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Eletroforese

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Eletroforese É um processo que consiste na separação dos componentes de um sistema através da aplicação de um campo elétrico. É usado para separar e analisar biomoléculas.

Princípio: Substâncias em solução que possuem carga elétrica livre,

deslocam-se quando submetidas a um campo elétrico de sentido invariável.

Para que uma partícula se mova é necessário que possua carga elétrica livre, isto é, excesso ou diferença de elétrons.

Portanto: - para o ânodo (+) dirigem-se os ânions- para o cátodo (-) dirigem-se os cátions

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EletroforeseE

N E

N

N

NE PE

ii

ii

ii i i

i

As moléculas são separadas umas das outras conforme o tamanho, a carga elétrica e a forma.

Separa-se partículas de mesma carga, porém com quantidades diferente de carga.

Tipos de eletroforese

- Livre

- Anticonvectante

- Carga da partícula

- Peso da partícula

- pH (solução tampão)

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Moléculas grandes migram lentamente, enquanto moléculas pequenas movem-se rapidamente.

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EletroforeseE

N E

N

N

NE PE

ii

ii

ii i i

i

Suportes:

Meio sólido: - Papel - Acetato de celulose

Meio semi-sólido: - Gel de amido - Gel de agarose - Gel de poliacrilamida

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A técnica é tão sensível, que pode ser usada eficientemente para

separar moléculas que diferem apenas muito sutilmente em suas cargas

e/ou massas.

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E

N E

N

N

NE PE

ii

ii

ii i i

i

2

2 22 2/

3 3 2 3A A A A

c mPV N mu N m N c N averagekinetic energy molecule

Eletroforese

Marcadores de peso molecular são usados para estimar o tamanho das moléculas das amostras.

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Eletroforese: a concentração do gel

A concentração do gel definirá o tamanho dos poros a serem atravessados pelas moléculas em migração.

Geis muito concentrados oferecerão maior resistência à migração das moléculas.

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Eletroforese: a concentração do gelE

N E

N

N

NE PE

ii

ii

ii i i

i

2

2 22 2/

3 3 2 3A A A A

c mPV N mu N m N c N averagekinetic energy molecule

O grau de cross-links pode ser controlado pela razão de bis-acrilamida (cross-linker) e acrilamida (que forma os polímeros lineares), determinando o tamanho dos poros do gel.

1 molécula de bis-acrilamida para cerca de 29 monômeros de acrilamida.

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•É um polissacarídeo; forma uma rede que segura as

moléculas durante a migração.

• Tipos de gel de eletroforese

• Gel de agarose

Preparo: pó de agarose e solução tampão (TBE).

Após fundir, coloca-se brometo de etídio, que fará o DNA ou RNA

"brilhar" quando exposto ao UV. Coloca-se o pente no gel. O pente

cria poços que serão utilizados para a aplicação das amostras.

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• Diferentes relações entre as concentrações dessa moléculas permitem a criação de diferentes gradientes de

separação.

• Tipos de eletroforese

Acrilamida e

Bisacrilamida.

A acrilamida é uma

molécula linear,

A bisacrilamida é

em forma de "T".

• Gel de poliacrilamida

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• Gel de poliacrilamida

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- Reduz o tempo de migração dos fragmentos de DNA substituindo a

lâmina de gel por centenas de pequenos capilares (100 micra de

diâmetro interno).

- Aplicação de campos elétricos mais elevados para fazer com que os

fragmentos se separem mais rapidamente.

- O uso de um sistema de detecção através de fluorescência confocal,

excitada por laser, torna possível a análise de mais de um capilar de cada

vez.

- Com a excitação e detecção confocal (uso de mesmos focos), em que

a profundidade de campo do sistema ótico é suficientemente pequena

para sondar apenas o interior de cada capilar, obtém-se alta

resolução e eficiência de detecção.

Eletroforese capilar

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• Gel de eletroforese capilar

Neste novo sistema, uma guarnição de capilares é colocada em um suporte e,

sob controle computadorizado, cada capilar vai sendo submetido à varredura

do feixe de laser. Os fragmentos de DNA, marcados com corantes de alta

fluorescência, emitem fluorescência, que é filtrada e detectada por um

fotomultiplicador

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EletroforeseE

N E

N

N

NE PE

ii

ii

ii i i

i

Fatores que interferem na migração de partículas

- Mobilidade

- Diâmetro

- Peso molecular

- Força iônica

- Viscosidade

- Endosmose

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Eletroforese: saída de forçaE

N E

N

N

NE PE

ii

ii

ii i i

i

2

2 22 2/

3 3 2 3A A A A

c mPV N mu N m N c N averagekinetic energy molecule

A saída de força pode ser de diversos tipos:

- Voltagem constante (mV)

- Corrente constante (ampéres)

- Força constante (watts)

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Eletroforese

Proteínas: - aminoácidos como eletrólitos

Proteínas séricas: - Albumina - Globulinas (α1, α2, β, δ)

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Eletroforese

LipoProteínas – unidade de transporte lipídico

Identificação de 4 faixas lipoproteicas

- Quilomicrons

- Lipoproteína Beta

- Lipoproteína Pré-beta

- Lipoproteína Alfa

- Ultracentrifugação

- Separação por eletroforese

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Eletroforese

Hemoglobina

- Hemoglobina S

- Hemoglobina C

- Talassemia Beta

- Hemoglobina anormais- Carga elétrica- Ponto isoelétrico

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Eletroforese

Hemoglobina S

- Indivíduos heterozigotos (AS) - Traço siclêmico - Geralmente assintomáticos

- Hemoglobinopatia estrutural* substituição do ácido glutâmico pela valina

- Indivíduos homozigotos (SS)- Anemia hemolítica congênita ( anemia falciforme)

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Eletroforese

Hemoglobina C

- Indivíduos heterozigotos (AC) - Raros sintomas clínicos

- Detecção para aconselhamento genético

- Hemoglobinopatia estrutural* substituição do ácido glutâmico pela lisina

- Indivíduos homozigotos (CC)- Indivíduos heterozigotos (SC)

- Anemia

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Eletroforese

Talassemia Beta

- Indivíduos heterozigotos - Podem ser: assintomáticos

anemia hipocrômica e microcítica anemia hemolítica leve/ moderada

- Depressão parcial ou total na síntese de cadeias beta da hemoglobina A

- Indivíduos homozigotos - Anemia hemolítica grave

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E

N E

N

N

NE PE

ii

ii

ii i i

i

2

2 22 2/

3 3 2 3A A A A

c mPV N mu N m N c N averagekinetic energy molecule

Eluição

Eletroforese: métodos de leitura

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Eletroforese: métodos de leitura

Densitometria

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OBRIGADA!!!