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Guía para la presentación de proyectos en el marco de la “Convocatoria general para la financiación de proyectos de Investigación, Innovac ión y Creación de la
Universidad de Caldas 2015”
Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados
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1. Información general
Título del proyecto1:
EVALUACIÓN DE INTRODUCCIONES DE TOMATE PRODUCIDO VIA MICROINJERTACION CONTRA
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Sacc.) SNYDER Y HANSEN.
Nombre de la convocatoria en la cual presenta el proyecto:
Nombre de los Grupos de Investigación: (registre la información de los grupos que participan)
Nombre del Grupo: Grupo de Investigación en Proyección y Producción Agropecuaria
(GIPPA).
Facultad/Instituto/Departamento: Ciencia Agropecuarias/Sistemas de Producción
Agropecuarias.
Clasificación
__B__
Tipo de proyecto de I&D: Investigación Básica2: Investigación Aplicable
3:
Aplicación en curso4: Creación: Innovación Tecnológica
5:
Tipo de innovación:
Innovación tecnológica de producto Innovación tecnológica de proceso
Innovación organizacional
Área Estrátegica del Plan de Desarrollo
Biotecnología Artes, Cultura y Humanidades Problemática Social
Salud
Ambiental
No corresponde a ninguna de las
áreas estratégicas
INTEGRANTES DEL EQUIPO DE INVESTIGACIÓN
(indicar el investigador responsable con un asterisco)
NOMBRE/TIPO DE VINCULACIÓN EN LA
UNIVERSIDAD DE CALDAS
DEPARTAMENTO o
PROGRAMA
ÁREA DE
CONOCIMIENTO
(según COLCIENCIAS)
Nelson Ceballos Aguirre Director
Producción Agropecuaria
Agronomía, Veterinaria
y afines
1 Se recomienda que no exceda 15 palabras
2 Son estudios que tienen como propósito el trabajo experimental o teórico realizado principalmente con el objeto de
generar nuevos conocimientos sobre los fundamentos de fenómenos y hechos observables, sin prever ninguna
aplicación específica inmediata 3 Son proyectos de investigación original realizada para la adquisición de nuevos conocimientos, contextualizada
dentro de fines con potencialidad de ofrecer alguna contribución práctica 4 Son proyectos de investigación original, dirigida principalmente y de manera inminente hacia un fin u objetivo
práctico, determinado y específico 5 Se refiere a aquellos proyectos que tienen como objetivo el desarrollo de nuevos productos o procesos, así como las
modificaciones tecnológicas importantes en productos o procesos
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Universidad de Caldas
Jairo Castaño Zapata Asesor evaluador
Producción Agropecuaria
Universidad de Caldas
Agronomía, Veterinaria
y afines
Lucía Atehortúa Garcés Asesora evaluadora
Biotecnología
Universidad de Antioquia
Ciencias Naturales y
afines
ESTUDIANTES DE POSTGRADO PROGRAMA
ÁREA DE
CONOCIMIENTO
(según COLCIENCIAS)
Dora Janeth García Doctorado en Ciencias Agrarias Ciencias Naturales y
afines
Lugar de Ejecución del Proyecto: (Municipio/Departamento)
Ciudad: Manizales Departamento: Caldas
Presupuesto. Valor total del proyecto: 645.170.017 (ver Anexo 1)
Duración total (meses): 36 meses
2. Resumen ejecutivo
El tomate, Solanum lycopersicum L. es una planta dicotiledónea perteneciente a la
familia de las solanáceas, nativa de Suramérica; se cultiva en más de 100 países dentro
de los que se destacan China, Estados Unidos, India, Turquía, y Egipto. En el año
2014 el tomate alcanzó una producción mundial de 145.751.507 toneladas de fruto,
convirtiéndose en una de las hortalizas con más demanda a nivel mundial (FAOSTAT,
2015). En Colombia los departamentos de Boyacá, Norte de Santander, Caldas,
Antioquia, Cundinamarca, Valle del Cauca, Santander y Nariño produjeron 683.538
toneladas de tomate, predominando las variedades Chonto y Milano con una
participación del 72,55% de la producción total para el año 2013.
Uno de los factores más limitantes de la producción a gran escala de tomate en
Colombia son los patógenos (hongos, bacterias, virus y nematodos) asociados a más
de 51 enfermedades reportadas. Sin embargo, la ausencia de genotipos comerciales
resistentes a enfermedades, la carencia de programas de mejoramiento genético, la
falta de prácticas culturales, los bruscos cambios climáticos, la ausencia de tecnología
apropiada para un mejor manejo de los sistemas de producción y el manejo post-
cosecha, hacen que enfermedades como la Marchitez vascular causada por Fusarium
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oxysporum f. sp. lycopersici (Sacc.) Snyder y Hansen cause grandes reducciones en
producción y afecte la calidad del cultivo. El cultivo de tomate demanda nuevas
estrategias a nivel biotecnológico como son el uso de cultivo de tejidos vegetales in vitro
y la microinjertación para la identificación e introducción de materiales promisorios
tolerantes o resistentes a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici.
El presente proyecto de investigación tiene como objetivo principal la evaluación y
producción de microinjertos de tomate comercial tipo Chonto utilizando como patrones
introducciones de tomate cereza tolerantes a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. Se
espera que la producción de las plantas vía microinjertación sirva como una alternativa
para la introducción de nuevos materiales genéticos como patrones tolerantes o
resistentes a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici con miras al fortalecimiento e
incremento del sistema productivo del cultivo.
3. Conformación y trayectoria del equipo de investigadores
Grupo de Investigación y Proyección en Producción Agropecuaria –GIPPA-
Código Colciencias: COL0103988
El objetivo general del Grupo es formar investigadores con capacidad para diseñar,
construir y ejecutar acciones efectivas que propicien el mejoramiento de la producción
agropecuaria, desde sus dimensiones ambiental, social y económica. A través de sus
líneas de investigación y de las actividades de proyección y extensión universitaria,
GIPA busca respuestas a los problemas propios del sector agropecuario de la región y
del país. El grupo ha venido realizando proyectos de investigación aplicada y desarrollo
tecnológico para el crecimiento del sector rural colombiano tendientes a la generación
de conocimiento a través del mejoramiento genético animal y vegetal, la bioprospección
y la producción agropecuaria integrada, articulado a los diferentes postgrados y
proyectos institucionales.
Desde la fundación del Grupo (Enero de 2011) algunos de los principales logros han
sido: el aporte efectivo a través de cursos especializados a estudiantes de posgrado de
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la Maestría en Sistemas de Producción Agropecuaria, Maestría en Fitopatología y
Doctorado en Ciencias Agrarias de la Universidad de Caldas. El grupo, a partir de su
potencial académico-científico, ha aunado sus esfuerzos investigativos en tres líneas de
investigación: Bioprospección, Genotecnia y Producción Integrada. Como resultado de
estos esfuerzos se ha logrado la consolidación y avance de diferentes convenios
interinstitucionales con entidades como Productos Químicos Andinos (P.Q.A),
Universidad de California Riverside EE.UU (UCR), Universidad Nacional de Colombia
sede Palmira y Universidad Católica de Manizales. Adicionalmente, GIPPA cuenta con
seis doctores y cuatro magísteres, tres de ellos adelantando estudios de Doctorado;
además de seis semilleros de investigación con 96 estudiantes de pre y postgrado con
trabajos de grado y tesis inherentes al quehacer de las diferentes líneas de
investigación del grupo. El grupo de investigación cuenta con los espacios académicos,
laboratorios y granjas para facilitar el desarrollo de los proyectos de investigación
propuestos.
4. Descripción del proyecto
4.1 Planteamiento de la pregunta o problema de investigación y su justificación.
El tomate se encuentra difundido en todos los continentes y representa unas de las
principales fuentes de vitaminas, minerales y fibra, importantes para la salud y nutrición
humana (Ceballos et al., 2012). Actualmente, debido al incremento de la población
mundial, se presentan altas demandas del cultivo a nivel de producción y
comercialización; lo cual explica su crecimiento, expansión y producción durante los
últimos años, permitiendo de esta forma; la generación de empleo rural, la estimulación
del empleo urbano, el aumento de las exportaciones, la mejora de la nutrición de los
humanos e incremento del ingreso de los agricultores. Sin embargo, el cultivo de
tomate es afectado por múltiples problemas fitosanitarios que limitan considerablemente
la producción (Parra y López, 1997; Vallejo-Cabrera, 1999; Guerrero, 2013). Muchos
de estos agentes fitopatógenos obligan a la aplicación de productos químicos de
elevada categoría toxicológica como benomil (categoría III), carbendazim (categoría III),
tiabendazol (categoria IV) (Jaramillo et al., 2013).
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El uso indiscriminado de estos productos pueden ocasionar el desarrollo de nuevas
cepas patogénicas resistentes, la reducción de especies benéficas para el cultivo,
problemas de salud en el personal involucrado con sus aplicaciones, acumulación
residual en el suelo, fuentes de agua y alimentos (Espinoza et al., 2003; Castro y
Ramos 2005).
Agentes como Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici causante del Marchitamiento
vascular, constituye uno de los patógenos más limitantes debido a las pérdidas que
ocasiona en las Solanáceas en el ámbito mundial (Guerrero, 2013). Como prueba de
ello, se reportan pérdidas del 60% hasta el 100% en los rendimientos del cultivo en
plantas afectadas por Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Agrios, 2005). Una de las
medidas más efectivas para el control de patógenos, es el empleo de variedades
resistentes (Peteira et al., 2002), seguida por la utilización de agroquímicos, los cuales,
a pesar de su relativa eficiencia presentan varios efectos negativos como: inducción de
resistencia en patógenos por el inadecuado uso de los mismos, pérdida de especies
benéficas, contaminación del suelo, agua, aire y residuos en alimentos (Maniania et al.,
2008; Skirvin y Fenlon, 2001).
Una alternativa viable a los problemas derivados del uso excesivo de productos
sintéticos, es la implementación de métodos que garanticen el desarrollo sostenible de
los sistemas productivos a través de la intervención de los factores social, ambiental y
económico, mediante la apropiación de cultivo de tejidos vegetales in vitro
especialmente de la microinjertación. Esta técnica, requiere la selección de una base o
patrón y de una copa o injerto; las dos porciones vegetales son establecidas in vitro y
luego, por medio de cortes específicos se logra la ubicación de las dos porciones
vegetales y su posterior cicatrización y con ello la obtención de una plántula
microinjertada (Hussain et al., 2015; Niang et al., 2015; Nava et al., 2011; Onay et al.,
2004).
El uso de la microinjertación ha sido propuesto como una estrategia de manejo
integrado para el control de enfermedades que se originan en el suelo en el cultivo de
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tomate que reducen significativamente la productividad del cultivo (de Lima Coutinho et
al., 2009; do Rego et al., 2008; Rivar y Louws, 2006).
