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1. Introdução
1.1. Carcinogênese Química
É muito antiga a constatação de que a exposição dos seres humanos a
determinadas substâncias presentes no meio ambiente ou no seu local de trabalho
pode levar ao desenvolvimento de câncer, tendo sido identificadas muitas
substâncias carcinogênicas (MARNETT e PLASTARAS, 2001). Geralmente
decorre um longo período (anos) entre os eventos iniciais (exposição aos
carcinógenos, ocorrência de lesões no DNA e fixação das mutações) e o
surgimento dos tumores (SCHOR e SCHOR, 2001; LOTEM e SACHS, 2002). A
carcinogênese é o resultado do acúmulo progressivo de alterações gênicas
(SCHOR e SCHOR, 2001; MICHOR et al.,2005).
Figura 1.1: Eventos importantes para a carcinogênese química (adaptado de SINGH e
FARMER, 2006).
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A replicação correta do DNA é necessária para a sobrevivência de qualquer
organismo. Em geral essa replicação ocorre com alta fidelidade, porém um erro
espontâneo pode surgir no DNA. A correção desses erros por enzimas de reparo é
essencial para prevenir a mutagênese e a carcinogênese. A presença de lesões no
DNA pode aumentar os erros do processo de replicação e, assim, a freqüência de
mutações (PORELLO et al., 1998; NOLL et al.,1999; BELOUSOVA et al., 2006).
Dessa forma, a lesão no DNA é considerada o primeiro passo importante no
processo de carcinogênese. Carcinógenos químicos podem formar adutos com o
DNA ou induzir outras modificações nessa biomolécula, como o dano oxidativo,
quebras de fitas, rearranjos cromossômicos e deleções de pares de bases (Figura
1.1) (POIRIER, 2004; SINGH e FARMER, 2006).
Para prevenir contra as conseqüências deletérias das lesões em DNA, uma
rede complexa e complementar de mecanismos enzimáticos de reparo dessa
biomolécula evoluiu desde o surgimento da vida na terra. Como exemplo, quebras
de fita-dupla são reparadas por um mecanismo dependente de recombinação
homóloga ou por uma reação que envolve a religação das extremidades da quebra,
enquanto bases que sofreram pequenas alterações estruturais (p.ex. oxidação) são
removidas principalmente pelo sistema de reparo por excisão de bases (BER).
Adutos grandes que provocam distorção da dupla-hélice, como é o caso das lesões
provocadas por vários xenobióticos, são removidos principalmente pelo sistema de
reparo por excisão de nucleotídeos (NER). Entretanto, existe grande sobreposição
na especificidade por substratos entre as várias vias de reparo e, ainda, algumas
proteínas são utilizadas em mais de uma via. A importância das vias de reparo de
DNA para a redução da incidência de câncer tem sido demonstrada nos estudos de
várias doenças humanas que envolvem deficiência em mecanismos de reparo (ex.,
Xeroderma pigmentosum, síndrome de Cockayne) e em modelos de animais
transgênicos (BOER e HOEIJMAKERS, 2000).
Embora as células possuam mecanismos para o reparo de muitos tipos de
danos ao DNA, os mesmos podem não ser completamente efetivos e resíduos
desses danos ao DNA podem levar à inserção incorreta de bases durante a
replicação, seguida pela transcrição e tradução, culminando, por exemplo, na
síntese de proteínas alteradas (POIRIER, 2004).
Como o desenvolvimento de um tumor requer muitos eventos que ocorrem
durante longo período de tempo, a indução de câncer em humanos muitas vezes
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está dentro de um contexto que envolve o ambiente e as substâncias químicas
nele presentes, às quais as pessoas estão expostas ao longo da vida (POIRIER,
2004). O câncer é um dos problemas mais comuns e graves da medicina clínica. É
uma doença que compreende grande variedade de tumores malignos que se
formam pelo mesmo processo básico de crescimento descontrolado. O diagnóstico
e tratamento precoces são vitais e a identificação de pessoas com risco aumentado
de câncer, antes do seu aparecimento, é um objetivo importante de pesquisa
médica (THOMPSON et al., 1993).
Didaticamente, o processo de carcinogênese pode evoluir em três fases: de
iniciação ou celular, de promoção ou tecidual e de progressão ou sistêmica. Na
fase de iniciação, tanto fatores endógenos quanto exógenos podem, por um único
evento, induzir um dano irreversível ao DNA de uma célula. Contudo, um único
evento não é suficiente para induzir uma alteração maligna, necessitando
posteriormente da ação de promotores tumorais. Na fase de promoção ocorre a
expansão clonal da célula transformada, que sofre inúmeras alterações genéticas e
epigenéticas. Freqüentemente os tumores são diagnosticados nessa fase. Os
carcinógenos podem ser agentes iniciadores ou promotores; alguns carcinógenos
são classificados como completos porque atuam como iniciadores e promotores
tumorais ao mesmo tempo (HARRIS, 1991), como é o caso de potentes
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), quando são repetidamente
aplicados em ratos por longo período de tempo. Tais compostos podem induzir
mutações somáticas (fase de iniciação do tumor) e crescimento descontrolado da
célula irreversivelmente transformada (fase de promoção do tumor) (LUCH, 2005).
A maioria dos cânceres surge após genes importantes para o controle do
crescimento celular (proto-oncogenes, genes supressores de tumor) terem sofrido
alterações pelos carcinógenos ou por erros durante a replicação do DNA e o reparo
das lesões. A divisão das células lesadas transmite as mutações às células-filhas,
originando um “clone” de células alteradas (COUPIER e PUJOL, 2005). Ao menos
seis alterações essenciais na fisiologia celular são necessárias para que ocorra
malignidade: tumor com auto-suficiência de crescimento; com insensibilidade a
fatores inibitórios de crescimento; com potencial de replicação ilimitado; com meios
de escapar à morte celular; com capacidade de manter a angiogênese; invasão e
metástase tecidual (ZHIVOTOVSKY e ORRENIUS, 2003; DIXON e KOPRAS,
2004).
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Em geral, substâncias eletrofílicas de origem exógena e endógena são
capazes de alterar o DNA e outros componentes celulares, levando a lesões
mutagênicas (MARNETT e PLASTARAS, 2001; GARCEA et al., 2003; LIU et al.,
2005). Algumas dessas modificações covalentes às bases do DNA têm sido
relacionadas ao processo de carcinogênese (KAWAI et al., 2004).
1.2. Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs)
Os HPAs constituem uma classe de diversos compostos orgânicos (figura
1.2) que contêm dois ou mais anéis aromáticos fundidos, constituídos de átomos
de carbono e hidrogênio, formados a partir da combustão incompleta de matéria
orgânica (WORLD HEALTH ORGANISATION, 1996; NETTO et al., 2000). Os tipos
de HPAs formados estão mais relacionados às condições de combustão do que ao
tipo de material orgânico queimado (BJORSETH e RAMDAHL, 1985). Essa
formação se baseia em dois mecanismos básicos: pirólise ou combustão
incompleta e processos de carbonização. São moléculas-chaves na química, física
e biologia pelo fato de estarem relacionadas com o surgimento da vida na Terra, há
cerca de 3,5 x 109 anos (DELEUZE, 2004).
As principais fontes de HPAs são: processos industriais (produção de
alumínio, coque, eletrodos de carbono, produção e fundição de ferro e aço),
exaustão de motores a diesel ou gasolina, incêndios em florestas, queima de
carvão, fotocopiadoras, exaustão de incineradores de rejeitos, fumaça de cigarro e
degradação do petróleo por ação de alguns microorganismos presentes no meio
ambiente, tais como algas e bactérias (WORLD HEALTH ORGANISATION, 1996;
NETTO et al., 2000; PERERA et al., 2005). Em geral, HPAs de baixo peso
molecular (com 2-3 anéis aromáticos) são derivados principalmente de produtos do
petróleo, combustão incompleta de material orgânico, entre outros; enquanto que
procedimentos pirogênicos geram principalmente HPAs de alto peso molecular
(com 4 ou mais anéis aromáticos) (LIU et al., 2006).
São sólidos à temperatura ambiente e em geral apresentam elevados pontos
de fusão e ebulição. São solúveis em solventes orgânicos, altamente lipofílicos e
quimicamente estáveis, sendo biodegradados lentamente sob condições aeróbicas
e dificilmente hidrolisados no meio ambiente (FIALA et al., 1999; SAMANTA et al.,
2002). Sua volatilidade diminui com o aumento do peso molecular. Assim, podem
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ser encontrados tanto na fase gasosa quanto adsorvidos a partículas atmosféricas
e do solo. Também podem ser depositados sobre grãos, vegetais e frutas (DENNIS
et al., 1991; VOUTSA e SÂMARA 1998; KIPOPOULOU e SAMARA, 1999) e ser
formados no processo de cozimento de alimentos, tais como carnes assadas na
brasa (JÒGERSTAD e SKOG., 2005), alimentos defumados (FALCÓN et al., 1999;
MORET et al., 1999; OKONA-MENSAH et al., 2005), óleos e gorduras (TOLEDO e
CAMARGO, 1998). Devido à sua baixa hidrossolubilidade e alta afinidade por
material particulado, geralmente se depositam em sedimentos quando lançados na
água. Estão, portanto, presentes como contaminantes do ar, alimentos, solo e água
(WORLD HEALTH ORGANISATION, 1996; RÉ-POPPI e SANTIAGO-SILVA, 2005;
HSIEH et al., 2006). Devido à sua grande distribuição ambiental e ao seu caráter
lipofílico, a contaminação humana por essas substâncias pode ocorrer por
absorção pela pele, ingestão ou inalação, sendo rapidamente distribuídas pelo
organismo (NETTO et al., 2000).
