사이에 상당한 차이를 보였음 인삼성분(Fig. 6). ginsenoside

및 의 대사 효소들은 상관성이 아주 높았음 그러나 합성기질에 대한Rb1 Rg1 . ,

효소활성이 훨씬 높았으며 일부의 효소가 인삼성분인 과, ginsenoside Rb1

의 대사반응에 관여하였음Rg1 .

Fig. 6. Fecal compound K-forming activities from ginsenoside Rb1

and ginseng extract of 100 Koreans.

Fig. 7. Metabolic activities of ginsenoside Rb1 and Rg1 by the feces

of 100 Koreans.

세부과제1-2 72727272////89898989


(A) (B)

(C) (D)

Fig. 8. Profile of the relationship between fecal enzyme activities. (A)

Between ginsenoside Rb1-metabolic activity and -glucosidaseβ

activity. (B) Between ginsenoside Rg1-metabolic activity and β

-glucosidase activity. (C) Between metabolic activities of ginsenoside

Rb1 and Rg1. (D) Between compound K-forming activities of

ginsenoside Rb1 and ginseng extract.

인삼의 의 장내세균총에 의한 대사와 항대장염효과인삼의 의 장내세균총에 의한 대사와 항대장염효과인삼의 의 장내세균총에 의한 대사와 항대장염효과인삼의 의 장내세균총에 의한 대사와 항대장염효과(5) ginsenoside Rb1(5) ginsenoside Rb1(5) ginsenoside Rb1(5) ginsenoside Rb1

인삼의 주성분인 를 에 투여한 결과 맹장과 대장에서ginsenoside Rb1 mice

가 투여시간에 비례하여 검출되었다 그러나 항생제를 투여한 경compound K . ,

우에는 거의 검출되지않았음.

세부과제1-2 73737373////89898989


Fig. 9. HPLC analysis of biotransform of Ginsenoside Rb1. We

detected HPLC patterns at 1h, 3h and 6h after oral administered

ginsenoside Rb1 (Rb1, 60 mg/kg) with or without antibiotics

(streptomycin and neomycin, 100 mg/kg) in cecum and colon.

Ginsenoside Rb1 was biotransformed to compound K (CK) in mice

without administered antibiotics. However, in mice with administered

antibiotics, compound K was not detected.

대장염모델 생쥐에 및 그 대사체는 현재 대장염 치료제로ginsenoside Rb1,

사용하고 있는 보다 더 우수한 효과를 보였음sulfasalazine .

세부과제1-2 74747474////89898989


Fig. 10. Inhibitory effects of ginsenosides in TNBS-induced colitic

mice. Ginsenoside Rb1 (Rb1) and compound K (CK) (10 mg/kg or 20

mg/kg), sulfasalazine (SUL, 50 mg/kg), or saline was orally

administered for 3 days after TNBS treatment. Mice were sacrificed

12 h after the final administration of test agents. All values are means

± SDs (n = 7).

#p<0.05,significantlydifferentvs.normalcontrolgroup;*p<0.05,significantly

differentvs.TNBSgroup.

Fig 11. Effects of ginsenoside Rb1 and compound K on inflammatory

cytokines in TNBS-induced colitic mice.

Fig. 12. Inhibitory effects of ginsenoside Rb1 and compound K on the

productions of pro-inflammatory cytokines in LPS-induced peritoneal

macrophages. All data are expressed as means ± SDs (n = 4 in a

세부과제1-2 75757575////89898989


single experiment). #p<0.05, significantly different vs. normal control

group. *p<0.05, vs. LPS control.

Fig. 13. Effects of ginsenoside Rb1 and compound K on

phosphorylation of IKK- , activations of NF- B and IRAK-1, andβ κ

interaction between LPS and TLR-4.

Fig. 14 Inhibitory effects of ginsenoside Rb1 or compound K on

IRAK-1 kinase binding activity.