Así mismo, ha sido exitosamente usada en un amplio rango de plantas como un
método efectivo para la obtención de plantas resistentes a patógenos del suelo. Por
ejemplo, Daktulosphaira vitifoliae, causante de la Filoxera de la uva es considerada
como la plaga más destructiva de las uvas cultivadas en todo el mundo, se alimenta de
la savia de las raíces de uva, causando daños y con frecuencia la muerte de los
viñedos (Makee et al., 2004). Para ello, se desarrolló un microinjerto (Kim et al., 2015),
logrando a través del uso de cultivares resistentes a la plaga (portainjertos) y uvas de
mesa comerciales (copas), la producción de plantas resistentes a la Filoxera.
Adicionalmente, do Rego et al. (2008) y de Lima Coutinho et al. (2009), lograron
establecer la metodología de microinjertación como método para el control de Ralstonia
solanacearum en cultivos de tomate en Brasil.
Esta problemática asociada al cultivo de tomate, generó tópicos de estudio para el
grupo de investigación GIPPA, los cuales fueron enfocados en la caracterización del
banco de germoplasma de Solanum spp. y en la búsqueda de estrategias que permitan
mejorar las condiciones actuales de la producción de tomate en el país. Ello dio origen
a los trabajos realizados por Cardona (2015); Gonzáles y Marín (2015); Gómez (2014) y
Ceballos (2012), en los cuales se ha logrado la identificación de accesiones de tomate
tolerantes a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, las introducciones IAC426, IAC391,
IAC412, LA1480 y LA2076. Estos trabajos, permitieron la selección de estas
introducciones por su tolerancia al patógeno causante de la Marchitez vascular, con
miras al desarrollo de plántulas tolerantes a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, que
puedan ser incorporadas en futuros programas de mejoramiento genético.
Los resultados de éstos proyectos de investigación, dieron origen a la presente
propuesta, la cual tiene como objetivo la producción de variedades de tomate tipo
chonto vía microinjertación en plantas de tomate cereza tolerantes a Fusarium
oxysporum f. sp. lycopersici. Para cumplir con el objetivo se están aprovechando tanto
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las características benéficas del sistema radical (resistencia a enfermedades) de los
cultivares seleccionados, como las cualidades productivas de las variedades que
formarán la parte aérea de la planta (copa comercial). Se espera que las plantas
producidas por microinjertación muestren tolerancia o resistencia a Fusarium
oxysporum f. sp. lycopersici generando un impacto significativo en las pérdidas por
daño del patógeno, y aumento en el rendimiento promedio del cultivo. La producción de
nuevas líneas de tomate tolerantes o resistentes a Fusarium oxysporum f. sp.
lycopersici por microinjertos puede considerarse una valiosa contribución para el
manejo de la enfermedad para los productores de tomate.
La generación y divulgación de los resultados del proyecto mediante publicaciones
científicas y la interacción con diferentes grupos de investigación nacionales e
internacionales son compromisos primordiales para la formación de capital humano en
esta investigación.
4.2 Marco Teórico
El cultivo de Tomate:
El tomate tipo cereza es nativo de la región Andina de América del Sur, donde
posteriormente fue propagado hacia México y a Europa a mediados del siglo XVI, el
cual reporta gran cantidad de subespecies o variedades que a su vez aportan elevada
variabilidad genética (Nuez, 1999). En Colombia, la producción de tomate para el año
2014, fue de 683.538 toneladas/año con un rendimiento de 409.206,18 Kg/ha
destacándose los departamentos de Boyacá, Norte de Santander, Caldas, Antioquia,
Cundinamarca, Valle del Cauca, Santander y Nariño con una participación nacional total
de 72,55%, en los cuales se siembran las variedades Chonto y Milano (Minagricultura,
2012; FAOSTAT, 2015) haciendo de ésta la hortaliza más importante en Colombia y en
el mundo.
Sin embargo, en Colombia, los patógenos (hongos, bacterias, virus y nematodos)
constituyen uno de los factores más limitantes de la producción a nivel comercial de
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tomate, situación que se ve incrementada por la ausencia de cultivares comerciales con
resistencia genética específica, las prácticas inadecuadas de control empleadas por el
agricultor y el uso indiscriminado de pesticidas que inducen a cambios genéticos en los
patógenos, desarrollando razas más virulentas (Vallejo-Cabrera, 1999).
A pesar de su relativa eficiencia, el empleo de pesticidas de síntesis química, genera
varios efectos negativos como: la inducción de individuos resistentes debido al uso
inadecuado de los agroquímicos, la reducción o eliminación de especies benéficas, la
alta toxicidad de los productos para los operarios y la presencia de residuos en los
alimentos (Maniania et al., 2008), sin mencionar los costos indirectos generados como
la contaminación del aire, de las aguas subterráneas, la degradación del suelo y la
pérdida de diversidad biológica (Skirvin y Fenlon, 2001; Espinoza et al., 2003; Castro y
Ramos, 2005).
Debido a las condiciones climáticas de Colombia y por ser principalmente agrícola,
existe una alta dependencia hacia los pesticidas para favorecer el rendimiento en las
cosechas. Sin embargo, el uso indiscriminado de éstos ha generado serias
consecuencias que afectan los ecosistemas, a los agricultores y a los consumidores,
debido a su residualidad en agua, suelo, ambiente y alimentos como el tomate, papa,
espinaca y lechuga; vegetales que están reportados con mayor almacenamiento de
contaminantes (Badii y Landeros, 2015; Plenge-Tellechea et al., 2007; Castro y Ramos,
2005; Cárdenas et al., 2005).
Las principales enfermedades que se presentan en el cultivo de tomate en Colombia
son: Tizón tardío, (Phytophthora infestans (Mont.) de Bary), Tizón temprano (Alternaria
solani (Ell. y Martin) Jones y Grout), Mildiú o Moho gris (Fulvia fulva Cooke
Cladosporium fulvum Cooke), Carate (Phoma andina var. crystalliformis Turkenst),
Mancha foliar (Stemphylium solani Weber.), Marchitez vascular [Fusarium oxysporum f.
sp. lycopersici (Sacc.) Snyder y Hansen], Verticilosis (Verticillium dahliae Kleb.),
Mancha bacteriana (Xanthomonas campestris var. vesicatoria Doidge), Peca bacteriana
(Pseudomonas syringae var. tomato Okabe) y la Peste negra o vira cabeza (virus
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TSWV – Tomato Spotted Wilt Virus) (Castaño-Zapata, 2015; Jaramillo, 2007; Agrios,
2005; Vallejo-Cabrera, 1999).
Marchitez vascular:
Una de las enfermedades más devastadoras del cultivo de tomate es la Marchitez
vascular, cuyo agente causante, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Sacc.) Snyder y
Hansen, es responsable de pérdidas hasta de un 60% en producción, afectando
también la calidad del producto (Agrios, 2005), inclusive cuando la planta se marchita,
la pérdida puede llegar al 100% ya que las plantas infectadas quedan pequeñas y sus
frutos maduran prematuramente (Kranz, 1982).
La Marchitez vascular, es una enfermedad que se encuentra distribuida en todo el
mundo causando grandes pérdidas en el cultivo de tomate, el agente causante es
transportado por el suelo. La Marchitez vascular fue descrita por primera vez en
Inglaterra en 1895 (Bewley, 1922), y se le llamó la enfermedad de los tomates
adormilados. La presencia de la enfermedad ha sido reportada al menos en 32 países
y particularmente se considera endémica en países con clima cálido; el uso de
variedades resistentes como por ejemplo los cultivares de tomate denominados KNVF y
KVF, híbridos inter-específicos que han ayudado a disminuir las pérdidas en producción
causadas por Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3 y Pyrenochaeta lycopersici
(Kuniyasu y Yamakawa, 1983). Los factores que favorecen el desarrollo del
marchitamiento son: la temperatura del suelo y del aire de 28°C, suelos ácidos y
arenosos, humedad en el suelo por encima de la capacidad de campo, baja
disponibilidad de nitrógeno y fósforo y alto en potasio, fotoperiodos cortos, y baja
intensidad de luz (Wong, 2003).
El hongo impide la translocación de agua y nutrientes a través de los vasos del xilema
causando finalmente la muerte de la planta (Schumann y D’Arcy, 2006). Los primeros
síntomas de la enfermedad que se presentan en la planta son el amarillamiento de las
hojas más viejas, estrías longitudinales cloróticas en los tallos que luego se vuelven
pardas en el centro pero siempre rodeadas de un halo amarillo (Fig. 1). Si se levanta la
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corteza, bajo éstas manchas, se detectan los vasos de color pardo. El tejido vascular de
los frutos es afectado (González, 2012). La planta desmejora día a día, su tejido
vascular se torna pardo y por último la planta muere. Las respuestas en las alteraciones
vasculares de la planta son inducidas directamente por el patógeno, mientras que otras
las origina el hospedante en respuesta al patógeno. Básicamente el patógeno ataca el
tejido vascular afectando el flujo de agua en el xilema (Agrios, 2005), mientras que la
planta produce oligosacáridos como producto de la degradación de las paredes
celulares de los haces vasculares, éstos, en algún momento pueden tornarse en
inductores de respuestas de defensa por la planta.
Figura 1. Síntomas de la Marchitez vascular en plantas de tomate. A. Marchitez de la
planta. B. Clorosis. C. Necrosamiento vascular. Imágenes tomadas y modificadas de
Fernández-Herrera et al. (2013).
Fusarium oxysporum:
Fusarium oxysporum es un hongo filamentoso hialino de distribución universal que se
reproduce de manera asexual, causa la Marchitez vascular en cultivos de importancia
económica y sus aislamientos se han clasificado en formas especiales en función de la
especificidad de hospedante (Agrios, 2005). De acuerdo con Castaño-Zapata (2015),
Fusarium oxysporum pertenece a los hongos mitospóricos, orden Moniliales, familia
Moniliaceae, género: Fusarium. La mayoría de los hongos de este género que
producen Marchitamiento vascular pertenecen a Fusarium oxysporum. Dentro de la
especie oxysporum muchos de sus miembros presentan patogenicidad especifica por el
hospedante, lo que ha conllevado a una subdivisión de la especie en formas especiales
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que, a su vez, debido a la virulencia sobre variedades del mismo hospedante, se divide
en razas fisiológicas (Booth, 1970; Nelson y Plosser, 1982; González, 2012). Así, el
hongo que ataca al tomate se designa como F. oxysporum f. sp. lycopersici (Agrios,
2005), del cual se conocen actualmente las razas 1, 2 y 3 (Hernández-Martínez, 2014;
González, 2012; Pietro et al., 2003).