A distribuição ambiental desses compostos tornou-se preocupante à medida
que estudos epidemiológicos passaram a associar a exposição aos HPAs com
aumento na incidência de câncer (BOFFETTA et al., 1997; OKONA-MENSAH et
al., 2005; RÉ-POPPI e SANTIAGO-SILVA, 2005). Assim, trabalhadores expostos
apresentaram maior risco de desenvolvimento de câncer de pulmão, pele, bexiga e
próstata (BOFFETTA et al., 1997) e o risco de desenvolvimento de câncer de
pulmão em áreas urbanas mostrou-se ~1,5 vezes maior que em áreas rurais
(KATSOUYANNI e PERSHAGEN, 1997). Em geral, as concentrações de HPAs em
áreas urbanas tendem a ser de uma a duas ordens de magnitude maior que em
áreas rurais (WORLD HEALTH ORGANISATION, 1996). Estudos realizados em
diversas partes do mundo têm também associado o consumo de alimentos
contendo HPAs à etiologia de processos carcinogênicos, mutagênicos e citotóxicos
no ser humano (PHILLIPS, 1999).
Muitos HPAs são mutagênicos em bactérias e células humanas,
carcinogênicos em animais experimentais e, portanto, suspeitos de terem um papel
na etiologia de muitos cânceres humanos (BIGGER et al., 2000). De fato, alguns
HPAs são classificados como prováveis ou possíveis carcinógenos humanos
(grupos 2A e 2B da IARC): benz[a]antraceno, os benzo[b,j,k]fluorantenos, o
benzo[a]pireno, o dibenz[a,h]antraceno, os dibenzo pirenos, o indeno[1,2,3-
cd]pireno e o 5-metilcriseno (IARC, 1983). Tais substâncias não exercem seus
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efeitos genotóxicos diretamente, mas necessitam de uma ativação metabólica para
intermediários eletrofílicos reativos que, então, levam a lesões no DNA e outras
biomoléculas. O antantreno foi considerado mutagênico em testes de curta duração
realizados em bactérias e exibiu carcinogenicidade de pele após longo tempo de
aplicação tópica empregando o protocolo de iniciação-promoção em camundongos
(SCRIBNER, 1973; JARED et al., 2005) bem como carcinogenicidade em pulmão
de ratos. Porém em muitos estudos epidemiológicos em humanos o antantreno não
mostrou nenhuma atividade carcinogênica. Dessa forma, após avaliação dos dados
experimentais, a Agência Internacional para Pesquisa do Câncer “IARC” concluiu
que “há limitadas evidências de carcinogenicidade do antantreno em animais
experimentais” enquanto que as evidências para a sua mutagenicidade são
consideradas como “inadequadas” (PLATT et al.,2002).
Um dos processos de biotransformação desses compostos envolve a
epoxidação de duplas ligações (uma reação catalisada por monooxigenases
dependentes de citocromo P450 (CYP450)), o rearranjo ou hidratação de epóxidos
a fenóis ou dióis, e a conjugação do derivado oxidado com moléculas endógenas
(ácido glicurônico, sulfato, glutationa). Produtos da oxidação de HPAs por esse
sistema enzimático (epóxidos, diol-epóxidos) são altamente reativos e formam
adutos com o DNA, podendo ser iniciadores de tumores (WEINSTEIN et al., 1976;
MASTRANGELO et al., 1997; WORLD HEALTH ORGANISATION, 1996; DREIJ et
al., 2005). É válido lembrar que o desenvolvimento de um tumor depende de vários
fatores, dentre eles a via de administração, a freqüência e o tempo de exposição
ao agente. Diversos tecidos podem metabolizar os HPAs, tornando-se órgãos
alvos, ou os metabólitos formados em um tecido (ex. fígado) podem ser
transportados para outros tecidos do organismo pela circulação (IARC, 1983;
WORLD HEALTH ORGANISATION, 1996; GOLDMAN et al., 2001).
Risco aumentado de mortalidade devida à exposição a material particulado
presente no ar também tem sido relatado (POPE et al., 2002; OKONA-MENSAH et
al., 2005) e, entre indivíduos expostos ocupacionalmente a HPAs, foi verificado
aumento significativo de 1-hidroxipireno urinário (HU et al., 2006), que é um
marcador biológico muito utilizado para verificar a exposição a pireno (MALKIN et
al., 1996; GRIMMER et al., 1997; ROGGI et al., 1997; POPP et al., 1997;
MIELYNSKA et al., 1997; DOR et al., 2000; LAFONTAINE et al., 2000; ACGIH.,
2003). Porém, há controvérsias na literatura quanto ao uso do 1-hidroxipireno
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urinário, devido a polimorfismo do CYP1A1, diferenças relacionadas ao sexo e
ainda a falta de qualquer correlação entre a ingesta de HPAs e a exceção de 1-
hidroxipireno urinário para avaliar risco de desenvolvimento de doenças por
exposição a esses contaminantes (MERLO et al., 1998; SCHOKET et al., 1999;
SCHERER et al., 2000; SORENSEN et al., 2003). Faz-se, portanto, necessária a
investigação de novos biomarcadores que possam fornecer informações mais
diretas quanto ao risco à saúde relacionado com a exposição (WORLD HEALTH
ORGANISATION, 1996).
Figura 1.2: Estruturas de alguns hidrocarbonetos policíclicos aromáticos.
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1.3. Biotransformação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) e
lesões em DNA
Os HPAs são ativados enzimaticamente para metabólitos intermediários
reativos que atacam o DNA, formando adutos ou levando a algum dano oxidativo,
resultando em mutações que podem aumentar o risco de desenvolvimento de
tumores (OESCH et al., 2003; DAI et al., 2005).
As vias de ativação atualmente consideradas mais importantes incluem (i) a
formação de um diol-epóxido nas regiões de baía ou fjord dos HPAs através de
sucessivas epoxidações catalisadas por CYP450, com uma hidrólise intermediária
catalisada pela epóxido hidrolase microssomal (JOSEPHY et al., 1997; XUE e
WARSHAWSKY, 2005) e (ii) oxidação de um elétron catalisada enzimaticamente
(CYP450 ou peroxidases) levando à formação de um cátion radical reativo
(CAVALIERI e ROGAN, 1995; XUE e WARSHAWSKY, 2005). Outras vias de
ativação correspondem à formação de derivados metilados (FLESHER e MYERS,
1990; XUE e WARSHAWSKY, 2005), o-quinonas (McCOULL et al., 1999; XUE e
WARSHAWSKY, 2005) e metabólitos de anel aberto (YANG et al., 2000) cujas
contribuições para a carcinogênese ainda são pouco estudadas (Figuras 1.3 e
1.4).
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Figura 1.3: Algumas vias de ativação metabólica dos HPAs. (i) região de baía e fjord dos
HPAs benzo[a]pireno e dibenzo[a,l]pireno respectivamente, (ii) formação de um diol-
epóxido nas regiões de baía ou fjord dos HPAs através de sucessivas epoxidações
catalisadas por CYP450, com uma hidrólise intermediária catalisada pela epóxido hidrolase
microssomal e (iii) oxidação de um elétron catalisada enzimaticamente (CYP450 ou
peroxidases). (Abreviações: B[a]P, benzopireno; B[a]P-7,8-óxido, benzopireno-7,8-óxido;
B[a]P-7,8-diol; BPDE, benzopireno-diol-epóxido; HPA, hidrocarboneto policiclico
aromático).
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Figura 1.4: Ativação metabólica de HPAs por aldo-ceto redutases e formação de espécies
reativas de oxigênio (adaptado de PARK et al., 2005). (Abreviações: CYP1A1, citocromo
P450 1A1, (+) anti-BPDE, (+) anti-benzopireno-diol-epóxido; NAD(P)+, Nicotinamida
adenina dinucleotídeo fosfato (forma oxidada); NAD(P)H Nicotinamida adenina
dinucleotídeo fosfato (forma reduzida); O2-, Ânion radical superóxido; H2O2, peróxido de
hidrogênio; O2, oxigênio molecular).
Citocromos P450 constituem uma superfamília de proteínas heme que
catalisam a oxidação de várias moléculas endógenas e exógenas. CYP450
pertencentes às famílias 1, 2 e 3 são particularmente importantes para o
metabolismo de HPAs (WORLD HEALTH ORGANISATION, 1996; STEGEMAN et
al., 2001). Adutos resultantes da reação de diol-epóxidos de alguns HPAs com o
grupo amino exocíclico de 2’-desoxiadenosina (dA) e 2’-desoxiguanosina (dG)
foram estruturalmente caracterizados e são considerados importantes na
tumorigênese induzida por esses compostos (XUE e WARSHAWSKY, 2005).
