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1 Collegarsi al sito : http://www.uniprot.org/ e nella query inserire myoglobin horse
ESERCITAZIONE 1: calcolo della massa teorica e sperimentale di mioglobina equina
a) Calcolo massa teorica di mioglobina equina
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2. Copiare la sequenza escludendo il peptide segnale
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3. Aprire il programma Molecular Weight Calculator, nella barra tools aprire il sottoprogramma peptide sequence fragmentation modelling e inseire la sequenza nell’apposito spazio. Annotare i valori della massa media e monoisotopica della forma monoprotonata
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1. Aprire il programma Xcalibur e quindi il sottoprogramma Qual Browser
2. Aprire il file myoglobin e visualizzare lo spettro di massa
b) Calcolo massa sperimentale di mioglobina equina mediante deconvoluzione
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3. Cliccando con il tasto destro del mouse, selezionare clipboard e quindi export (exact mass)
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4. Aprire il programma magtrans, con il tasto destro cliccare su paste data. In tal modo compare lo spettro di massa con le cariche assegnate
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5. Andare su options, transform options e quindi impostare i parametri
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6. Annotare la massa della proteina nello spettro deconvoluto
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b) Calcolo massa sperimentale di mioglobina equina mediante analisi pattern isotopico
1. Magnificare lo spettro di massa fino a visualizzare il pattern isotopico di un segnale multicarica (es. il pattern a 999.95)
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2. Selezioanre il delta m/z di tue linee tra adiacenti e calcolare lo stato di carica [z=1/m/z)] (n.b. IMPORTANTE con il tasto destro selezionare display options quindi labels e digitare 5 cifre decimali
3. Calcolare la massa sulla base del rapporto m/z e dello stato di carica MW= [(m/z x z)-z]
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c) Calcolo massa sperimentale di mioglobina equina mediante sistema a due variabili
1. A partire dallo spettro di massa, identificare due ioni multicarica tra loro adiacenti (es. m/z1133.27 e 1214.15)
1133.27= (Mr+z1)/z1 (1.1)1214.15= [Mr+(z1-1)]/(z1-1) (1.2)
p1= valore m/z del picco p1p2= valore m/z del picco p2z1= carica del picco p1Mr= massa media della proteinaLe equazioni 1.1 e 1.2 possono essere risolte mediante un sistema a due incognite (Mr e z1).
2. La risoluzione del’equazione sovra riportata permette di calcolare il valore z1 e quindi la massa
3. Calcolare l’accuratezza a partire dalla massa teorica e sperimentale
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Risultati
Riportare i valori di massa teorica e sperimentale (quest’ultima determinata nei tre differenti modi) e quindi calcolare l’accuratezza per ogni valore di massa sperimentale in ppm applicando la seguente formula:
Accuratezza= [(massa teroica-massa sperimentale)/massa teroica]x1000000