Adicionalmente, Fusarium oxysporum se caracteriza por la producción de hifas
tabicadas hialinas, conidióforos cortos y por lo general no septados, con monofialides
laterales cortas dispuestas en el micelio aéreo (Leslie y Summerell, 2006). Forma tres
tipos de esporas asexuales: 1. Microconidios: esporas unicelulares hialinas con forma
recta o curva, elipsoidal o cilíndricas y en la mayoría de los casos sin septos, de 5-12
µm de largo por 2,5–3,5 µm de ancho. 2. Macroconidios: esporas de forma alargada,
ligeramente curvas, por lo general con tres septos transversales, la célula apical en
forma cónica y la basal con extremo en forma de pie, de 27 a 46 µm de largo por 3–4.5
µm de ancho, y 3. Clamidosporas: esporas hialinas de apariencia lisa o rugosa, que
pueden presentarse en forma aislada, en pares, en racimos o en cadena, de acuerdo a
la posición que ocupan en la hifa pueden ser: intercalar, si están dentro de la hifa, sésil,
cuando están al lado de ésta y terminal, cuando están en su extremo; las clamidosporas
se caracterizan por su alta resistencia a condiciones ambientales desfavorables (Leslie
y Summerell, 2006).
Las colonias de Fusarium oxysporum son de crecimiento rápido, algodonosas o
vellosas con una coloración superficial rosada a roja distintiva y en el reverso una
pigmentación de blanco a violeta, con su centro de color purpura o azul oscuro (Leslie y
Summerell, 2006).
El control de F. oxysporum f.sp. lycopersici se fundamenta principalmente en tres
estrategias: prácticas de manejo cultural, aplicación de agroquímicos y el uso de
variedades resistentes (Barone y Frusciante, 2007). Las variedades resistentes se
producen principalmente cruzando tipos silvestres resistentes y cultivares existentes
destacados por sus propiedades como el buen sabor, forma y color (Peteira et al., 2002;
Vallejo-Cabrera, 1999). Kuniyasu y Yamakawa (1983), tienen reportados dos cultivares
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resistentes de tomate denominadas KNVF y KVF, híbridos interespecíficos de Solanum
spp. y Solanum hirsutum, con resistencia a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3
y Pyrenochaeta lycopersici, los cuales son utilizados como patrones para injertos (porta-
injertos) (Fukuju y Walter, 1983).
Interacción plata-patógeno:
Debido a los ambientes complejos y el amplio rango de exposición e interacción a
factores tanto abióticos como bióticos, las plantas han adquirido diferentes estrategias
de defensa, dentro de las que se encuentra el reconocimiento de elicitores y efectores,
es decir, moleculas provenientes de diversas fuentes (bióticas/abióticas) que se
encargan de activar los sistemas de defensa de las plantas (Vasconsuelo y Boland,
2007).
El conocimiento de los mecanismos de defensa y resistencia de las plantas a la
enfermedad, se ha enfocado en entender la interacción entre el hospedante (la planta) y
el patógeno a partir del estudio de los genes de resistencia (R) y los genes de
avirulencia del patógeno (Avr) (Meng y Zhang, 2013; Guan, 2012; Gururani et al., 2012;
Campbell et al., 2002).
Sin embargo, es importante entender los tipos de interacción entre la planta y el
patógeno, considerando asi dos tipos de interacciones: interaccion incompatible e
interaccion compatible; la primera se determina cuando la planta tiene la capacidad
de activar los mecanismos de defensa y de esta manera impide o bloquea la
colonización del patógeno, definiendo asi la planta como resistente; dentro de las
respuestas de defensa en las interacciones incompatibles se encuentra la respuesta de
hipersensibilidad (HR), la cual se presenta como un sintoma visible de necrosis sobre el
tejido vegetal (Desender et al., 2007; Glazebrook, 2005; Panstruga, 2003).
Por otro lado, la interacción compatible se establece cuando las defensas de la planta
no son inducidas y el patógeno tiene la capacidad de desarrollarse e infectar por
completo la planta, en este caso la planta se considera susceptible (López, 2007;
Glazebrook, 2005; Panstruga, 2003).
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De acuerdo con el modelo de reconocimiento planta-patógeno, lo primero que debe
suceder es el reconocimiento que la planta hace de las moléculas producidas por el
patógeno dentro del mismo hospedante durante el ataque a la celula vegetal; estas
moléculas, altamente conservadas, son conocidas como elicitores, ellas son
responsables de inducir o activar las respuestas de defensa de las plantas
(Muthamilarasan y Prasad, 2013; Meng y Zhang, 2013; Desender et al., 2007).
Los elicitores que están asociados a la patogenesis se denominan PAMPS (Pathogen–
Associated–Molecular-Patterns) o MAMPS (Microorganism-Associated-Molecular-
Patterns), dentro de estas moleculas se encuentran lipopolisacáridos, la quitina de los
hongos, el peptidoglucano y la flagelina de las bacterias (Muthamilarasan y Prasad,
2013; Meng y Zhang, 2013; Mercado y Pineda, 2009; Boller y Felix, 2009).
El reconocimiento de PAMPS o MAMPS esta determinado por proteinas especificas de
reconocimiento a patógenos o PRRs, las cuales inician una respuesta de defensa activa
en la planta, denominada como inmunidad basal (Boller y Felix, 2009). La primera
etapa de esta inmunidad basal se denomina PTI (PAMP‐ Triggered‐ Immunity), ésta es
mediada por receptores de proteinas PRRs, quienes se localizan en la membrana de la
célula vegetal y se caracterizan por la presencia de dominios altamente conservados
como NBS (Nucleotide Binding Site) junto con un dominio LRR (Leucine Rich Repeat),
permitiendo translocar la respuesta al interior de la celula vegetal a traves de una
cascada de kinasas para activar factores transcripcionales específicos de la respuesta
de defensa (Jones y Dangl, 2006; Boller y He, 2009).
El reconocimiento a través de la PTI en patógenos como F. oxysporum que tienen la
capacidad de destruir completamente el tejido durante la infección (necrótrofo), no es
efectivo (Jones y Dangl 2006), debido a que el patógeno produce moléculas efectoras
que facilitan la muerte celular y evitan el reconocimiento por parte de las proteinas
PRRs, bloqueando así la PTI. Como consecuencia de esto, el patógeno puede iniciar la
colonización en la planta a traves de las raices (Muthamilarasan y Prasad, 2013; Meng
y Zhang, 2013; López, 2007).
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Aunque las celulas vegetales de las plantas tienen suficiente celulosa, hemicelulosa y
pectina para evitar ser atacadas por los patógenos, las hifas de F. oxysporum logran
penetrar la raiz a traves del apoplasto y el simplasto, causando asi daño del córtex
(Alabouvette et al., 2009). El complejo enzimatico producido por F. oxysporum implica la
secreción de enzimas como celulasas, poligaracturonidasas (PGs), pectatoliasas (PLs),
xilanasas y proteasas, de tal forma que, tan pronto la hipodermis de la raiz ha sido
invadida por el patógeno, este se ubica en el córtex de la raiz, con ello se evidencia que
las respuestas de defensa basal por parte de la planta en el interior del córtex no son
efectivas para detener el crecimiento del microorganismo en el primer reconocimiento.
Sin embargo, la planta continúa en su lucha por defenderse activando la segunda fase
de reconocimiento entre hospedante‐ patógeno: la inmunidad mediada por efectores
ETI (Effector‐ Triggered-Immunity). Este reconocimiento puede ser directo a partir del
modelo receptor‐ ligando (interacción proteina‐ proteina: un solo gen de resistencia
tiene la capacidad de reconocer un solo gen de avirulencia) o indirecto mediante el
modelo gen‐ guardian (la proteina de resistencia detecta el cambio conformacional en la
proteina guardian induciendo asi la respuesta de defensa) (Muthamilarasan y Prasad,
2013; Dodds y Rathjen, 2010).
ETI se considera una respuesta acelerada y mucho mas amplia que la respuesta PTI, lo
cual resulta en una resistencia por parte de la planta donde, usualmente, se evidencia
la producción de fitoalexinas (tóxicas para el patógeno) y ligninas (que fortalecen la
pared celular). Los primeros reportes sobre la participación de fitoalexinas en la
respuesta de defensa de las plantas, fueron descritos por Muller en 1956, mostrando
fuertes evidencias de la resistencia de la papa a Phytophtora infestans. A partir de esta
observación nace la idea de la presencia de las fitoalexinas en inmunidad vegetal (Kuc,
1995). Éstas, son metabolitos secundarios de bajo peso molecular, que han sido
definidas como compuestos producidos por la planta después de una infección bajo la
influencia de dos sistemas metabólicos (planta/patógeno) (Muller, 1956). Se conoce
además, que son metabolitos secundarios producidos por las plantas con actividad
inhibitoria contra bacterias, hongos, nematodos, insectos y efectos tóxicos tanto de
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animales como de las mismas plantas (Arruda et al., 2016; García-Mateos y Pérez-Leal,
2003).
Los aspectos moleculares de las fitoalexinas fueron introducidos por Cruickshank y
Perrin desde 1971, quienes lograron la caracterización de diversas estructuras de las
primeras fitoalexinas identificadas y aisladas de frijol, zanahoria, papa y orquídea,
constituyéndose en el punto de partida para estudios químicos, bioquímicos y biológicos
en relación a la participación de éstas en la resistencia a enfermedades (García-Mateos
y Pérez-Leal, 2003). Las fitoalexinas se sintetizan inmediatamente después de la
infección o el daño en las células sanas adyacentes a las células infectadas ó dañadas
y se acumulan tanto en tejidos necróticos resistentes, como susceptibles, es decir, se
producen en el lugar de la infección, de tal forma que una o varias fitoalexinas alcanzan
una concentración suficiente para inhibir el desarrollo del patógeno por disfunción en la
integridad de la membrana celular, induciendo así la resistencia en la planta (Kuc, 1995;
García-Mateos y Pérez-Leal, 2003). A la fecha, diversas fitoalexinas han sido
identificadas en una amplia variedad de especies vegetales; por ejemplo, en
solanáceas, glicoalcaloides, sesquiterpenos, cumarinas entre otras han sido
identificadas (Arruda et al., 2016). La -tomatina es una fitoalexina producida por la
planta de tomate que induce la muerte celular programada por la posible activación de
las vias de señalización, a traves de la tirosina quinasa y la proteina G, ésta induce a
una acumulación intracelular de Ca++ y a la producción de especies reactivas de
oxígeno como el peróxido de hidrógeno (H2O2) (Ito et al., 2004; González et al., 2012).
Actualmente gracias a los grandes avances en el conocimiento molecular de las
fitoalexinas se puede manipular a través de la ingeniería genética la producción de
éstas para modular y mejorar la respuesta de defensa de las plantas (Arruda et al.,
2016; Jeandet et al., 2013; Pieterse et al., 2012).
Además de la activa participación de las fitoalexinas en la defensa de la planta, se
activa la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) que inducen la respuesta
de hipersensibilidad, la cual consiste en una muerte celular programada en el sitio de la
colonización para evitar la movilidad del patógeno a otros tejidos; finalmente se da la
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activación y expresión de los genes de defensa que generarán las proteínas de
resistencia (PR) responsables de identificar los efectores generados por el patógeno
con el objetivo de controlar el avance del patógeno (Muthamilarasan y Prasad, 2013;
Gururani et al., 2012; Jones y Dangl 2006).