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Assim, o potente carcinógeno, largamente distribuído e extensivamente estudado
benzo[a]pireno (BP) é metabolizado em células de mamífero para (+)-anti-B[a]P-
7,8-diol-9,10-epóxido (BPDE), que reage principalmente com dG no DNA
originando o aduto BPDE-dG (CHENG et al., 1989). Reações de diol-epóxidos do
7,12-dimetilbenz[a]antraceno, dibenzo[a,l]pireno, benzo[c]fenantreno,
benzo[g]criseno, benzo[c]criseno, criseno e benzo[ghi]fluoranteno com dG e dA em
DNA in vitro, células de mamífero ou animais experimentais também foram
descritas, tendo sido verificada uma correlação entre o potencial carcinogênico
desses compostos e a formação de adutos estáveis com o DNA (MELENDEZ-
COLON et al., 2000). Um crescente interesse nessa área se deve às verificações
de que os diol-epóxidos derivados de HPAs contendo a região de fjord
estericamente impedida (como o benzo[c]fenantreno, o 5,6-dimetilcriseno e o
dibenzo[a,l]pireno) são excepcionalmente mutagênicos e tumorigênicos e levam a
um nível maior de adutos com o DNA em relação aos derivados de análogos
menos impedidos, como criseno e BP (revisado por CHANG et al., 2002b e
PUFULETE et al., 2004). Apesar de haver um grande foco no estudo do BP, a sua
contribuição para a carcinogênese de misturas contendo HPAs foi estimada como
sendo de 0,17 a 4% (GRIMMER et al., 1997). Detalhes estruturais e mecanísticos
das interações de diol-epóxidos de HPAs com o DNA, buscando o entendimento de
uma relação estrutura-função, estão começando a ser investigados (CHANG et al.,
2002a,b).
Como mostrado na figura 1.4, aldo-ceto redutases podem catalisar a
formação de catecóis a partir de dihidrodióis resultantes de uma epoxidação inicial.
Uma vez oxidados, os catecóis originam o-semiquinonas, que transferem elétrons
para o oxigênio molecular e dão origem a o-quinonas. Nesse processo, espécies
reativas de oxigênio (ROS) são geradas, as quais podem causar dano oxidativo ao
DNA e outras biomoléculas. Os catecóis, o-semiquinonas e o-quinonas participam
de ciclos redox, levando à geração de grandes quantidades de ROS. Além disso,
o-quinonas podem se ligar a biomoléculas, levando à formação de adutos
(CAVALIERI et al., 1995; PARK et al., 2005).
A outra via de ativação metabólica dos HPAs, que tem sido bastante
investigada nos últimos anos, é a oxidação de um elétron catalisada
enzimaticamente, com subseqüente formação de um cátion radical que reage com
o DNA (nas posições C-8 ou N-7 da guanina e N-3 ou N-7 da adenina) levando à
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formação de adutos que desestabilizam a ligação glicosídica com o esqueleto
desoxirribose fosfato, havendo depurinação (BHATTACHARYA et al., 2003).
A discussão a respeito dos mecanismos responsáveis pela tumorigênese
devida aos HPAs torna-se mais complexa ao se verificar que compostos que não
apresentam a região de baía ou fjord, como o antantreno, o coroneno, o
ciclopenta[cd]pireno e o benzo[ghi]perileno são mutagênicos e carcinogênicos
(FLORIN et al., 1980; HSU et al., 1999; PLATT et al., 2002; PLATT e GRUPE,
2005). A mutagenicidade do antantreno em bactérias após ativação metabólica é
comparável à do BP e, com base na sensibilidade das linhagens de S. typhimurium
utilizadas, os metabólitos do antantreno causam substituições de pares de base,
trocas de fitas e possivelmente dano oxidativo ao DNA. Alguns dos metabólitos que
apresentam ação genotóxica foram recentemente identificados (figura 1.5), mas
uma investigação mais ampla considerando a ligação desses e outros possíveis
metabólitos a biomoléculas, com a identificação dos adutos formados, pode
contribuir para um melhor esclarecimento das vias envolvidas em sua
genotoxicidade (PLATT et al., 2002). O ciclopenta[cd]pireno, por sua vez, mostrou-
se mais potente que o BP em estudos referentes a mutagenicidade em bactérias
(EISENSTADT e GOLD, 1978), malignidade dos tumores induzidos (BUSBY et al.,
1988) e tumorigenicidade em pulmão de camundongos A/J (linhagens isogênicas)
(NESNOW et al., 1994), sendo que adutos de metabólitos do ciclopenta[cd]pireno
com dG foram caracterizados (HSU et al., 1999).
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Figura 1.5.: Vias de ativação microssomal do Dibenzo[def,mno]criseno (antantreno). Via I-
Começa com a epoxidação da região K, formando o 4,5-óxido, que é então hidrolisado para
o 4,5-dihidrodiol, via II- formação da quinonas polinucleares, possivelmente por meio da
oxidação de um elétron e via III- começa com a monoxigenação do anel A da molécula de
antantreno levando a formação do 1- e 3-fenol (adaptado de PLATT et al., 2002).
As observações mencionadas acima indicam que os mecanismos pelos quais
os HPAs induzem câncer em humanos ainda não estão claros e estudos
comparativos de lesões em biomoléculas induzidas por diferentes representantes
dessa classe de compostos são necessários para que se possa ter melhor
compreensão das vias envolvidas. Além disso, a caracterização estrutural de
adutos formados com HPAs ainda pouco estudados (como antantreno, coroneno,
indeno[1,2,3-cd]pireno e trifenileno) irá gerar novas ferramentas para avaliação dos
efeitos induzidos por esses compostos em organismos a eles expostos.
Diante da grande distribuição ambiental desses compostos e da inevitável
exposição humana, torna-se necessária a adoção de medidas para prevenção
contra danos biológicos induzidos por HPAs. Algumas estratégias estudadas são a
adição de óxido de cálcio (CaO) como forma de prevenir a formação de HPAs
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durante a incineração de restos de alimentos e material orgânico (WEY et al.,
2006) e o uso de compostos sintéticos e naturais (p.ex. β-naftoflavona) para
modular enzimas de fase I (em geral enzimas microssomais que catalisam reações
de oxidação, redução e hidrólise) e/ou de fase II (em geral enzimas citosólicas que
catalisam reações de conjugação) ligadas à biotransformação de xenobióticos e
com efeito nos processos de carcinogênese. A ação anti-carcinogênica desses
moduladores tem sido testada em animais experimentais, com concomitante
observação do aumento da excreção ou detoxificação de produtos de
biotransformação e, com isso, conseqüente diminuição das ligações covalentes ao
DNA de tecidos-alvos (MALEJKA-GIGANTI et al., 2005).
1.4. Adutos de DNA como biomarcadores
O uso de biomarcadores em estudos epidemiológicos vem se tornando uma
poderosa ferramenta para determinação da relação causal entre exposição a
xenobióticos e o desenvolvimento de doenças, como o câncer. Os avanços em
métodos analíticos e de biologia molecular têm propiciado a descoberta e validação
de biomarcadores que representam meios bastante sensíveis e seletivos para
avaliação da exposição e risco de danos biológicos, o que é desejável nos casos
de exposição às baixas concentrações de xenobióticos presentes no meio
ambiente. O processo de validação desses biomarcadores envolve estudos in vitro,
em animais experimentais e os estudos epidemiológicos em humanos (Figura 1.6).
No caso de carcinógenos genotóxicos, uma vez conhecidos os mecanismos
principais pelos quais eles interagem com o DNA, as lesões geradas in vitro
(adutos de DNA) podem ser isoladas e utilizadas para a padronização de métodos
analíticos para a sua detecção ultra-sensível em modelos de animais experimentais
expostos às substâncias de interesse. Nos modelos animais podem ser feitas
correlações entre a dose de exposição ao carcinógeno e o nível gerado da lesão
no DNA, que pode ser detectada no órgão alvo de carcinogênese, nos leucócitos e,
após o reparo, na urina. Correlações também são feitas entre os dois parâmetros
anteriores e o desenvolvimento de tumores. Além disso, estudos de
quimioprevenção permitem avaliar se a presença do biomarcador se relaciona com
o desenvolvimento da doença. Sendo verificado que o biomarcador (ex., aduto de
DNA) se relaciona com a exposição ao carcinógeno e com o risco de
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desenvolvimento de doença nos estudos em animais, parte-se para os estudos
epidemiológicos em humanos, nos quais esse mesmo biomarcador é utilizado para
avaliar a relação entre exposição humana ao carcinógeno e o desenvolvimento de
câncer. Décadas de estudo são necessárias para que se tenha um biomarcador
completamente validado (WOGAN et al., 2004; SANTELLA et al., 2005; MIGLIORE
et al., 2006).
Figura 1.6: Modelo para validação de biomarcadores para avaliação de relações causais
entre exposição a carcinógenos e o desenvolvimento de câncer através da epidemiologia
molecular (WOGAN et al., 2004).