세부과제1-2 76767676////89898989


황금 함유성분 의 장내세균에 의한 대사과정황금 함유성분 의 장내세균에 의한 대사과정황금 함유성분 의 장내세균에 의한 대사과정황금 함유성분 의 장내세균에 의한 대사과정(6) baicalin(6) baicalin(6) baicalin(6) baicalin

을 장내세균총과 염기적 조건에서 대사를 시켰을 때 과Baicalin baicalein

로 대사체되었음 의 대사활성은 남성과 여성간oroxylin A (Fig. 15). Baicalin ,

세대간 차이를 보이지않았으나 개인간에는 상당한 차이를 보였음 분리성분인, .

의 대사활성이 황금추출물의 보다 배 정도 높은 활성을 보baicalin baicalin 10

였음.

(A) (B)

(C) (D)

Fig. 15. Baicalin-metabolic activities between individuals (closed

symbols, male; open symbols, females). (A) baicalin metabolizing

activity (B) Metabolite-producing activity from baicalin (square,

baicalein; triangle, oroxylin A) (C) Scutellariae root extract-contained

baicalin metabolizing activity (D) Metabolite-producing activity from

Scutellariae root extract-contained baicalin (square, baicalein; triangle,

oroxylin A)

세부과제1-2 77777777////89898989


황금 함유성분 및 이들의 대사체의 항염증효능 비교황금 함유성분 및 이들의 대사체의 항염증효능 비교황금 함유성분 및 이들의 대사체의 항염증효능 비교황금 함유성분 및 이들의 대사체의 항염증효능 비교(7) baicalin(7) baicalin(7) baicalin(7) baicalin

의 약리활성에 장내세균총의 역할을 규명하기 위해 과 이의Baicalin baicalein

장내세균 대사체인 과 의 항염증를 조사하였음baicalein oroxylin A (Fig. 16).

생쥐에 로 유도한 전신염증모델동물에서 경구투여한 은 우수한 항LPS baicalin

염증 효과를 보였으나 복강투여한 의 효과는 적었음 그러나 그 대사, baicalin . ,

체를 복강투여한 군에서는 강한 항염증효과를 보였음.

Fig. 16. Effect of baicalin and its metabolites baicalein and oroxylin A

on LPS-stimulated systemic inflammation in mice.

에 로 유도한 염증에 대한 저해효과는 복강에 투peritoneal macrophage LPS

여에 의한 항염증효과와 유사한 경향을 보였음.

Fig. 17. Effect of baicalin and its metabolites baicalein and oroxylin A

on LPS-stimulated systemic inflammation in mice.

세부과제1-2 78787878////89898989


항생제에 의한 장내미생물 효소활성에 미치는 효과항생제에 의한 장내미생물 효소활성에 미치는 효과항생제에 의한 장내미생물 효소활성에 미치는 효과항생제에 의한 장내미생물 효소활성에 미치는 효과(8)(8)(8)(8)

항생제[COE, cefadroxil (100 mg/kg)+oxytetracycline(300

mg/kg)+erythromycin (300 mg/kg); BNS, bacitracin(200

mg/kg)+neomycin(200 mg/kg)+streptomycin (200 mg/kg); ST,

streptomycin (150 mg/kg) +tetracycline (50 mg/kg); S, streptomycin

를 일간 투여하고 일간 휴약하면서 소화관 미생물 기인 효소(300 mg/kg)] 3 , 2

활성을 측정한 결과는 와 가 가장 강한 저해활성을 보였으며 그 중BNS COE ,

에서도 가 가장 강한 저해활성을 보였음 그러나 와 는 투여 초기에COE . , ST S

는 저해하였으나 일 후에는 정상동물과 유사한 효소활성을 보였음, 3 .

Fig. 18. Effect of orally administered antibiotics on the enzyme activity

of intestinal microflora in mice.

를 이용한 돌연변이활성 측정를 이용한 돌연변이활성 측정를 이용한 돌연변이활성 측정를 이용한 돌연변이활성 측정(9) Fecalase(9) Fecalase(9) Fecalase(9) Fecalase

장내세균총에 의해서 발생할 수 있는 돌변변이원성을 측정하기 위해 fecalase

를 제조하여 사용하였으나 이는 안정성이 낮고 제조하기가 쉽지않아 이를 대, , ,

신할 수 있는 를 제조하였음 차년도intestinal bacterial enzyme mix . 2 2-2

세부과제1-2 79797979////89898989


세부과제에서 선별한 균주들을 대상으로 효소의 생산성을 배양하면서 평가하

였음 와 는 시간에 그 외의 균주는 시간. P. distasonis K. pneumoniae 12 24

배양하는 것이 효소생성성이 높았음.