Los efectores contribuyen con la virulencia del patógeno y son el producto de los genes
Avr, quienes codifican proteinas que son “presentadas” a las celulas vegetales durante
la infección (López, 2007), y que podrán interactuar con los productos de los genes R,
(las proteínas R), generadas por la planta en su respuesta de defensa. Ademas, estos
efectores pueden mimetizar o inhibir funciones de las celulas eucarioticas (Jones y
Dangl 2006).
En el caso de las interacciones incompatibles, la función de los efectores es activar las
respuestas de defensa; mientras que en las interacciones compatibles, su función es
suprimir las respuestas de defensa basales desencadenando en la planta la ETS
(Effector‐ Triggered-Susceptibily).
Algunos efectores o genes Avr de los hongos han sido ampliamente descritos; para F.
oxysporum, se conoce que secreta las proteinas efectoras SIX‐ 1 (Secreted in Xylema‐
1) codificada por el gen Avr3, la proteina SIX-3 codificada por el gen Avr2 y la proteina
efectora SIX‐ 4, codificada a partir del gen Avr1, secretada en el xilema de plantas de
tomate afectadas por F. oxysporum fs. lycopersisci. Las proteínas SIX-1 y SIX-3 son
necesarias para la completa virulencia del patógeno; mientras que la proteina efectora
SIX‐ 4, no es totalmente necesaria para generar la Marchitéz vascular en plantas de
tomate (Rep et al., 2005; Houterman et al., 2008; Houterman et al., 2009; Michelse y
Rep, 2009).
Para F. oxysporum f. sp. lycopersici, la respuesta ETI se da a partir de los genes
efectores Avr2 y Avr3 los cuales son expresados durante la colonización del patógeno
desde la raíz hasta alcanzar el xilema de las plantas de tomate, son reconocidos por los
genes de resistencia I2 (Immunity 2) e I3 respectivamente. El gen efector Avr1 no es
reconocido por parte de los genes R encargados del reconocimiento de efectores en
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plantas de tomate I2 e I3 (Michelse y Rep 2009), favoreciendo la colonización en el
xilema, hasta causar marchitamiento vascular. Aunque, es posible que algunos
patógenos tengan una mayor cantidad de efectores disminuyendo la respuesta ETI y
continuando con la respuesta ETS.
Como producto de la activación de la respuesta ETI se induce la resistencia sistémica
en las plantas, encontrando, dependiendo del estímulo al cual están sometidas: la
Resistencia Sistémica Inducida (ISR) y Resistencia Sistemica Adquirida (SAR). La
primera es mediada por el reconocimiento de elicitores bióticos no patógenos, por
ejemplo cuando hay colonización de las raíces por microorganismos de la rizósfera
como bacterias promotoras de crecimiento vegetal, quiénes además de facilitar el
crecimiento en la planta, también tienen la capacidad de protegerla contra patógenos;
esta resistencia es independiente de la acumulación de proteínas R y es mediada por
las vías de señalización del ácido masónico (AJ) y el etileno (ET). La resistencia SAR
responde a elicitores bióticos patógenos o abióticos (Shah et al., 2014; Díaz-Puentes,
2012; Buonaurio et al., 2002), y depende de la expresión y acumulación de proteinas
PR inducidas como resultado de la señalización principalmente de acido salicilico (SA)
(Shah et al., 2014; Díaz-Puentes, 2012; Hammerschmidt, 2004).
Recursos fitogenéticos:
Los recursos fitogeneticos para la alimentación y la agricultura estan formados por la
diversidad del material genetico que contienen las variedades tradicionales y los
cultivares modernos que cultivan los agricultores, asi como las plantas silvestres afines
de las cultivadas y otras especies de plantas silvestres que se pueden utilizar para
obtener alimentos, fibras, ropa, cobija, madera de distintos tipos, energia, etc. (Thornton
et al., 1996); estos recursos fitogenéticos tienen un gran valor en la seguridad
alimentaria de la humanidad gracias a la presencia de materiales silvestres que poseen
un patrimonio genetico invaluable. Por tal motivo, las especies cultivadas pueden
beneficiarse mediante el flujo genetico de sus parientes en busca de resistencia a
plagas y enfermedades (Morales et al., 2016). Razón por la cual es importante el uso y
mantenimiento de la diversidad genetica de las plantas silvestres, tradicionales,
regionales y cultivos mejorados (FAO, 2010; Hidalgo y Vallejo, 2014).
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La caracterización y uso de la biodiversidad de los recursos fitogenéticos está
considerada entre las líneas de investigación estratégicas a nivel mundial debido a que
se establece como la base para la solución de los problemas actuales de los cultivos, la
adaptación a los cambios climáticos y el desarrollo de nuevas alternativas en la
producción (Virk et al., 1995). El valor de las colecciones de recursos fitogenéticos
reside en la utilización que de ellas se haga, al conocer el valor agronómico de los
materiales, para producir nuevos cultivares, domesticar nuevas especies y desarrollar
nuevos productos, para el beneficio de las actividades productivas (Abadie y Berreta,
2001). De tal forma que, se permita una producción más saludable y sostenible de
alimentos, haciendo que el desarrollo de iniciativas en torno a la producción orgánica y
al uso sostenible de los recursos fitogenéticos sea un reto para los países en desarrollo,
especialmente para los de mayor riqueza biológica que estén en miras de mejorar su
economía (Cestoni et al., 2001).
Aunque, se sabe que existe una considerable brecha entre el número de materiales
conservados en bancos de germoplasma y el de aquellos de los que se tienen datos de
caracterización y evaluación, estimándose a nivel mundial un 80% de muestras sin
datos de caracterización y un 95% sin datos de evaluación agronómica (Abadie y
Berreta, 2001); por ello, es importante considerar la búsqueda de variedades
resistentes que puedan ser empledas en programas de mejoramiento genético.
Así, el uso de cultivares resistentes y de herramientas como injertación in vivo e in vitro
pueden ser una forma útil y económica de controlar patógenos en los cultivos,
pudiéndose extrapolar a la agricultura de altos insumos como la producción de
hortalizas bajo condiciones controladas (Bridge, 1996; Rodríguez et al., 2005; Rivard y
Louws, 2006). De tal forma que el uso y conservación de los recursos fitogenéticos
puedan ser empleados para mejorar la productividad y la sostenibilidad de la
agricultura, contribuyendo así al desarrollo nacional, la seguridad alimentaria y el alivio
de la pobreza.
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Injertación
El injerto es la operación mediante la cual se une íntimamente o se inserta una parte de
una planta en otra, de manera que queden soldadas y se desarrollen juntas formando
una única planta (Espiau et al., 2012). La injertación se ha empleado desde la
antigüedad, documentándose en China desde comienzos del primer milenio a. C., y en
Occidente ya se tenía conocimiento en la Grecia clásica. Para su época, Aristóteles
describe claramente las técnicas empleadas y otros autores del campo agrícola
romanos también las documentan. Sin embargo, el interés en la práctica fue
estimulado durante el Renaciomiento, cuando Henri Louis Duhamel en el siglo XVII
estudió la función de los tejidos en el proceso de injertación, estas investigaciones
sentaron las bases de los conocimientos actuales sobre el injerto. A partir de los años
1920 se describe desde el punto de vista científico el injerto en púa y a partir de los
años 50s fue ampliamente usado en cucurbitáceas y solanáceas (Espiau et al., 2012).
Esta técnica permite combinar las cualidades del injerto y las del patrón para producir
una planta con altos rendimientos. El principio del injerto consiste en poner en contacto
directo el cambium vascular del injerto con el cambium vascular del patrón para lograr
la unión entre ellos, deben mantenerse unas condiciones de temperatura y humedad
que estimulen el prendimiento en las células recién puestas en contacto y en las
circundantes (Hartmann y Kester, 1991). Después, las células del cambium del patrón y
del injerto producen células de parénquima que se entremezclan formando un callo.
Cuando esto se logra, en el cambium se inicia la formación de callo que permite el paso
de savia elaborada y bruta entre copa a patrón (Sequiera et al., 2014); de esta forma se
induce el desarrollo del injerto, proceso en el cual se evidencian tres procesos
fundamentales: 1. cohesión entre el patrón y la copa, 2. proliferación del callo en la
unión y 3. la diferenciación vascular con la formación del xilema y el floema (Ribeiro et
al., 2015; MINAGRICULTURA, 2014).
La producción de plantas injertadas comenzó en Japón y Corea a fines de 1920 con
sandía injertada usando calabaza como porta-injerto (Yamakawa, 1983). Después de
los primeros experimentos se incrementó el uso de plantas injertadas, especialmente de
frutales (Sequiera et al., 2014; Espiau et al., 2012). Sin embargo, en los últimos años,
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ha despertado interés en cultivos hortícolas como pepino, melón, sandía, chile,
berenjena y tomate para la obtención de resistencia a diversas enfermedades que
atacan el sistema radical (Álvarez-Hernández, 2012; Santos et al., 2000; Lee, 2003).
Además, en cultivos como tomate, berenjena y sandía mediante el injerto se obtiene
mejor desarrollo en plantas y mayor rendimiento en la producción (Choi et al., 2002;
Cürük et al., 2005; Khah et al., 2006), también se sabe que el uso del injerto mejora la
calidad y las características físico-químicas de los frutos (Coutinho et al., 2006),
aumenta la tolerancia a la salinidad en el suelo (Fernández-García et al., 2004; Estañ et
al., 2005), y a temperaturas y altitudes elevadas (Venema et al., 2008). Adicionalmente,
incrementa el vigor de la planta y la vida de post-cosecha de la fruta (Lee y Oda, 2003),
reduce las infecciones causadas por virus, hongos y bacterias (Báez-Valdez et al.,
2010; Hibar et al., 2006; Rivard y Louws, 2008; Hain et al., 1993), disminuyendo el uso
de agroquímicos durante el ciclo de cultivo.
El éxito del proceso de injertación radica en: 1. la afinidad entre patrón y copa, 2. unión
estrecha entre cambium de patrón y copa, 3. realización en época adecuada (depende
del clima, la especie y disponibilidad de yemas), 4. protección frente a desecación y
ataque de patógenos que causen infecciones y pudriciones, y 5. sanidad tanto del
patrón como de la copa (Sequiera et al., 2014; Espiau et al., 2012). Además de lo
descrito anteriormente y de las características propias de las plantas a injertar, algunos
factores ambientales facilitan o dificultan el proceso. Entre los más importantes están:
temperatura (25-28 ºC), humedad (80-90 %), superficie de contacto, técnica de injerto
empleada, disponibilidad de oxígeno y condiciones de asepsia en el proceso (Arlette,
2010).
También es importante considerar la selección de patrón y del injerto (copa). En el
momento de seleccionar la copa, se han considerado las siguientes características:
que provenga de una planta madre que presente altos rendimientos, presencia de frutos
de excelente calidad, producción temprana, tolerancia a plagas y enfermedades y el
porte o arquitectura de la planta (Sequiera et al., 2014).