Algumas características importantes dos biomarcadores moleculares de
carcinogênese são as seguintes: (i) devem ser moléculas quantificáveis envolvidas
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em eventos fisiológicos ou patológicos que ocorrem entre a exposição a
carcinógenos exógenos ou endógenos e o subseqüente desenvolvimento do
câncer; (ii) devem permitir o diagnóstico precoce de alterações associadas com o
desenvolvimento do câncer antes que os tumores estejam presentes; (iii) devem
ser detectados em fluidos como sangue e urina, não sendo necessária a biópsia de
tecidos (De BONT e Van LAREBEKE., 2004; TURESKY e VOUROS., 2004).
Classicamente, os biomarcadores utilizados em epidemiologia molecular,
buscando avaliar a exposição individual a xenobióticos, identificar alterações
críticas como marcadores iniciais de doença e determinar a susceptibilidade
genética, são divididos da seguinte forma (Figura 1.7, CHEN e HUNTER, 2005):
- Biomarcadores de dose interna: indicam a quantidade da substância absorvida
pelo indivíduo. São importantes para eliminar o problema de informação sobre
exposição baseada em questionários. Em geral refletem a exposição recente
(mas depende da meia-vida). São altamente sensíveis e específicos para a
exposição e em conjunto com biomarcadores de efeito ou de dose
biologicamente efetiva podem servir para a determinação de uma relação dose-
resposta (ex., benzeno no sangue, ácido hipúrico na urina, 2,5 hexanodiona na
urina);
- Biomarcadores de dose biologicamente efetiva: indicam a quantidade de
material reativo que atingiu o tecido em estudo (ex., adutos xenobiótico-
biomoléculas);
- Biomarcadores de efeito: alterações bioquímicas/fisiológicas associadas com
doenças (ex., mutações em genes alvos, alteração da expressão de moléculas
envolvidas na sinalização celular, aberrações cromossômicas etc);
- Biomarcadores de susceptibilidade: indicam se um indivíduo tem uma limitação
para lidar com a exposição química (ex., polimorfismo de enzimas envolvidas
no metabolismo de carcinógenos).
17
Figura 1.7: Epidemiologia molecular abrindo a “caixa preta” da relação causal entre
exposição a xenobióticos e o desenvolvimento do câncer (CHEN e HUNTER, 2005).
Adutos de DNA são muito utilizados como biomarcadores de exposição,
sendo que indicam a dose biologicamente efetiva da substância em estudo. São
também bastante úteis nos estudos de quimioprevenção da carcinogênese
(KYRTOPOULOS et al., 2001; GARCEA et al., 2003). Um exemplo clássico da
epidemiologia molecular que demonstra a importância do uso de adutos de DNA
como biomarcadores é o conjunto de estudos conduzidos desde a década de 1960
que culminou com a validação da relação causal entre exposição a aflatoxinas e
risco de carcinoma hepatocelular em humanos (cerca de 40 anos após o início dos
estudos). Além do estabelecimento dessa relação causal, o uso de adutos de DNA
(aduto aflatoxina B1-guanina) como biomarcadores tem permitido a investigação da
ação quimiopreventiva de alguns compostos, como clorofilina e oltipraz, com
potencial de serem utilizados pela população exposta a aflatoxinas e contribuirem
para redução do risco de desenvolvimento de câncer hepático por essa população.
Uma outra conclusão desses estudos foi a verificação de um efeito sinérgico entre
exposição ao vírus da hepatite B e exposição a aflatoxinas no desenvolvimento de
carcinoma hepatocelular nas populações estudadas. Interferir no processo de lesão
18
desencadeado pelas aflatoxinas contribui significativamente para redução do risco
de câncer hepático mesmo entre os infectados com o vírus da hepatite B (WOGAN
et al., 2004).
Estudos utilizando biomarcadores de exposição e de efeito biológico têm
fornecido evidências dos efeitos genotóxicos dos HPAs presentes na atmosfera em
condições de intensa poluição. Risco aumentado de dano (adutos HPA-DNA) foi
observado em populações ocupacionalmente expostas aos HPAs gerados por
fontes industriais ou urbanas, bem como fumaça de cigarro (SRAM e BINKOVA,
2000; VODICKA et al., 2002). Devido à seletividade de reação desses compostos
com determinadas seqüências de bases do DNA, o espectro de mutações
induzidas por HPAs no gene supressor de tumor p53 em células epiteliais
bronquiais se assemelha aos observados em cânceres pulmonares humanos,
reforçando a idéia de que a exposição aos HPAs se relaciona com o
desenvolvimento de câncer pulmonar (estudos revisados por SINGH e FARMER,
2006). Determinações da natureza, quantidade e localização das lesões no DNA
podem ser de importância para avaliações de risco de desenvolvimento de câncer.
Nos estudos experimentais é verificada boa correlação entre a formação de
adutos de DNA em pele e pulmão de ratos e o potencial carcinogênico em testes
de iniciação e promoção de tumores para muitos HPAs (PUFULETE et al., 2004).
Ainda experimentalmente, a investigação da ativação metabólica, da ligação
covalente ao DNA e da tumorigenicidade de HPAs possibilita a investigação de
qual sistema enzimático favorece a formação dos adutos cruciais para o processo
carcinogênico (DREIJ et al., 2002; MAHADEVAN et al., 2005). Dessa forma, os
mecanismos envolvidos na carcinogênese podem ser melhor compreendidos e
grupos de indivíduos com maior risco de desenvolvimento de câncer podem ser
identificados (VINEIS e HUSGAFVEL-PURSIAINEN, 2005).
1.5. Danos ao DNA por produtos de origem endógena
Estudos epidemiológicos mostram que a exposição a agentes exógenos é
condição necessária para o desenvolvimento de 75 – 80% dos casos de câncer
(WOGAN et al., 2004). Além dos danos biológicos provocados pelos próprios
xenobióticos, como exposto nos itens acima, compostos gerados endogenamente
em concentrações acima da normalidade, podem provocar aumento dos níveis de
19
danos e também contribuir para os processos de mutagênese e carcinogênese.
Nos dois casos, as lesões geradas devem ocorrer em freqüência acima da
capacidade de reparo do DNA para que mutações possam se fixar e levar a
alterações nas funções de genes críticos para a manutenção da estabilidade do
genoma (p.ex.: proteínas envolvidas em reparo e replicação do DNA) (LOEB e
BECKMAN, 2005). Mecanismos intracelulares que levam à ativação de
xenobióticos levam também à geração de espécies reativas de oxigênio, havendo
uma combinação de fatores que resultam em aumento de lesões no DNA e
mutações. A contribuição relativa das vias exógena e endógena para o aumento
das mutações ainda é assunto de debate e estudos quantitativos comparativos
incluindo lesões em DNA induzidas diretamente pelo agente e indiretamente por
estresse oxidativo precisam ser realizados (De BONT e Van LAREBEKE, 2004).
Danos endógenos ao DNA que podem ter sua freqüência aumentada como
resultado da exposição a xenobióticos incluem depurinação, desaminação,
oxidação e formação de adutos com produtos gerados endogenamente (ex.,
aldeídos resultantes do processo de peroxidação lipídica). As lesões mutagênicas
geradas por espécies reativas de oxigênio/nitrogênio e produtos de peroxidação
lipídica são de grande interesse por permitirem intervenção farmacológica através
da indução de defesas antioxidantes, as quais contribuem para diminuição dos
níveis dessas lesões e são importantes para prevenção do envelhecimento, câncer
e outras condições degenerativas (De BONT e Van LAREBEKE, 2004).
8-Oxo-7,8-dihidro-2´-desoxiguanosina (8-oxodGuo) é uma importante lesão
gerada por ataque de radical hidroxila (HO•) ou oxigênio singlete (1O2) à base
guanina no DNA e, por ser de fácil detecção, é considerada um marcador de dano
oxidativo ao DNA. Suas propriedades biológicas foram amplamente investigadas,
tendo sido verificado que é uma lesão mutagênica em bactérias e células de
mamífero, levando principalmente a transversões G→T, as quais são muito
encontradas em genes supressores de tumor e protooncogenes mutados (estudos
revisados por LOUREIRO et al., 2002b).
Fortes evidências apontam no sentido de que bases oxidadas no DNA levam
ao surgimento de mutações ao longo da vida de um indivíduo, podendo contribuir
para o desenvolvimento de tumores. Níveis aumentados de vários produtos
resultantes de danos oxidativos ao DNA foram encontrados em tecidos de câncer
de mama em relação aos respectivos níveis presentes no DNA de áreas
20
adjacentes. Aumentos semelhantes foram observados em cânceres de pulmão,
cólon, estômago, ovário e cérebro (MALKIN et al., 1996). Foi também observado
que na hiperplasia prostática benigna, a qual freqüentemente se relaciona com o
posterior desenvolvimento de câncer de próstata, há níveis elevados de bases
oxidadas no DNA (ORLINSKI et al., 1995).