Fig. 19. The enzyme productivity of intestinal bacteria isolated from

Koreans.

위의 선별된 균주들을 로 혼합하여 제조한1:1:1:1 intestinal bacterial

의 효소활성을 비교한 결과 한국인 장내세균총 기인 효소활성과enzyme mix

유사한 활성을 보였음.

세부과제1-2 80808080////89898989


Fig. 20. Comparison between Korean average fecalase and intestinal

bacterial enzyme mix activities.

는 동결건조하여 에 보관하였을 때Intestianl bacterial enzyme mix -20oC

가장 안정하였다.

Fig. 21. Stability of intestinal bacterial emzyme mix.

와 를 이용하여 괴화추출물 및 그Fecalase intestinal bacterial enzyme mix

주성분인 의 돌연변이성성을 측정하였음 와rutin (Fig. 22 - 26). Fecalase

를 처리하였을 때 모두 돌연변이원성이 농도intestinal bacterial enzyme mix

의존적으로 증가하였으며 두 효소간에는 차이가 없었음, .

세부과제1-2 81818181////89898989


Fig. 22. Effect of Sophorae flos extract and its main constituent rutin

on S. typimurium TA98 reverse mutation assay. NC, negative control;

M, test agent alone; M+EM, agent + fecal microbial enzyme mix;

M+F, agent + fecalase; M+S9, agent + S9 mix; M+EM+S9, agent +

fecal microbial enzyme mix + S9 mix; M+F+S9, agent + fecalase +

S9 mix. The mutant frequency is expressed as the number of

revertant colonies. The mutant potential of the test is assumed if the

mutant frequency is 2-fold higher than negative control (expressed by

dot lines).

세부과제1-2 82828282////89898989



on S. typimurium TA100 reverse mutation assay.





세부과제1-2 83838383////89898989




세부과제1-2 84848484////89898989


연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론4.4.4.4.

식품 한약 의약품 등을 경구투여하면 이들의 함유성분은 체내로 흡수될 때o , ,

까지 장내세균총과 만나 대사반응을 받아 생물전환체 또는 대사체

를 생성하며 이 대사체들은 원화합물에비해 인체에 독성(biotransformant) ,

및 약효를 증가 또는 감소함

건강인의 장내세균은 입에서부터 직장에 이르기까지 종 존재하며 사o >500 ,

람의 세포수보다도 많은 1014 정도 서식하고 있으며 이중 이상CFU , 98%

이 혐기성세균이며, Bacteroidaceae, Eubacterium, Peptococcaceae,

Bifidobacterium 등으로 구성되어져있음

이 장내세균총들은 다양한 효소를 생산하여 소화관에 들어온 성분들을 생물o

전환시켜 극성이 높은 화합물일수록 체내로 흡수되기 전에 소화관내 체류,

시간이 길어 장내미생물총의 대사반응을 받기 쉬움

이 장내미생물들이 생산하는 식품 의약품 등의 대사에 관여하는 효소들은o ,

사람에 따라 유의한 차이가 있으나 성별 나이에는 큰 차이를 보이지않았음, ,

합성기질과 천연성분에 대한 한국인 소화관 미생물의 평균 대사활성은 아래o

와 같았음

효소합성기질에 대한 장내미생물의 대사활성[ (n=235)]

천연성분 의약품 색소제 방부제에 대한 장내미생물의 대사활성[ , , , (n=235)]

세부과제1-2 85858585////89898989


우리나라 사람의 장내미생물 당분해효소활성 및 암모니아 생성효소는 미국o

인 및 일본인과 차이를 보였음 당분해효소 중 유당을 분해하는 효소는 미국:

인이 가장 높았고 포도당 및 글루쿠론산을 분해하는 효소는 미국인 및 일본,

인보다도 높았으나 요소분해효소인 우레아제는 일논인이 가장 높았음,

한국인의 장내미생물총은 천연성분 의약품 색소제 보존제에 대한 생물전환o , , ,

활성을 갖고 있었으며 이 활성들 역시 개인간에 차이는 컸으나 성별 나이, , ,

에 따라서는 차이를 보이지않았음

생쥐에 다양한 항생제를 투여하면 장내미생물총의 천연물 대사활성 및 합성o

기질에 대한 효소활성이 강하게 억제되었으며 그중에서는 를 투여한, COE

경우 이상 억제되었으며 일간의 휴약기간에는 억제된 활성에 변화90% , 2-4

가 없었음

를 투여한 생쥐에 의 소양효과 의 소양효과o COE ginsenoside Re , baicalin ,

항염증효과를 측정한 결과 일반동물에 비해 현저히 효과가 낮았음 이는 장:

내세균총에 의해 대사되어 흡수되고 약효를 발휘하는 것으로 추정할 수 있

음

등의 의 대사체와 체내 흡수동태 연구결과에 의해서도 뒷받침: Akao baicalin

됨

한약 및 기능성식품으로 사용하고 있는 더덕의 주성분인 를o lancemaside A

이용하여 를 행한 결과 일반 약물들과는 달리pharmacokinetic study

가 약 시간이였으며 흡수된 화합물은 이 화합물의 장내미생물총의Tmax 6 ,

대사체인 였음echinocystic acid

이는 가 장내미생물총의 대사를 받아 흡수되며 또한 대사반: lancemaside A ,

응 진행함에는 시간이 필요함을 시사하고 있음

이의 대사체가 항염증효과가 우수하다고 등에 의해 발표함 이 역시: Joh -

배당체인 의 약효발현에는 소화관 미생물총이 필요함을 제안lancemaside A

하고 있음

세부과제1-2 86868686////89898989


인삼의 등은 장내미생물총의 대사를 받아o ginsenoside Rb1, Rb2, Rc

를 경유하여 로 대사되며 이러한 대사반응은ginsenoside F2 compound K ,

장내에 우세균인 속 속 속 균주Bacteroides , Fusobacterium , Provetella

등에 의해 촉매되며 인삼사포닌과 이 사포닌들의 장내세균 대사체들에 대해,

항대장염효과를 분석한 결과 에서는 큰차이를 보이지않았으나in vivo , in

에서는 큰 차이를 보였음 대사체가 강한 항염증효과를 보였음vitro :

식품 의약품 등의 극성성분들은 장내에 서식하고 있던 미생물들에 대사된o ,

대사체들이 체내로 흡수되어 약효를 발휘하는 것으로 밝혀짐 그러므로 인:

삼의 사포닌 성분을 약효성분으로 대사를 시킬 수 없는 사람들은 인삼사포

닌의 극성을 비극성 화합물로 전환시킬 수 없어 혈액 중으로 인삼사포닌의

흡수가 어렵게 되어 인삼의 효능을 기대하기가 쉽지 않음

식품 의약품 등이 장내미생물의 대사반응을 받을 가능성이 있는 경우에는o ,

사람의 소화관 대사반응을 대신할 수 있는 를 개발하였음 그러나fecalase : ,

이는 제조하기가 번거롭고 불안정함,

그러므로 사람의 소화관미생물총으로부터 다양한 효소활성을 갖는 미생물을: ,

선별하여 를 대신할 수 있는 를fecalase intestinal bacterial enzyme mix

제조함

이 의 효소활성은 와 유사하였으: intestinal bacterial enzyme mix fecalase

며 동결건조하여 보관한 결과 개월간 안정하였음, 4

이를 이용하여 과 괴화추출물의 유전독성시험인 를 실시한: rutin Ames test

결과 를 사용한 경우와 를 사용한fecalase intestinal bacterial enzyme mix

군간에 차이가 없었음

식품 의약품 등의 극성성분들의 장내미생물총의 대사반응을 받아 독성 또는o ,

약효를 발휘하므로 에서 약물의 효능 및 약효평가에는 또in vitro fecalase

는 처를 통한 평가가 필요함intestinal bacterial enzyme mix

세부과제1-2 87878787////89898989


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1-2세부과제

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