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Por su parte, el patrón se selecciona teniendo en cuenta un buen vigor y desarrollo de
raíces, tolerancia a plagas y enfermedades y la adaptación a condiciones del suelo
como salinidad, pH, nutrición, textura y estructura (Sequiera et al., 2014). Así mismo,
Espiau et al. (2012) plantea que el patrón debe ser: fácilmente propagable, debe tener
un buen comportamiento en vivero, debe ser compatible con una gran variedad de
especies, debe ser adaptable a las condiciones del suelo, longevo, y proporcionar un
buen anclaje para el injerto.
La perpetuación de clones que no producen semilla o no se reproducen por estacas, el
establecimiento en corto tiempo de una plantación con fines comerciales, la renovación
de cultivos viejos, la propagación de plantas con alta productividad y calidad de frutos,
la propagación de variedades que no están bien adaptadas a las condiciones del suelo
o tienen sistemas radiculares débiles, la integración de diferentes variedades o
especies aportando cada una de ellas sus propias características y la reproducción de
una planta madre con las mismas características, son algunas de las ventajas descritas
por Sequiera et al. (2014), para el uso de la injertación. Sin embargo, el mismo autor
manifiesta que la incompatibiliad presente en el punto de unión del injerto-patrón, la
poca difusión de la técnica, la falta de organización y capacitación a los productores son
desventajas a considerar, además de la influencia directa de los factores ambientales.
El uso de la técnica del injerto es una importante estrategia para disminuir
considerablemente la incidencia de enfermedades (Báez-Valdez et al., 2010; Hibar et
al., 2006; Rivard y Louws, 2008; Hain et al., 1993), ya que por ejemplo, se confronta la
susceptiblilidad de los materiales comerciales a la marchitez por Fusarium oxysporum f.
sp. lycopersici mediante el injerto sobre un patrón resistente; así por ejemplo, Hibar et
al. (2006), reportan el uso de los patrones resistentes He-Man y Beaufort en las
variedades susceptibles Durintha F y Brocha F, demostrando el efecto de su resistencia
en términos de desarrollo, rendimiento y calidad del fruto en el cultivo de tomate.
La injertación es un método tradicional para la producción de plantas, pero su éxito,
como se mencionó anteriormente, es dependiente de las condiciones ambientales
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(Arlette, 2010); adicionalmente, las bajas tasas de prendimiento en condiciones
normales se deben a procesos de deshidratación del tejido y a la introducción de
agentes contaminantes como bacterias, hongos y virus por malas prácticas durante el
proceso de injertación (Sequiera et al., 2014; Arlette, 2010). Frente a esta dificultad, se
propone la microinjertación, la cual es realizada bajo condiciones ambientales
controladas y esterilidad, generando materiales libre de patógenos.
Microinjertación:
La aplicación del cultivo in vitro para la producción de plantas vigorosas y libres de
patógeno es una alternativa para el mejoramiento de cultivos productivos (González,
2008). Esta tecnología también permite el establecimiento de sistemas de propagación
in vitro con usos potenciales en los cultivos agrícolas como la producción a escala
comercial de genotipos homo y heterocigóticos, la regeneración somática de materiales
estériles, la propagación de material fitogenético libre de enfermedades, la inducción de
procesos de microinjertación, la conservación e intercambio de germoplasma y la
introducción de estos materiales en programas de mejoramiento genético (García-
Gonzáles et al., 2010; González, 2008; Poehlman y Allen, 2003; Calva y Pérez, 2005;
Pereira et al., 2008; Levitus et al., 2004; Sahijram y Rajasekharan, 1996; Hartmann y
Kester, 1991).
La microinjertación es una técnica de injertación in vitro que involucra la ubicación de un
meristemo o un explante en un patrón al que se le han retirado sus cotiledones y que ha
crecido en condiciones asépticas a partir de semillas o plantas micropropagadas
(Rehman y Gill, 2015; Hussain et al., 2015; Báez-Valdez et al., 2010; Onay et al., 2004).
Consiste en la ubicación de una copa en una base o patrón en condiciones in vitro, este
tipo de técnica reduce el daño ocasionado por patógenos, ya que se utilizan variedades
resistentes que han sido seleccionadas como porta-injertos, por medio de especies
silvestres tolerantes o resistentes a una enfermedad, con plantas que tiene frutos de
aceptación comercial (Rehman y Gill, 2015; Hussain et al., 2014; Yıldırım et al., 2013;
Wang et al., 2010; Aazami y Bagher, 2010; Mushtaq, 2010; de Lima Coutinho et al.,
2009; Onay et al., 2004).
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El resultado del microinjerto es una planta constituida por una copa o injerto (parte
aérea), que según Rehman y Gill (2015) y Hussain et al. (2015), es una porción de tallo
o yema que se fija al patrón para que se desarrollen ramas, hojas, flores y frutos, y un
patrón (parte radical). La copa cuenta regularmente con cualidades agronómicas
importantes como rendimiento, forma, color, sabor, pero en algunas ocasiones es
susceptible a ciertas plagas o enfermedades. El patrón generalmente no tiene valor
agronómico, pero genéticamente contiene genes de resistencia o tolerancia a estrés
biótico o abiótico (Báez-Valdez et al., 2010; Louws et al., 2010; Gonzáles et al., 2008;
King et al., 2008; Karssen y Moens, 2006).
La microinjertación es una técnica que también es empleada en el control de
enfermedades del suelo, sus primeros reportes fueron por Doorenbos en 1953 en
hiedra y en 1956 por Holmes en crisantemo; luego, la técnica fue modificada y
mejorada incrementado la tasa de éxito por Murashige et al. (1972) y por Navarro et al.
(1975); mostrando hasta la fecha un gran potencial para mejorar la producción o
multiplicación a escala de muchos cultivos (Hussain et al., 2015; Dumanoğlu et al.,
2014; Hassanen, 2013; Acosta-Rangel et al., 2011; Farahani et al., 2011; Nava et al.,
2011; de Lima Coutinho et al., 2009; Naz et al., 2007; Lane et al., 2003; Raharjo y Litz,
2003).
Tanto la injertación in vivo como in vitro (microinjerto) son alternativas para disminuir las
aplicaciones de agroquímicos, y disminuir los costos de producción del cultivo (Báez-
Valdez et al.,2010; de Lima Coutinho et al., 2009; Rivard and Louwis, 2006; Hibar et al.,
2006; Acosta, 2005). La injertación con patrones resistentes a patógenos son
comúnmente utilizados para su venta comercial en cultivos como: citrus, sandía, melón,
pepino, tomate entre otros, (Yıldırım et al., 2013; Aazami y Bagher, 2010; Mushtaq y
Banday, 2010; Onay et al., 2004; Rajarjo y Litz, 2003). Adicionalmente, la
microinjertación es considerada como una técnica efectiva para obtener plantas libres
de virus y enfermedades asociadas a patógenos como bacterias, hongos y nematodos
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(Zamora-Rodríguez et al., 2015; Hussain et al., 2015; de Lima Coutinho et al., 2009; do
Rego et al., 2008; Rodrigo y Ascarrunz, 2006; Amiri, 2006a).
También es un método que puede ser empleado para el diagnóstico temprano de
enfermedades virales debido a su establecimiento en condiciones in vitro, además de
incompatibilidades entre patrones y copas (Tangolar et al., 2003). Adicionalmente, la
microinjertación ha sido usada para estudios histológicos, para la eliminación de virus,
producción de plantas libres de enfermedades particularmente resistentes a
enfermedades cuyos agentes causantes habitan en el suelo, intercambio de
germoplasma entre países y multiplicaciones de plantas con dificultades en
enraizamiento (Zamora-Rodríguez et al., 2015; Hussain et al., 2015; Yildirim et al.,
2010; Hsina y El Mtili, 2009; Mathius et al., 2008; Materan et al., 2008; Estrada-Luna,
2002).
La microinjertación es particularmente empleada en la producción de frutales, para los
cuales se han desarrollado varios protocolos, entre ellos: almendra (Yıldırım et al.,
2013; Isıkalan et al., 2011), manzano (Huang y Millikan, 1980), albaricoque (Piagnani et
al., 2006), aguacate (Raharjo y Litz, 2003), marañón (Mneney y Mantell, 2001), cereza
(Amiri, 2006a), ciruela (Amiri, 2006b) uva (Tangolar et al., 2003; Aazami y Bagher,
2010), pera (Faggioli et al., 1997), pistacho (Abousalim y Mantell, 1992), nuez (Wang et
al., 2010), maracuyá (Ribeiro et al., 2015), papaya (Nava et al., 2011), entre otras. Otras
especies como tomate (do Rego et al., 2008), chachafruto (Bonilla, 2014), pino
(Materan et al., 2008; Cortizo et al., 2004), tabaco (Fragoso et al., 2011), arabidopsis
(Turnbull et al., 2002), entre otras, usan la microinjertación como una herramienta para
el control de patógenos, eliminación de virus, reactivación de clones élite y estudios de
señalización celular. Adicionalmente, para la comercialización de plantas
microinjertadas, se han generado protocolos exitosos que han proporcionado un alto
porcentaje de plantas microinjertadas con altos rendimientos (Tabla 1).
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Tabla 1. Especies microinjertadas a gran escala (Tomado y modificado de Hussain et al., 2014).
Nº Cultivo Porcentaje de éxito en microinjertación (%) Fuente
1 Pistacho 79,2 Onay et al. (2004)
2 Pistacho 94-100 Abousalim y Mantell (1992)
3 Mora >90 Ma et al. (1996)
4 Olivo 45-83 Farahani et al. (2011)
5 Vid 50,1-60,6 Aazami y Bagher (2010)
6 Vid 71,4 – 80,0 Tangolar et al. (2003)
7 Manzano 42,25 Mushtaq (2009)
8 Avellana 72 Nas y Read (2003)
9 Castaña 80 Nas y Read (2003)
10 Nuez 56,7-73,3 Wang et al. (2010)
11 Almendras 90-100 Yildirim et al. (2010)
12 Almendras 90 Isıkalan et al. (2011)
13 Cítricos 36-33,3 Naz et al. (2007)
14 Pera 83 Hassanen (2013)
De acuerdo con lo descrito por Hussain et al. (2015), el éxito en la microinjertación
puede ser afectado por factores como la edad de los materiales, la técnica de
injertación, las condiciones de esterilidad, la concentración y la aplicación de hormonas
o las condiciones del medio. En este mismo sentido, Rehman y Gill (2015) y Rodrigo y
Ascarrunz (2006), plantean que factores como: la compatibilidad o afinidad entre patrón
y copa; condiciones favorables de humedad, temperatura y aireación; contacto o
estrecha proximidad de las capas del cambium entre patrón y copa; la rigidez mecánica
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para mantener la posición de ambos hasta que se forme la unión; la edad del injerto y
del patrón, deben ser considerados. También, el origen y la longitud de la copa, la edad
del patrón, el medio empleado, el método de injertación, la vitrificación y pre-
tratamientos con reguladores de crecimiento se consideran importantes, ya que regulan
y determinan el éxito del microinjerto.