Uma descoberta crucial que sustenta a hipótese de que danos oxidativos no
DNA são importantes contribuintes para a ocorrência de mutações espontâneas foi
a de que existe um sistema elaborado de reparo em Escherichia coli para reduzir a
mutagênese devida a 8-oxodGuo. Este sistema inclui uma glicosilase para remover
8-oxoguanina do DNA (glicosilase FAPY/produto do gene mutM), uma glicosilase
que remove adenina no pareamento errado 8-oxodGuo:dA (produto do gene mutY)
e uma hidrolase (8-oxodGTPase/produto do gene mutT) para eliminar 8-oxodGTP
da reserva de nucleotídeos (PORELLO et al., 1998; NOLL et al.,1999). Linhagens
de E.coli com mutações em qualquer um desses genes apresentam não só
aumento dos níveis basais de 8-oxodGuo, como também aumento da freqüência
de mutações espontâneas, principalmente transversões G→T (MICHAELS e
MILLER, 1992; TAJIRI et al., 1995; GLASSNER et al., 1998). Existem também
glicosilases para remoção de outras bases oxidadas do DNA (SINGER e HANG,
1997), sendo que as endonucleases III e VIII de E.coli participam da remoção de
diversas pirimidinas oxidadas, tais como timina glicol, 6-hidroxi-5,6-dihidrocitosina e
uracila glicol (KATCHER e WALLACE, 1983; BREIMER e LINDAHL, 1984;
SINGER e HANG, 1997; PURMAL et al., 1998). Homólogos dessas enzimas de
reparo estão presentes em organismos eucariontes (DEMPLE e HARRISON, 1994;
GIRARD e BOITEUX, 1997; MITRA et al., 1997).
Devido à sua abundância nas células e susceptibilidade à oxidação, os ácidos
graxos poliinsaturados são também alvos importantes para os oxidantes. Como
essa oxidação desencadeia uma cascata autocatalítica que gera numerosas
substâncias genotóxicas, tais danos aos lipídios têm grandes implicações para a
integridade do DNA. De fato, a peroxidação lipídica tem sido associada ao
desenvolvimento de condições patológicas induzidas por exposição a agentes
oxidantes. Nesse processo são gerados aldeídos α,β-insaturados, variantes
estruturais dos mesmos (tais como 4-hidroxialcenais e epoxialdeídos) e
malonaldeído, os quais são agentes alquilantes com capacidade de se ligarem
covalentemente a grupos nucleofílicos presentes em DNA, peptídeos e proteínas,
21
provocando alterações nas funções dessas moléculas (MARNETT e PLASTARAS,
2001). Reações de aldeídos resultantes do processo de peroxidação lipídica com
bases do DNA dão origem a diversos adutos exocíclicos denominados
propanoadutos, etenoadutos e adutos de malonaldeído. Vários sistemas
enzimáticos participam do reparo dessas lesões e a predominância do reparo por
excisão de bases (BER) ou do reparo por excisão de nucleotídeos depende das
estruturas dos adutos. Publicações recentes têm apontado os adutos exocíclicos
de DNA de origem endógena como ferramentas potenciais para o estudo do
estresse oxidativo, da etiologia do câncer e para a avaliação da eficácia de agentes
quimiopreventivos contra danos em DNA. Muito esforço tem sido feito no sentido
de elucidar as fontes, o significado toxicológico e as conseqüências genéticas
dessas lesões de DNA; os tipos de fatores exógenos ou condições patofisiológicas
que levam ao seu aumento; e se esses adutos, quando gerados através de
reações mediadas por estresse oxidativo, desempenham um papel na
carcinogênese humana ou em outras doenças degenerativas (MARNETT e
PLASTARAS, 2001).
1.6. Métodos empregados para detecção de adutos de DNA
Nas últimas décadas, diferentes métodos analíticos têm sido desenvolvidos
para a detecção e quantificação de lesões em DNA (Tabela 1.1) (TURESKY e
VOUROS, 2004; SINGH e FARMER, 2006).
As técnicas mais comumente utilizadas para a detecção dos adutos HPA-
DNA acima mencionados são a pós-marcação com 32P e imunoensaios. Estudos
utilizando essas técnicas possibilitaram o conhecimento de que adutos
carcinógeno-DNA são formados em situações nas quais ocorre exposição a HPAs.
Uma vantagem da técnica de pós-marcação com 32P é a sua sensibilidade,
podendo chegar a um limite de detecção de 1 aduto/1010 nucleotídeos em 12 µg de
DNA. Os imunoensaios, por sua vez, apresentam grande simplicidade operacional,
permitindo a análise de múltiplas amostras (POIRIER e WESTON, 1996;
ALBERTINI et al., 2000; de KOK et al., 2002; OKONA-MENSAH et al., 2005;
SINGH e FARMER, 2006). Entretanto, nenhum desses métodos é suficientemente
seletivo para a identificação de adutos específicos (por exemplo, aduto BPDE-dG).
A identificação mais precisa da formação de adutos BPDE-DNA ou BPDE-proteína
22
em muitos estudos é feita, por exemplo, por hidrólise ácida dos mesmos, a qual
libera B[a]P-tetraóis. Métodos quantitativos atualmente utilizados para a
determinação de B[a]P-tetraóis incluem cromatografia liquida de alta eficiência
(HPLC)-fluorescência, HPLC-fluorescência a laser e cromatografia gasosa
acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). Diversos estudos mostraram a
formação de adutos BPDE-DNA e BPDE-proteína em sangue, urina e tecidos de
humanos expostos aos HPAs utilizando essas técnicas (BOYSEN e HECHT,
2003). Um exemplo do uso da técnica de pós-marcação com 32P e da fluorescência
a laser é a detecção de adutos de DNA formados a partir do potente carcinógeno
dibenzo[a,l]pireno (DB[a,l]P), na presença de microssomos de fígado de rato in
vitro e em pele de camundongos in vivo (JANKOWIAK et al., 1998).
Entretanto, esses métodos não fornecem informação sobre as estruturas
químicas dos adutos e HPAs que os originaram, parâmetros importantes para
compreendermos melhor a contribuição de cada composto para o processo de
carcinogênese. Atualmente técnicas de HPLC acoplado a espectrometria de
massas têm sido utilizadas para a detecção de adutos em níveis de 0,2 – 2 adutos
/ 108 bases de DNA usando 10 – 100 µg de DNA, com alta especificidade e a
vantagem de fornecer informação estrutural sobre as lesões (SINGH e FARMER,
2006). Através do uso de espectrometria de massas, adutos BPDE-dG, BPDE-dA e
BPDE-dC foram recentemente detectados e quantificados em pulmão de
camundongos expostos a fumo de asfalto (HPLC/Q-TOF MS, WANG et al., 2003) e
o aduto BPDE-dG foi detectado em DNA de fígado e pulmão de camundongos
expostos a B[a]P e em DNA de amostras de pulmão humano (HPLC/ESI/MS-MS,
BELAND et al., 2005).
23
Tabela 1.1: Métodos para determinação de adutos em DNA (POIRIER, 2004).
1.7. Efeitos epigenéticos de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs)
Além dos efeitos genotóxicos descritos anteriormente, HPAs atuam por uma
via não genotóxica, mediada pelo receptor citosólico de hidrocarboneto aromático
(AhR) (Figura 1.8), comparável aos receptores de esteróides/retinóides/hormônios
da tireóide. Esse receptor tem grande afinidade por vários hidrocarbonetos
aromáticos, como 3-metilcolantreno e benzo[a]pireno, e também por compostos
clorados, como dioxinas e bifenilas policloradas. O receptor Ah está normalmente
complexado com proteínas de choque térmico (hsp90) na razão 1:2, as quais se
24
dissociam após ligação do receptor a um de seus ligantes. O receptor é, então,
fosforilado por tirosina quinase e, uma vez ativado, migra para o núcleo e forma um
heterodímero com o transportador nuclear de AhR (Arnt). Esse complexo se liga,
então, a seqüências reguladoras do genoma, conhecidas como elementos
responsivos a dioxina (DRE) ou elementos responsivos a xenobiótico (XRE), e
aumenta a expressão de alguns genes (ex., CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, DT-
diaforase, glutationa S-transferase, UDP-glicuronil transferase, aldeído
desidrogenase) (THURMOND et al., 1999; MATHIEU et al., 2001; LAWRENCE e
VORDERSTRASSE, 2004; MARLOWE e PUGA, 2005; ALLAN et al., 2006;
KORASHI e El-KADI, 2006; SHAROVSKAYA et al., 2006). CYP1B1 é uma
isoforma extra-hepática de CYP450, que tem papel importante na bioativação de
HPAs e arilaminas. A modificação de sua expressão pode modular a
susceptibilidade celular aos efeitos genotóxicos desses pró-carcinógenos
presentes no ambiente em geral (FALLONE et al., 2005). Muitas evidências
indicam que a ativação dos receptores Ah, seguida por aumento na expressão de
isoformas de CYP450, é necessária para que HPAs e dioxinas induzam toxicidade
(HU et al., 2006), reforçando a importância dessa via epigenética para a
carcinogênese induzida por esses compostos (CIGANEK et al., 2004).
25
Figura 1.8: Via de ação epigenética de HPAs
1) Após entrar na célula o xenobiótico (p.ex.: HPAs, dioxinas e etc) se liga ao AhR e há
dissociação da proteína chaperona, sendo o complexo AhR-ligante fosforilado transportado
até o núcleo. 2) No núcleo o complexo é heterodimerizado com o transportador nuclear de
AhR (Arnt), ocorrendo a ligação a elementos responsivos à dioxina (ERD). 3) Há aumento
da expressão de vários genes, incluindo várias isoformas de CYP450. 4) O repressor de AhR
(AhRR) migra para o núcleo e age como um inibidor competitivo da ligação do Arnt ao AhR,
formando um complexo AhRR-Arnt, que é um dímero transcripcional inativo. 5) Isoformas
de CYP450 mais expressas contribuem para a ativação do xenobiótico, que pode então
danificar biomoléculas. Simultaneamente, ocorre a formação de espécies reativas de
oxigênio. Peróxido de hidrogênio leva à ativação do fator nuclear kappa B (NF-kB). A
ativação do NF-kB inibe o AhR e, conseqüentemente, há inibição da expressão dos genes
regulados por ERD (VRZAL et al., 2004).
26
2. Objetivos
-Investigar algumas vias pelas quais o antantreno pode exercer seus efeitos
mutagênicos, através do estudo da indução de lesões em DNA por esse HPA.
-Ampliar os estudos sobre toxicidade do antantreno para duas linhagens de
hepatócitos humanos em cultura (células THLE-2 normais e células HepG2
tumorais).
2.1. Objetivos específicos:
1. Obtenção de produtos de oxidação do antantreno (quinonas e
hidroquinonas);
2. Incubação de células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) e
hepatócitos humanos normais (THLE-2) com diferentes concentrações
de antantreno e seus produtos de oxidação (soluções de quinonas e
hidroquinonas) para verificação da sobrevivência relativa e análise de
dano oxidativo (8-oxodGuo em DNA extraído das células);
3. Investigação da formação de adutos em incubações in vitro de dG com
antantreno oxidado quimicamente;
4. Investigação da formação de adutos em incubações in vitro de DNA com
antantreno, suas quinonas e hidroquinonas na presença de peroxidase
de rábano (HRP)/H2O2.
27
3. Materiais e métodos
3.1. Reagentes
Todos os reagentes utilizados foram da mais alta pureza comercialmente
disponíveis. Soro fetal bovino (SFB) e meio PFMR-4 foram provenientes da Cultilab
- materiais para cultura de células (Campinas, SP, Brasil). Clorofórmio, etanol,
metanol, acetonitrila, hidróxido de sódio, fosfato de potássio monobásico, sulfato de
magnésio, ácido fosfórico, ácido perclórico foram fornecidos pela Merck
(Darmstadt, Alemanha). Carbonato de sódio anidro foi fornecido pela Mallinckrodt
Chemical (Paris, França). Todos os outros reagentes foram obtidos da Sigma
Chemical Co. (St. Louis, MO).
A água foi deionizada em um sistema Milli-Q (Millipore).
3.2. Equipamentos
As medidas de fluorescência foram feitas em um espectrofluorímetro Spex
modelo 1681 (Spex Industries, Edison, NJ). Os espectros de massas foram obtidos
por meio de um espectrômetro do tipo electrospray / triplo quadrupolo, modelo
Quatro II (Micromass, Manchester, U.K.). Para as centrifugações foram utilizadas
centrífugas refrigeradas modelos 5702R e 5804R da Eppendorf (Hamburg,
Alemanha) e centrífugas sem refrigeração modelos Mini–Spin Plus, 5415D da
Eppendorf (Hamburg, Alemanha) e modelo AP56 da Phoenix (São Paulo, Brasil).
As incubações que necessitavam de agitação foram feitas em um agitador de
tubos (Thermomixer 5436 da Eppendorf (Alemanha)). As observações
microscópicas foram feitas em um microscópio invertido DM IL da Leica (Wetzlar,
Alemanha). As soluções foram autoclavadas em autoclave vertical modelo 415 da
Fanem (São Paulo, Brasil). As medidas de pH foram feitas em um potenciômetro
da Denver Instrument Basic Model CO31603098 (Sigma Chemical Co. (St. Louis,
MO)). Foi utilizada balança analítica da Bioprecisa (São Paulo, Brasil) modelo FA
2104N.
As células foram incubadas em uma estufa de CO2 Instrucom®, modelo 310
da ThermoForma (Ohio, E.U.A.). As liofilizações foram feitas em um sistema
consistindo de uma bomba de vácuo de alta eficiência, modelo VLP120, da Savant
(Savant instruments, Nova Iorque, E.U.A.), um micromódulo E-C para secagem a
baixas temperaturas (E-C Apparatus, Nova Iorque, E.U.A.), e um concentrador
28
modelo 5301 da Eppendorf (Alemanha). Foram utilizados banho maria modelo
3162 da Ética (São Paulo, Brasil), agitador magnético modelo 78HW-1 Biomixer
(China) e um leitor de Elisa modelo power wave x340 da Bio-Tek instruments, INC.
(Vermont, E.U.A).
3.3. Oxidação do antantreno para obtenção de quinonas e hidroquinonas
Antantreno (1 mg) foi dissolvido em 200 µL de ácido acético/anidrido acético
1:1 a 0oC. Em seguida foi adicionado lentamente a uma solução de dicromato de
sódio (9,6 µmol) dissolvido em 200 µL de ácido acético/anidrido acético 1:1 a 0oC.
A solução resultante foi incubada sob agitação, 37oC por 24 horas. Após esse
período, foi observado um precipitado verde escuro. Foi adicionado 1 mL de água
Milli-Q e a amostra foi centrifugada por 5 minutos, 10.000 g (2 vezes), sendo o
precipitado recuperado. Finalmente foram adicionados 1 mL de água Milli-Q e 1 mL
de clorofórmio, as amostras centrifugadas por 5 minutos a 10.000 g em
temperatura ambiente e recuperada a fase orgânica que foi evaporada.
Para obtenção de hidroquinonas acetiladas estáveis, a mistura de quinonas
obtida conforme descrito acima foi dissolvida em 200 µL de dimetilformamida e em
seguida foi adicionado 1 mg de NaBH4. A solução resultante foi mantida sob
agitação a 37°C por 1 hora. Após esse período foram adicionados 20 µL de piridina
e 180 µL de anidrido acético e a amostra foi novamente incubada por 5 horas, a
37°C, sob agitação. Decorrido esse período, foram adicionados à solução 500 µL
de água miliQ. A amostra foi centrifugada a temperatura ambiente por 5 minutos,
10 000 g (2 vezes), descartando o sobrenadante. Em seguida foram adicionados 1
mL de água miliQ, 500 µL de clorofórmio e a fase orgânica foi recuperada (10 000
g, 5 minutos) e evaporada.
Para obtenção de hidroquinonas para as incubações com DNA in vitro, foi
feita redução das quinonas com NaBH4 como descrito acima, sem seguir o passo
de acetilação. Como nesse caso as hidroquinonas tendem a voltar para quinonas
quando em contato com o ar, foi tomado o cuidado de borbulhar nitrogênio (N2) por
10 minutos na solução obtida após 1 h de incubação com NaBH4 a 37oC e no éter
utilizado para extração das hidroquinonas. As hidroquinonas foram, então,
extraídas com éter (precipitação do NaBH4) e a solução obtida foi evaporada sob
fluxo de nitrogênio. O precipitado foi ressuspenso com a própria solução de DNA
no tampão no momento da incubação.
29
30
3.3.1. Análise dos produtos de oxidação do antantreno por HPLC/PDA e
HPLC/ESI/MS
Para as análises por HPLC/PDA foi utilizado um sistema da Shimadzu (Kyoto,
Japão) constituído por duas bombas (modelo LC-10AD ou LC-20AT), um injetor
Rheodyne (Cotati, CA), um injetor automático (SIL-20 AC), um detector de arranjo
de diodos (modelo SPD-M10AV ou SPD-M20A), um forno para coluna (modelo
CTO-10AS), controlados por um módulo de comunicação (CBM-10A ou CBM-20A)
e o software CLASS LC-10AWS ou CLASS LC-20AWS. Foi utilizada a seguinte
condição:
Condição 3.3.1.a: uma coluna Luna C18(2) (250 mm x 4,6 mm i.d.,5 µm) da
Phenomenex (Torrance,CA) foi eluída com um gradiente de água e acetonitrila (de
0 a 40 min, 40 a 100% de acetonitrila; de 40 a 65 min, 100% de acetonitrila; de 65
a 66 min, 100 a 40% de acetronitrila; de 66 a 76 min, 40% de acetonitrila a um fluxo
de 0,8 mL/min). Espectros de absorbância foram obtidos no intervalo de 200 a 800
nm.
Para as análises por HPLC/ESI/MS foi utilizado um sistema de HPLC da
Shimadzu constituído por duas bombas (Class LC-10 AD/VP), um injetor
automático (SIL-10AD/VP), uma válvula comutadora de fluxo (FCV-12AH) e um
detector de absorbância (modelo SPD-10 AV/VP) conectado ao espectrômetro de
massas Quattro II da Micromass (Manchester, U.K.). O sistema foi controlado pelo
módulo de comunicação SCL-10A/VP (Shimadzu) e o software MassLynx 3.2
(Micromass) ou Class-VP (Shimadzu). Foi utilizada a seguinte condição:
Condição 3.3.1.b: uma coluna Luna C18(2) (150 mm x 2 mm i.d., 3 µm) da
Phenomenex foi eluída com um gradiente de ácido fórmico (0,1% em água) e
acetonitrila (de 0 a 40 min, 40 a 100% de acetonitrila; de 40 a 65 min, 100% de
acetonitrila; de 65 a 66 min, 100 a 40% de acetronitrila; de 66 a 76 min, 40% de
acetonitrila a um fluxo de 0,15 mL/min). A temperatura da fonte foi ajustada para
150 °C e os fluxos dos gases de secagem e nebulização (nitrogênio) para 350 e 10
L/h, respectivamente. O potencial do capilar foi ajustado para 3,10 kV e do eletrodo
HV para 0,3 kV. Simultaneamente foi feita a detecção por absorbância a 254 nm.