Para el establecimiento de un microinjerto, Hussain et al. (2015) y Rodrigo y Ascarrunz
(2006), reportan tres fases: 1. el establecimiento y multiplicación de la copa, 2. el
establecimiento y multiplicación del patrón y 3. preparación de patrones y copas para la
microinjertación. Como resultado del proceso de injertación in vitro, se espera
encontrar: la adhesión patrón-copa, formación de callo, diferenciación de las células del
callo hacia nuevo cambium y la formación de nuevos tejidos vasculares (xilema y
floema) por el nuevo cambium (Ribeiro et al., 2015; Hussain et al., 2015; Rodrigo y
Ascarrunz, 2006).
1. Establecimiento y multiplicación de la copa
Como copas pueden ser empleadas brotes o meristemos que pueden ser tomados de
plantas creciendo en invernaderos, cámaras de crecimiento, campo o in vitro.
Generalmente los brotes apicales o los cortes nodales son los más usados como
explantes para el establecimiento in vitro. Posterior al establecimiento, los microbrotes
se transfieren a medio de proliferación para incrementar el desarrollo de nuevos brotes
axilares; estos nuevos microbrotes son usados como copas para los microinjertos.
2. Establicimiento y multiplicación de patrones
Los patrones usados para microinjertación pueden ser in vivo o in vitro a partir de
semillas, brotes germinados o brotes micropropagados enraizados o no enraizados.
Cuando son usados brotes como patrones, todas las fases de la injertación se realizan
in vitro.
3. Preparación de los patrones y las copas para la microinjertación
La microinjertación es afectada por el corte del ápice de los brotes y de los patrones.
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Usualmente el corte se hace en la base de los cotiledones y un pequeño brote es
ubicado como copa en el sitio de corte; en este punto, es importante que las capas del
cambium o los anillos del tejido vascular coincidan en las dos porciones. Esto se
conoce como método de reemplazo de superficie. El contacto firme entre el patrón y la
copa es extremadamente importante para garantizar la unión perfecta del injerto y la
formación de callo. Para mantener la unión del injerto, han sido desarrolladas varias
técnicas como tubo de silicona, tira elástica, puente de papel filtro, tubo de vidrio,
bandas de nilon, tubo de papel aluminio, doble capa de papel aluminio, y papel
absorbente (Hussain et al., 2015). Cuando los injertos son exitosos, los patrones y las
copas crecen juntos y tienen la capacidad de generar una planta.
El presente proyecto plantea el uso de la microinjertación como una herramienta para el
control de la Marchitez vascular en el cultivo de tomate. La siguiente Tabla (Tabla 2)
compara las características más importantes de la injertación y la microinjertación con el
objeto de evidenciar la participación de la microinjertación como una herramienta que
puede favorecer la producción de tomate en nuestra región y el país.
Tabla 2. Comparación entre injertación y microinjertación.
Característica del método Injertación
in vivo
Injertación in vitro
(Microinjertación)
Usos y aplicaciones:
Perpetúa clones que no producen semilla o no se reproducen por estacas. Si Si
Permite establecer en corto tiempo una plantación con fines comerciales.
Si No*
Permite renovar árboles viejos. Si Si
Permite reproducir plantas con alta productividad y calidad de frutos. Si Si
Permite controlar enfermedades. Si Si
Empleado para rescate de embriones. No Si
Permite realizar estudios tempranos de compatibilidad. No Si
Empleado para el intercambio y conservación de germoplasmas. No Si
Empleado para la propagación de plantas con problemas de enraizamiento. Si Si
Dependiente de:
La afinidad entre patrón y copa. Si Si
El método para evitar desecación y contaminación. Si No
(Condiciones controladas in vitro)
El método de injertación empleado. Si Si
Del tipo, edad, origen y características propias del patrón y la copa. Si Si
Personal entrenado. Si Si
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Otros
Requiere espacios y equipos especializados No Si
Incremento de costos en la producción Si
($ 800/planta)
Si (Valor no conocido
aún)**
Sanidad totalmente controlada No (Dependiente del
personal y uso de herramientas) ***
Si (in vitro)
Tasa de éxito en la injertación 90-99% 80%-90%
Costos elevados para la producción de las copas y patrones Compra de semilla
Producción por micropropagación
Mantenimiento de la identidad genética No (Producción de copas y patrones por semilla)
Si (Producción de copas y patrones vía micropropagación)
* Se reporta el establecimiento comercial para frutales especialmente, los descritos en la Talab 1, sin embargo no se tiene reporte de área cultivada bajo este método. ** Se estima que los costos de la producción puedan ser altos, pero aún no se tiene reporte del valor exacto. Se espera lograrlo al final de este proyecto para poder analizar el costo/beneficio de la técnica propuesta. *** Es importante mencionar que la no dependencia de factores ambientales y la esterilidad del material vegetal durante el proceso, puede facilitar la producción de microinjertos. 4.3 Objetivos
Objetivo general
Evaluar bajo condiciones semicontroladas tomate microinjertado contra Fusarium
oxysporum f. sp. lycopersici causante de la Marchitez vascular.
Objetivos específicos
1. Establecer la metodología para la microinjertación de introducciones de tomate tipo
cereza promisorios contra Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici con copas de tomate
comercial.
2. Realizar un estudio morfo-histológico tanto del patrón como de la copa y del
microinjerto para conocer sus estructuras vasculares, previo y posterior al proceso de
microinjertación.
3. Determinar las condiciones óptimas de crecimiento y esporulación de Fusarium
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oxysporum f. sp. lycopersici y su caracterización morfológica.
4. Evaluar bajo condiciones semicontroladas tomate microinjertado contra Fusarium
oxysporum f. sp. lycopersici.
4.4 Metodología propuesta
Fuente de material vegetal:
Los patrones son provenientes del banco de germoplasma de la Universidad Nacional
de Colombia, sede Palmira identificados como las accesiones *IAC426, *IAC391 y
*IAC412 y las copas serán dos, las variedades comerciales Calima y Carguero. Como
controles se tendrán un control susceptible, la introducción *IAC1624 y un control
resistente, Multifort (DeRuiter) (Tabla 3).
Tabla 3. Material vegetal.
* IAC: Introducciones procedentes del Instituto Agronómico de Campinas, Campinas, Brasil.
Introducciones Uso Origen
*IAC 426
Patrones Banco de germoplasma de la
Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira
*IAC412
*IAC 391
Calima Copas
Uso comercial Carguero
Multifort (DeRuiter) Control resistente
*IAC1624 Control susceptible Banco de germoplasma de la Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira
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Localización
El establecimiento metodológico in vitro y la microinjertación se llevará a cabo en el
laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales. El crecimiento de Fusarium oxysporum f.
sp. lycopersici, su esporulación y caracterización morfológica será realizado en el
laboratorio de Fitopatología de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad
de Caldas. La evaluación de tomate microinjertado contra Fusarium oxysporum f. sp.
lycopersici bajo condiciones semicontroladas se realizará en la granja Montelindo de la
Universidad de Caldas, situada en la vereda Santágueda, municipio de Palestina
(Caldas), con una temperatura media de 22.8 °C, una altura de 1.010 msnm,
precipitación promedio anual de 2.200 mm y una humedad relativa de 76 %.
1. Metodología para la microinjertación in vitro de introducciones de tomate tipo
cereza promisorias contra Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici con copas de
tomates comerciales.
a. Establecimiento in vitro de las introducciones de tomate seleccionadas.
Desinfección, germinación y micropropagación de las semillas de tomate
seleccionadas:
Para la desinfección y germinación, semillas de tres introducciones de tomate tipo
cereza (IAC426, IAC391 y IAC412), dos materiales de tomate comercial (Calima y
Carguero) y los controles (IAC1624 y Multifort (DeRuiter), serán sometidas al protocolo
propuesto por Chetty et al. (2013), con algunas modificaciones así:
1. Las semillas de tomate serán ubicadas en un tubo Falcon de 50 mL de capacidad.
2. Se adicionará a las semillas una solución de hipoclorito de sodio al 10% (preparado a
partir de Clorox comercial al 5%) con dos gotas de Tween-20.
3. Se agitará el tubo que contiene las semillas en un agitador magnético a 100 rpm
durante 20 min.
4. La solución de hipoclorito de sodio será removida de la semilla con abundante agua
destilada estéril.
5. Las semillas serán almacenadas en agua destilada estéril durante 24 h a 4 ºC.
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6. Posteriormente, se sembrarán las semillas en frascos de vidrio que contendrán 25
mL del medio de germinación sólido (MGT) compuesto por un medio basal Murashige &
Skoog (MS) (Murashige & Skoog, 1962) con sales a la mitad de la concentración
suplementado con sacarosa al 1% y Vitaminas B5 (Gamborg et al., 1968).
7. Posterior a la siembra, las semillas serán llevadas a un cuarto de crecimiento entre
23 y 25 °C durante 7 días, bajo una intensidad de luz de 70 microeinsteins m-2s-2 con un
fotoperiodo luz/oscuridad de 16/8h.
Después de la germinación de las semillas in vitro, segmentos internodales de plántulas
de tomate de un mes de edad serán extraídos y cultivados en el medio de
micropropagación (MMT), modificado de Chetty et al. (2013), el cual consiste en un
medio basal MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con sacarosa 3%, vitaminas
MS, mioinositol, 2 mg/L de bencil amino purina (BAP) y 0,05 mg/L de ácido indol acético
(AIA). Posteriormente, serán incubadas en un cuarto de crecimiento entre 23 y 25 °C,
bajo una intensidad de luz de 70 microeinsteins m-2s-2 con un fotoperiodo luz/oscuridad
de 16/8h. Las plantas serán subcultivadas cada cuatro semanas. Para el
enraizamiento, las plantas serán transferidas a medio basal MS con sales a la mitad de
la concentración, suplementado con sacarosa 3%, vitaminas MS, mioinositol y 0,05
mg/L de ácido indol butírico (AIB) y serán incubados en cuarto de crecimiento en las
condiciones descritas previamente.
Los siete materiales de tomate (tres silvestres, dos comerciales y dos controles) serán
dispuestos en un diseño experimental completamente al azar (CAA) con 10
repeticiones. Cada semilla será incubada en un frasco de cultivo con 25 mL de medio,
siendo cada frasco la unidad experimental. Como variables de respuesta se
determinará el porcentaje de contaminación (PC), porcentaje de germinación (PG),
número de brotes por explante (NBE), día a inducción de brote/explante (DBE)
porcentaje de plantas enraizadas (PPE), días a germinación (DG), días a cotiledón (DC)
y días a morfogénesis completa (DMC). Los datos de cada variable en cada fase
experimental serán analizados a través de análisis de varianza y pruebas de promedio
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tipo Duncan por medio del programa PROC GLM de SAS (SAS Inst, Cary N.C). Versión
9.0. (2010).
b. Microinjertación:
Los materiales de tomate seleccionados y previamente germinados y micropropagados,
serán sometidos a microinjertación empleando dos métodos; púa terminal y corte en
bisel. Los explantes empleados para la microinjertación serán extraídos de plantas de
30 días de germinadas, y serán sembrados en el medio propuesto por do Rego et al.
(2008) y de Lima Coutinho et al. (2009), el cual se caracteriza por ser un medio MS
basal con sales a 1/8 de la concentración. Adicionalmente, para evitar procesos de
oxidación y favorecer la promoción y formación de callo en el sitio de unión, después
del corte, cada explante (copa y patrón) será sumergido por 10 segundos en una
solución antioxidante constituida por 100 mg/L de ácido ascórbico + 100 mg/L de ácido
cítrico (Ribeiro et al., 2015; Hsina y El Mtili, 2009). Posteriormente, los microinjertos
serán transferidos al cuarto de crecimiento bajo una temperatura de 23 - 25 °C donde
serán sometidos a oscuridad durante dos semanas con el fin de disminuir el posible
efecto de oxidación y favorecer la formación de callo en el sitio de unión.
Posteriormente serán expuestos a una intensidad de luz de 70 microeinsteins m-2s-2 con
un fotoperiodo luz/oscuridad de 16/8h por un tiempo de ocho semanas. Finalmente,
las plantas microinjertadas serán transferidas al cuarto de aclimatación de la
Universidad de Caldas para su posterior aclimatación.
Los microinjertos serán distribuidos en un diseño experimental completamente al azar
(CAA) con cinco repeticiones. Cada microinjerto será incubado en un frasco de cultivo
con 25 ml de medio, siendo cada frasco la unidad experimental. Como variables de
respuesta se determinará el porcentaje de prendimiento del brote microinjertado (PPB),
crecimiento de la yema (CY), día a morfogénesis completa (DMC), número de
internodos por explante (NIE), altura de la plántula microinjertada (copa y patrón)
(APM). Los datos de cada variable en esta fase experimental serán analizados a través
de análisis de varianza y pruebas de promedio tipo Duncan por medio del programa
PROC GLM de SAS (SAS Inst, Cary N.C). Versión 9.0 (2010).
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c. Aclimatación:
Los microinjertos serán transferidos a bandejas previamente esterilizadas que
contendrán turba Sphagnum grado 3 estéril, las bandejas serán cubiertas con domos
transparentes (cámaras para aclimatación) para el mantenimiento de la humedad.
Gradualmente, se les incrementará el intercambio gaseoso mediante el retiro del domo.
Las plántulas serán transferidas al cuarto de aclimatación a una temperatura constante
de 25-27 oC, con un fotoperiodo luz/oscuridad de 16/8h durante cinco semanas.
Durante esta fase, los microinjertos serán distribuidos en un diseño experimental
completamente al azar (CAA) con cinco repeticiones. Las variables a evaluar serán: el
porcentaje de plantas aclimatadas (PPA), porcentaje de supervivencia (PS), la
inducción de nuevos brotes (INB) y el tiempo a trasplante (TT). Estos resultados serán
analizados a través de análisis de varianza y pruebas de promedio tipo Duncan por
medio del programa PROC GLM de SAS (SAS Inst, Cary N.C). Versión 9.0 (2010).
Con el fin de evidenciar a nivel celular los cambios morfológicos y anatómicos en el
proceso de aclimatación, se hará un análisis histológico, en el cual se evaluará la
estructura estomatal, el engrosamiento de la cutícula y de los haces vasculares y el
incremento en las células de empalizada, de acuerdo a la metodología propuesta por
Ribeiro et al. (2015), Hurtado (2013) y Mathius (2008).
2. Estudio morfo-histológico tanto del patrón como de la copa y el microinjerto
para conocer sus estructuras vasculares, previo y posterior al proceso de
microinjertación.
Se empleará la metodología descrita por Ribeiro et al. (2015), Hurtado (2013) y Mathius
(2008), para lo cual, se tomarán muestras aleatorias que serán fijadas en formaldehido
(FAA) al 50% durante 48h al vacío. Las muestras serán porciones de la copa, del patrón
y del microinjerto después de 10, 15, 20 y 30 días de microinjertar.
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A continuación, estas muestras serán transferidas a etanol al 70% V/V , donde
permanecerán almacenados y serán sometidas al vacío nuevamente durante 24 horas.
Las muestras serán deshidratadas en una serie de etanoles al 50%, 70%, 80%, 90%,
95% y 100% y posteriormente embebidas en metacrilato (Historesin®, Leica).
Se harán cortes longitudinales de 8-10 mm de espesor por medio de micrótomo; los
cortes serán teñidos con azul de toluidina pH 4.0 y montados en resina sintética
(Permount Fisher®). La documentación fotográfica se realizará utilizando el
microscopio Olympus AX70 conectado a un sistema de fotomicrografía Olympus del
Laboratorio de Biología, de la Universidad de Caldas.
Se observarán las estructuras vasculares tanto en el parón como en la copa. En los
microinjertos se evaluará la formación de callo en tejido parenquimatoso e inducción,
conexión y engrosamiento de los haces vasculares en el sitio de corte como prueba de
la unión de los explantes (copa-patrón) y prendimiento del microinjerto (Ribeiro et al.
2015; Mathius, 2008).
3. Crecimiento, esporulación, caracterización morfológica y patogenicidad de
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici.
a. Aislamiento y purificación (primero y segundo postulado de Koch):
Se empleará el aislamiento de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici denominado en el
Grupo de Investigación GIPPA como COMBIA, el cuál fue aislado y purificado por
Gonzáles y Marín (2015) y Cardona (2015), de una finca ubicada en la vereda Alto
Bonito del municipio de Neira (Caldas) a partir de plantas de tomate con sintomatología
típica del Marchitamiento vascular.
Es importante mencionar que la selección de este aislamiento se ha realizado con base
en los resultados obtenidos por los anteriores autores, los cuales muestran el alto grado
de virulencia y actividad del patógeno en condiciones in vitro e in vivo. También es
importante resaltar que la caracterización molecular para confirmar y determinar la
especie y raza de este aislamiento (COMBIA) actualmente se lleva a cabo por otro
investigador del grupo.
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b. Crecimiento, esporulación y reactivación:
El aislamiento será sembrado y reactivado bajo tres tratamientos: el primero, será
medio PDA (Papa Dextrosa Agar), el segundo, será agar nutritivo suplementado con
macerado vegetal (3 g/L), y el tercer tratamiento, será el medio PDA suplementado con
macerado vegetal (3 g/L). Serán incubados durante 7 días bajo dos temperaturas
diferentes, 26 1 y 28 1, hasta observar esporulación.
Durante esta fase, los tratamientos serán dispuestos en un diseño experimental
completamente al azar (CAA) con tres repeticiones. Como variables respuesta se
medirá la presencia de estructuras reproductivas (ER), el tiempo de esporulación (TE) y
patogenicidad in vitro (PT). Estos resultados serán analizados a través de análisis de
varianza y pruebas de promedio tipo Duncan por medio del programa PROC GLM de
SAS (SAS Inst, Cary N.C). Versión 9.1 (2010).
Siguiendo la metodología propuesta por Castaño-Zapata y Salazar (1998), se extraerá
micelio del hongo con una aguja de disección y será ubicado en una lámina
portaobjetos con dos gotas de lactofenol al 0,05%. La muestra será observada al
microscopio de luz y microscopio electrónico (MET) para observar las estructuras
propias de Fusarium oxysporum (macroconidios septados, microconidios, en su
mayoría unicelulares y clamidosporas), posteriormente se procederá a hacer la
identificación del microorganismo, mediante las claves taxonómicas y especializadas de
Booth (1970), para Fusarium oxysporum.
c. Prueba de patogenicidad (tercer postulado):
Después de la identificación morfológica se realizarán las pruebas de patogenicidad in
vitro de acuerdo a la metodología planteada por Cardona-Piedraita (2015) y Gonzáles y
Marín (2015), para lo cual plántulas de tomate susceptibles (IAC426, *IAC391 y
*IAC412) al patógeno con una edad de 30 días, obtenidas a partir de semilla germinada
in vitro, se inocularán con 1 mL de suspensión conidial a una concentración de 1 x 106
conidios mL-1
en agua destilada estéril mediante cámara de Neubauer, la cual se
depositará en la base del tallo. Las plántulas serán incubadas en el cuarto de
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termoterapia a 26 - 28 ºC con fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad durante
dos semanas. Para determinar la patogenicidad de Fusarium oxysporum f. sp.
lycopersici, se evaluará la incidencia de la marchitez vascular (IMV) en las plántulas
mediante la aparición paulatina de los síntomas de la enfermedad: necrosamiento y
estrangulamiento del tallo (NET), amarillamiento (AM), marchitez (MT) y muerte (M). La
Incidencia será definida mediante la siguiente fórmula:
IMV = Número de individuos afectados/ total de individuos * 100
d. Re-aislamiento (cuarto postulado):
Siguiendo los postulados de Koch, a continuación se debe re-aislar el patógeno de
plantas enfermas. Para ello, a partir de las plántulas in vitro inoculadas y que
manifiesten la enfermedad con los síntomas descritos previamente se les realizará
cortes longitudinales a los tallos, tomando porciones de tejido de aproximadamente 3
mm de diámetro y serán sembrados en medio PDA, metodología descrita
anteriormente.
Con la comprobación de estos postulados, se tendrá el aislamiento virulento para las
pruebas de campo, objetivo 4.
4. Evaluación de tomate microinjertado contra Fusarium oxysporum f. sp.
lycopersici bajo condiciones semicontroladas.
Esta evaluación se llevará a cabo en la granja Montelindo de la Universidad de Caldas,
situada en la vereda Santágueda, municipio de Palestina (Caldas), con una temperatura
media de 25,8 °C, una altura de 1.010 msnm, precipitación promedio anual de 2.200
mm y una humedad relativa de 76 %.
Se evaluarán seis combinaciones de microinjertos (tres patrones x dos copas). Se
tendrán como controles una variedad resistente a Fusarium oxysporum f. sp.
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lycopersici (Multifort, DeRuiter), como control negativo se tendrá una variedad
susceptible (introducción IAC1624). Adicionalmente se tendrá un control de método de
injertación para descartar la influencia del método (microinjertación) sobre la producción
en el cultivo de tomate y los controles absolutos serán los siete materiales vegetales sin
inocular.
Sistema de producción
Por ser el principal y mejor sistema de producción empleado en el departamento de
Caldas para la producción de tomate, en este proyecto se empleará el sistema de
semitecho + cobertura del suelo con plástico. Este sistema consta básicamente de una
estructura en guadua con una cubierta en plástico transparente tipo Agroclear calibre 6,
a una distancia entre surcos de 1,5 m y entre guaduas para tutorado de 3 m. La
cobertura de plástico será negro-negro calibre 1,2 (Gómez, 2014).