31
Os dados foram processados com o software MassLynx 3.2 (Micromass). Foram
obtidos espectros de massas em MS1 no intervalo de 100 – 800 m/z.
3.4. Danos celulares induzidos pelo antantreno e seus produtos de oxidação
3.4.1. Cultivo das células
Meios de cultura:
a) meio Eagle modificado por Dulbecco (DME) suplementado com NaHCO3 (1,2
g/L), 10 mg/mL de penicilina/estreptomicina e 10% de soro fetal bovino (SFB).
O meio de cultura sem suplementação com SFB foi esterilizado por filtração
através de membrana de 0,22 µm diretamente para o interior de frascos estéreis.
Foram utilizados filtros estéreis descartáveis da TPP (Zollikofen, Suiça). O SFB
estéril foi adicionado a alíquotas do meio estéril de acordo com a necessidade de
uso.
b) meio indutor de CYP450: solução balanceada de Earle suplementada com
insulina bovina (1 U/L), hidrocortisona (0,1 mM), ácido-δ-aminolevulínico (0,1 mM),
gentamicina (50 mg/L) e 10% de SFB. Modo de preparo como no item 3.4.1.a.
c) meio PFMR-4 (Cultilab) suplementado com L-glutamina (2 mM), insulina
(1,75 µM), hidrocortisona (0,2 µM), EGF (5 ng/mL), transferrina (10 µg/mL),
fosfoetanolamina (P/E, 50 nM), T3 (50 nM), extrato de pituitária bovina (7,5 µg/mL),
ácido retinóico (0,33 nM), penicilina/estreptomicina (10 mg/L) e SFB (10%). Modo
de preparo como no item 3.4.1.a.
Soluções:
PBS: 137 mM NaCl, 1,68 mM KCl, 1,47 mM Na2HPO4, pH 7,0. Solução
autoclavada.
Tripsina: 0,1% (p/v) de tripsina em PBS (pH 7,0) contendo 1 mM de EDTA.
Solução esterilizada por filtração através de membrana de 0,22 µm diretamente
para o interior de frascos estéreis.
Células de carcinoma hepatocelular humano, linhagem HepG2, de morfologia
epitelial, foram cultivadas nos meios de cultura 3.4.1.a e 3.4.1.b. Células normais
de fígado humano, linhagem THLE-2 de morfologia epitelial, foram cultivadas no
32
meio de cultura 3.4.1.c. Essa linhagem celular expressa características fenotípicas
de hepatócitos. Metabolizam benzo[a]pireno, N-nitrosodimetilamina e aflatoxina B1
para metabólitos reativos, formando adutos com o DNA e indicando vias funcionais
de CYP450. Outras enzimas envolvidas no metabolismo de carcinógenos, como a
epóxido hidrolase, NADPH citocromo P450 redutase, superóxido dismutase,
catalase, glutationa-S-transferase e glutationa peroxidase também são expressas
por células THLE-2. As células HepG2 cresceram aderidas à superfície de garrafas
plásticas de cultura e foram repicadas em períodos de 4 a 5 dias. As garrafas
usadas para a propagação das células THLE-2 foram cobertas (2 h, 37oC) com
meio de cultura contendo albumina bovina (0,01 mg/mL), fibronectina (0,01 mg/mL)
e colágeno I (0,03 mg/mL). O cultivo de ambas as linhagens foi feito em atmosfera
com 5% de CO2, a 370C, no escuro.
Procedimento para o repique das células: após a retirada do meio, a cultura
foi lavada 2 vezes com PBS. A seguir foi incubada a 370C com volume mínimo (1,5
mL) de solução de tripsina (a solução de tripsina utilizada para as células THLE-2
foi diluída 2 vezes com PBS) até que as células se desprendessem (± 2 min). As
células foram, então, ressuspensas nos seus respectivos meios de cultura e a
suspensão distribuída para novas garrafas ou placas na diluição desejada.
3.4.2. Tratamento das células com antantreno, antantreno-quinonas e
antantreno-hidroquinonas
Após as células atingirem a confluência (aproximadamente 5x105
células/poço em placas de 24 poços, 1x105 células/poço em placas de 96 poços e
3x107 células/placa de 15 cm de diâmetro), o meio de cultura foi substituído por
outro com soro. As incubações com antantreno, antantreno-quinonas ou
antantreno-hidroquinonas, partindo de uma solução 10 mM de cada um desses
compostos em DMSO, foram feitas na estufa de CO2 a 370C de diferentes formas.
3.4.2.1. Incubações para determinação da viabilidade celular
Foram utilizadas células HepG2 cultivadas nos meios 3.4.1.a e 3.4.1.b e
células THLE-2 cultivadas no meio 3.4.1.c. Para comparação da viabilidade das
células HepG2 com THLE-2, ambas foram cultivadas sobre filme de colágeno
como descrito no item 3.4.1.
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A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio do brometo de 3-(4,5-dimetil-
2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT) como descrito abaixo no item 3.4.2.1.1.
As células foram semeadas numa densidade de 1 x 105 células/poço em
placas de 96 poços e incubadas por 24 horas a 37oC em meio de cultura
suplementado com SFB. Após esse período, foram feitas as incubações com
diferentes concentrações (10 µM, 20 µM, 50 µM, 100 µM e 200 µM) das soluções
de antantreno, antantreno-quinonas ou antantreno-hidroquinonas acetiladas, 4
poços para cada amostra, por 16 horas. Ao final desse período, o meio de cultura
foi substituído por outro sem soro ao qual foi adicionado MTT e feita a
determinação da viabilidade como descrito abaixo. O grupo controle consistiu em
incubação das células com 2% de DMSO (concentração máxima de DMSO
presente nas incubações com as soluções de interesse).
3.4.2.1.1. Determinação da viabilidade celular pelo ensaio do brometo de 3-
(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT)
Soluções
Solução de lise: 100% de DMSO
MTT: 5 mg/mL em PBS
O método, originalmente descrito por Mosmann (1983), se baseia na
conversão do sal tetrazólio (MTT) para o produto colorido formazan, cuja
concentração pode ser determinada espectrofotometricamente. Essa conversão
ocorre, principalmente, em mitocôndrias intactas e, portanto, células viáveis
(Hansen et al., 1989).
As células foram semeadas numa densidade de 1x105 células/poço em
placas de 96 poços. No dia seguinte foram feitas as incubações com as
substâncias de interesse por 16 horas a 37oC em meio de cultura suplementado
com SFB.
Ao final de cada incubação, foram adicionados 20 µL de solução de MTT.
Após duas horas de incubação a 37oC, o meio contendo MTT foi removido com
cuidado para que não fosse aspirado o formazan precipitado no poço. Foram,
então, adicionados 200 µL da solução de lise (DMSO) a cada poço. Após
34
solubilização dos precipitados, foi feita a leitura da absorbância a 570 nm em leitor
de ELISA. Os resultados foram expressos em valores relativos ao grupo controle.
3.4.2.2. Incubações para extração do DNA e determinação de dano oxidativo
(8-oxodGuo)
Células HepG2 cultivadas em placas de 15 cm de diâmetro (3x107
células/placa) foram incubadas com antantreno ou seus produtos de oxidação
(misturas de quinonas ou hidroquinonas acetiladas) na concentração final de 20 µM
em 15 mL de meio de cultura com soro por 16 h, a 37oC, na estufa de CO2. Em
seguida as células foram removidas das placas e o DNA foi extraído como descrito
abaixo.
Paralelamente foi extraído DNA de células incubadas com volume de DMSO
(grupo controle) equivalente às amostras.
3.4.2.2.1. Extração do DNA
Soluções
Tampão A: 320 mM sacarose; 5 mM MgCl2; 10 mM Tris-HCl; 0,1 mM
desferroxamina; Triton X100 (1%), pH 7,5
Tampão B: 10 mM Tris-HCl; 5 mM EDTA.Na2; 0,15 mM desferroxamina, pH 8
Tampão C: 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; 2,5 mM desferroxamina, pH 7,4
Solução de NaI: 7,6 M NaI; 40 mM Tris-HCl; 20 mM EDTA.Na2, pH 8
Para a extração do DNA genômico, as células de cada placa foram
homogeneizadas com 5 mL de tampão A e centrifugadas a 1500 g por 10 minutos,
a 40C. Os sobrenadantes foram descartados e os precipitados foram ressuspensos
em 5 mL de tampão A e centrifugados a 1500 g por 10 minutos, 40C. A seguir
adicionou-se em cada tubo 4 mL de tampão B, 233 µL SDS (10%) e agitou-se,
acrescentando-se em seguida 3 µL de RNAse A (10 mg/mL em C) e 0,4 µL de
RNAse T1 (20 U/µL em C). As amostras foram incubadas por 1 hora a 37 ºC. Após
a incubação foram adicionados 30 µL de proteinase K (20 mg/mL) e as amostras
foram incubadas por mais 1 hora a 37 ºC. Após a segunda incubação as amostras
foram centrifugadas a 5000 g por 15 minutos, 40C. Coletou-se o sobrenadante e
35
aos tubos foram adicionados 2 mL de solução de NaI e 5 mL de isopropanol. Após
leve agitação para precipitação do DNA, as amostras foram guardadas no freezer
por 1 dia (-200C). Após esse período as soluções foram centrifugadas a 5000 g por
15 minutos, 40C, os sobrenadantes foram descartados e aos tubos foram
adicionados 5 mL de isopropanol 60% (em água). As soluções foram centrifugadas
novamente a 5000 g por 15 minutos, 40C. O DNA foi lavado com 10 mL de etanol
70% (em água) e centrifugado a 5000 g por 15 minutos, 40C. Adicionou-se então
500 µL de solução de desferroxamina (0,1 mM em água) e agitou-se para dissolver
o DNA. A concentração foi determinada por leitura da absorbância a 260 nm.