1. Establecimiento del cultivo
a. Preparación del suelo
Una semana antes del trasplante de los microinjertos se realizará la aplicación de un
cebo toxico (1kg de clorpirifos (Lorsban®) en polvo + 50 kg de aserrín + 12 kg de
melaza + 10 L de agua), para el control de trozadores como Spodoptera spp., Agrotis
ipsilon y Gryllus assimilis. Posteriormente, se hará el arado del suelo con azadón a una
profundidad de 30 cm, ya que esta es la profundidad efectiva que necesitan las raíces
de plantas de tomate para su buen desarrollo. Adicionalmente, se hará la incorporación
al suelo de gallinaza y Cal dolomita en las cantidades de 100 g de Cal y 200 g de
gallinaza por metro lineal.
b. Instalación de bolsas y trasplante de los microinjertos
Después de la incorporación de cal y la materia orgánica se realizará la instalación de
las bolsas para cada microinjerto. El mismo suelo preparado anteriormente será
incorporado en bolsas plásticas de 25 cm de alto x 10 cm de diámetro. Esta instalación
de las bolsas se hará con el fin de hacer la inoculación de Fusarium oxysporum f. sp.
lycopersici sin exponer el suelo restante al patógeno.
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Los microinjertos aclimatados serán transferidos a la granja Montelindo, en donde se
ubicarán en un vivero cinco días antes de realizar el trasplante con el objetivo de
fortalecer su aclimatación, teniendo en cuenta que las condiciones climáticas del cuarto
de aclimatación donde se realizó la aclimatación in vitro a ex vitro y la granja son
diferentes. Posterior a esto, se realizará el trasplante de los microinjertos; la distancia
de siembra será de 1,50 m entre surcos y 0,50 m entre plantas para una densidad de
población de 13.333 plantas/ha. La siembra se hará bajo un diseño de bloques
completos al azar con cuatro repeticiones cada uno con tres plantas como unidad
experimental.
Durante el ciclo del cultivo se realizarán labores culturales como podas, desyerbe,
tutorado y fertilización para proporcionarle un buen manejo técnico al cultivo (Gómez,
2014 y Jaramillo et al., 2013).
2. Inoculación de los microinjertos con Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici
Los microinjertos de 14 días después del trasplante, plenamente adaptados a las
condiciones del suelo descritas anteriormente, serán inoculados con una suspensión de
1 x 106 conidios del aislamiento COMBIA de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici /mL
de agua, de acuerdo con la metodología propuesta por integrantes del grupo de
investigación, la cual se encuentra actualmente en desarrollo.
3. Evaluación de los microinjertos contra Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici
Para determinar la respuesta de los microinjertos contra Fusarium oxysporum f. sp.
lycopersici (Fol), durante el ciclo de producción (8 meses) se evaluará la incidencia y
daño de la marchitez vascular y su relación con la producción de tomate de la siguiente
forma:
3.1 Incidencia de la Marchitez Vascular (IMV): se determinará a través de la fórmula:
IMV = Número de individuos afectados/ total de individuos * 100
Para ello se evaluará la presencia de los siguientes síntomas característicos de la
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enfermedad como son el estrangulamiento y necrosamiento del tallo, marchitéz de las
plantas, amarillamiento y muerte.
3.2 Escala de daño de la enfermedad: se determinará de acuerdo a la escala
propuesta por da Silva y Bettiol (2005).
1 = Planta sana.
2 = Planta con vesículas marrón antes de la primera hoja, sin hojas amarillas.
3 = Planta con vesículas marrón hasta la primera hoja, primeras hojas amarillas.
4 = Plantas con coloración marrón hasta la mitad del tallo con coloración amarilla en
más de dos hojas.
5 = Plantas que muestran coloración oscura en el tallo hasta antes de las hojas jóvenes,
con todas las hojas amarillas excepto el último par.
6 = Plantas con todas las hojas amarillas o muertas.
3.3 Evaluación de rendimiento y calidad:
La medición de los caracteres se realizará usando la metodología sugerida por el
International Plant Genetic Resources Institute –IPGRI-, (1996). Todas las
observaciones del fruto se harán en el segundo racimo por planta, en la etapa de plena
madurez. Los caracteres a evaluar serán los siguientes: número de flores/racimo
(NFLR), número de frutos/racimo (NFR), número de racimos/planta (NRP), número de
frutos totales (NFT), peso promedio del fruto (PPF), producción/planta (g/planta) (PDN),
rendimiento (t/ha) y contenido de sólidos solubles (°Brix) (CSS).
Los datos obtenidos de cada variable en esta fase experimental seran analizados bajo
diseños completamente al azar. El análisis univariado de la información de la
evaluación agronómica, se hará mediante análisis de varianza por medio del
procedimiento GLM de SAS (SAS Institute Cary N.C. Versión 9.0. (2010)), para
determinar la ocurrencia de diferencias significativas entre introducciones para el
conjunto de variables cuantitativas evaluadas. Se hará comparación de medias a través
de prueba de partición de promedios ó prueba de Duncan (P < 0,05). Finalmente, se
realizará un análisis de componentes principales y de clasificación conjunta de
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descriptores, a partir de la matriz de combinación de tratamientos (microinjerto x Fol)
con los promedios de las variables previamente obtenidas. Se utilizará el procedimiento
Comprin de SAS (SAS Institute Cary N.C versión 9.0. (2010)).
4.5 Cronograma de actividades:
Actividad 2015-2 2016-1 2016-2 2017-1 2017-2 2018-1 2018-2 2019-1
Preparación del proyecto.
Examen de candidatura.
Establecimiento de la
metodología para la
microinjertación de líneas de
tomate tipo cereza y de
tomates comerciales.
Crecimiento, re-activación,
esporulación y caracterización
morfológica de Fusarium
oxysporum f. sp. lycopersici,
aislamiento COMBIA.
Evaluación de los microinjertos
de tomate contra Fusarium
oxysporum f. sp. lycopersici,
bajo semitecho.
Pasantía internacional.
Preparación del documento final
y publicaciones.
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4.6 Resultados esperados6
- Producción de plantas de tomate tolerantes al Marchitamiento vascular causado por
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, para los productores de tomate del
departamento y otras regiones del país y su introducción en futuros programas de
mejoramiento.
- Protocolos para la desinfección, germinación, micropropagación y microinjertación y
aclimatación de introducciones de tomate tipo cereza.
- Métodos estandarizados para la micropropagación y el mantenimiento in vitro de
genotipos de tomate seleccionados por su tolerancia a Fusarium oxysporum f. sp.
lycopersici para futuros procesos de microinjertación.
- Establecimiento de un método in vitro eficiente para estudios de incidencia de la
Marchitez vascular en diferentes genotipos de tomate.
4.7 Impactos esperados a partir del uso de los resultados
- A futuro, se espera generar un sistema de producción sostenible para los agricultores
y de bajo impacto ambiental mediante el incremento en producción, reducción en el
uso de agroquímicos y de los costos de producción.
- Generación de nuevo conocimiento y su aplicación para el desarrollo de nuevas
variedades de tomate mejoradas para Colombia y el Mundo.
- Fortalecimiento de recurso humano mediante el desarrollo de nuevas destrezas y
habilidades en la tecnología implementada para los involucrados en el proyecto de la
Universidad de Caldas.
- Consolidación del Grupo de investigación GIPPA en el uso de tecnologías de cultivo
de tejidos vegetales con miras al fortalecimiento de los procesos de mejoramiento
genético.
- Formación de un estudiante de Pregrado, uno de Maestría y uno de Doctorado.
- Establecimiento de métodos in vitro para la conservación del germoplasma, y
multiplicación masiva de plantas de tomate.
6 Serán reportados en el informe técnico final (o de avance cuando se requiere prórroga), de acuerdo al formato para
tal fin, disponible en la página web de la Universidad en el link de investigaciones
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- Contribución significativa a la preservación de los recursos genéticos del género
Solanum.
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Anexo 1: Presupuesto
Descripción de los gastos de personal
*Valor correspondiente a pago de matrícula y sostenimiento financiado por Colciencias mediante beca Doctorado Nacional.
Nombre del
Investigador /
Experto/
Auxiliar/estudiante
Formación
Académica
Función
dentro en del
proyecto
Institución o
Empresa
Tipo de
vinculación
DEDICACIÓN
Horas/semana
Fuentes
Total Recursos de
esta
convocatoria
Especie
Nelson Ceballos
Aguirre
PhD. Ciencias
Agrarias
Dirección en pruebas
de campo y análisis
estadístico
Universidad de
Caldas
Docente de
planta 4 horas/semana 4.680.000 37.440.000
Jairo Castaño
Zapata
Ph.D.
Fitopatología
Dirección análisis
fitopatológicos
Universidad de
Caldas
Docente de
planta 4 horas/semana 4.680.000 37.440.000
Dora Janeth
García*
M.Sc.Biología
Molecular y
Biotecnología
Estudiante Doctorado Universidad de
Caldas Estudiante 40 horas/semana 28.002.000 224.016.000
Asistente de
Laboratorio Pregrado
Mantenimiento de
material de
laboratorio,
preparación de
medios
Universidad de
Caldas Asistente 40 horas/semana 7.200.000 28.800.000
Totales
327.696.000
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Descripción de equipos a adquirir
Equipos Justificación
Fuentes Otras fuentes
Total ($) Recursos de esta
convocatoria ($)
Destilador de agua
Requerida para la preparación de
los medios de cultivo necesarios
para el establecimiento de las
plántulas in vitro.
6.380.000 $ 6.380.000
Juego de Micropipetas
Medición de volúmenes con alta
precisión en la preparación de
medios de cultivo y reacciones
químicas.
1.653.000 $1.653.000
Totales $ 8.033.000
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Totales de materiales e insumos
Insumo/Tópico Valor total ($)
Insumos cultivo in vitro e histología 14.400.000
Insumos de campo 16.000.000
TOTAL 30.400.00
Descripción y justificación de viajes
Lugar /No. de viajes Justificación Pasajes
($) Estadía ($) Total días Total ($)
1 Pasantía internacional 7.000.000 27.000.000 6 meses 34.000.000
2 Ponencia Nacional 1.000.000 800.000 8 1.800.000
1 Ponencia Internacional 5.000.000 3.000.000 5 8.000.000
Totales 43.800.000
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Valoración de salidas de campo
Lugar de la Salida : Palestina - Granja Montelindo-
Justificación:
Concepto $ / día No. de salidas No. de personas Total salidas TOTAL ($)
Alimentación 7000 40 3 120 840.000
Alojamiento
Transporte 17.000 40 3 120 2.040.000
TOTAL 2.880.000
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Presupuesto global
Rubros A financiar*
Contrapartida Universidad de Caldas Total
Ejecutora(s)
Equipos 8.033.000 218.961.017 226.994.017
Bibliografía 1.000.000 1.000.000
Personal científico 327.696.000 327.696.000
Materiales e insumos 30.400.000 30.400.000
Servicios técnicos 2.400.000 2.400.000
Salidas de campo 2.880.000 2.880.000
Eventos académicos y pasantía internacional
43.800.000 43.800.000
Publicaciones y patentes 10.000.000 10.000.000
Valor total del proyecto 98.513.000 546.657.017 645.170.017
EL 30% del proyecto se encuentra financiado por Vicerrectoría de Investigaciones de la Universidad de Caldas, a través de
convocatorias internas.
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