3.4.2.2.2. Hidrólise enzimática do DNA
A hidrólise enzimática do DNA para subseqüentes análises por HPLC foi feita
segundo o procedimento descrito abaixo.
Tampão Tris-HCl 0,2 M (10 µL, pH 7,4) e MgCl2 2 M (10 µL) foram
adicionados a uma alíquota de solução contendo 100 µg de DNA. Em seguida, foi
adicionada DNAse 1 (1,25 unidade) e a amostra foi incubada a 37°C por 1,5 h.
Então, foram adicionados 10 µL de tampão glicina-acetato 0,2 M (pH 10) e 0,008
unidade de fosfodiesterase 1 (PDE1) e feita nova incubação a 37 °C por 1,5 h.
Finalmente foram adicionados 25 µL de tampão Tris-HCl-MgCl2 0,2 M (pH 7,4) e 3
unidades de fosfatase alcalina. A amostra foi incubada a 37 °C por 1 hora. O
volume final da solução foi ajustado para 200 µL com água.
3.4.2.2.3. Análise de 8-oxodGuo por HPLC/detecção eletroquímica
Amostras de DNA hidrolisado enzimaticamente foram analisadas por um
sistema de HPLC/detecção eletroquímica constituído por uma bomba (LC-10AD,
Shimadzu), um injetor Rheodyne (modelo 9125i, Cotati, CA), um detector de
absorbância (SPD-10A, Shimadzu) e um detector eletroquímico Coulochem II
(ESA, Chemlsford, MA) controlados por um módulo de comunicação (CBM 10A,
Shimadzu) e o software Class LC10AWS (Shimadzu). A eluição foi feita através de
uma coluna Luna C18(2) (250 mm x 4,6 mm i.d., 5 µm, Phenomenex) com a fase
móvel constituída por 8% de metanol em tampão fosfato de potássio 25 mM (pH
5,5) a um fluxo de 0,8 mL/min (temperatura da coluna: 16oC). Nessas condições o
tempo de retenção de 8-oxodGuo foi de aproximadamente 27 min. Os potenciais
36
dos eletrodos 1 e 2 do detector eletroquímico foram fixados em +130 mV e +380
mV para detecção de 8-oxodGuo. A eluição dos nucleosídeos não modificados foi
monitorada simultaneamente por absorbância a 254 nm. Curvas de calibração de
8-oxodGuo e dG nos intervalos das quantidades esperadas nas amostras de DNA
foram obtidas para a quantificação e, em seguida, a fração molar 8-oxodGuo / dG
presente em cada amostra de DNA foi determinada. Todos os solventes utilizados
foram previamente filtrados e degaseificados. Padrões de 8-oxodGuo e dG foram
obtidos da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).
3.5. Análise de formação de adutos a partir de incubações in vitro de DNA ou
2’-desoxiguanosina com produtos de oxidação do antantreno
3.5.1. Incubações de dG com antantreno + H2O2
a) Solução de dG (2 mM) em tampão carbonato/bicarbonato (pH 11, 50 mM,
200 µL) foi adicionada a 150 µL de solução de antantreno 360 µM em acetonitrila.
Peróxido de hidrogênio (164 µL de uma solução 8,7 mM) foi adicionado e a solução
foi avolumada com acetonitrila para 764 µL. Concentrações finais dos reagentes:
523 µM de dG, 70,7 µM de antantreno, 1870 µM de H2O2. A solução foi incubada
por 24 h a 50oC. Foram realizadas incubações controles (sem antantreno ou sem
dGuo) nas mesmas condições.
b) Solução de dG (8mM) em tampão carbonato⁄bicarbonato (pH 11, 50mM,
500µL) foi adicionada a 1500µL de solução de antantreno 360µM em acetonitrila.
Peróxido de hidrogênio (164µL de uma solução 87mM) foi adicionado.
Concentrações finais dos reagentes: 1848µM de dG, 249µM de antantreno,
6600µM de H2O2. A solução foi incubada por 24 h a 500C.
3.5.1.1. Análise dos produtos das incubações por HPLC/UV/ESI/MS
Para as análises foi utilizado um sistema de HPLC da Shimadzu (Shimadzu,
Kyoto, Japão) constituído por duas bombas (Class LC-10 AD/VP), um injetor
automático (SIL-10AD/VP), uma válvula comutadora de fluxo (FCV-12AH) e um
detector de absorbância (modelo SPD-10 AV/VP) conectado ao espectrômetro de
massa Quattro II da Micromass (Manchester, U.K.). O sistema foi controlado pelo
37
módulo de comunicação SCL-10A/VP (Shimadzu) e o software MassLynx 3.2
(Micromass) ou Class-VP (Shimadzu). Foi utilizada a seguinte condição:
Condição 3.5.1.1.a: Uma coluna Luna C18(2) (150 mm x 2 mm i.d., 3 µm) da
Phenomenex foi eluída com um gradiente de ácido fórmico (0,1% em água) e
acetonitrila (de 0 a 60 min, 5 a 100% de acetonitrila; de 60 a 65 min, 100 a 5% de
acetonitrila a um fluxo de 0,15 mL/min). A temperatura da fonte foi ajustada para
150 °C e os fluxos dos gases de secagem e nebulização (nitrogênio) para 350 e 10
L/h, respectivamente. O potencial do capilar foi ajustado para 3,10 kV e do eletrodo
HV para 0,3 kV. Simultaneamente foi feita a detecção por absorbância a 254 nm.
Os dados foram processados com o software MassLynx 3.2 (Micromass). Foram
obtidos espectros de massas em MS1 no intervalo de 100 – 800 m/z.
3.5.2. Incubações de DNA comercial (timo de bezerro) com antantreno e seus
produtos de oxidação na presença de peroxidase de rábano (HRP)
Antantreno, antantreno-quinonas ou antantreno hidroquinonas (200 µM) foram
incubados com HRP (0,2 mg), H2O2 (0,5 mM) e DNA (2 mg) em tampão fosfato de
sódio 67 mM (pH 7,0). Incubação controle sem o HPA ou seus produtos de
oxidação também foi feita. Volume final das incubações: 1 mL. Após 2 h a 37oC,
sob agitação, o DNA foi precipitado pela adição de 100 µL de acetato de sódio 3 M
(pH 5) e 1 mL de isopropanol (10.000 g, 10 min). O DNA foi, então, lavado duas
vezes com etanol 70% (10.000 g, 10 min), ressuspenso em água e foi feita uma
extração com clorofórmio (5.000 g, 10 min) para remoção de resquícios de
antantreno livre na solução. A concentração de DNA foi determinada por leitura da
absorbância a 260 nm.
3.5.2.1. Análise da formação de produtos fluorescentes no DNA (timo de
bezerro) por espectrofluorimetria
As amostras de DNA obtidas das incubações descritas no item 3.5.2 foram
dissolvidas em tampão fosfato de sódio 10 mM (pH 7,0) (proporção 1:2). Espectros
de fluorescência (emissão) das amostras foram adquiridos fixando-se o
comprimento de onda de excitação em 314 nm. Foi feita comparação com os
38
espectros de emissão de fluorescência do DNA controle e do próprio
hidrocarboneto (λexc. = 314 nm).
3.5.2.2. Hidrólise enzimática do DNA e análise da formação de adutos por
HPLC/UV/Fluorescência e HPLC/ESI/MS
Para as análises por HPLC, as amostras de DNA obtidas no item 3.5.2 foram
hidrolisadas enzimaticamente como descrito no item 3.4.2.2.2. Os produtos da
hidrólise foram analisados por HPLC/UV/Fluorescência.
Sistema de HPLC/UV/Fluorescência: foi utilizado um sistema da Shimadzu
constituído de duas bombas modelo LC-10AT, um injetor Rheodyne (Cotati, CA),
um detector de absorbância modelo SPD-10A e um detector de fluorescência
modelo RF-10A, controlados por um módulo de comunicação modelo SCL-10A e o
software Class-VP. Foi utilizada a seguinte condição cromatográfica:
Condição 3.5.2.2.a: Uma coluna Luna C18(2) (250 mm x 4,6 mm i.d.,5 µm) da
Phenomenex foi eluída com um gradiente de água e acetonitrila (de 0 a 5 min, 5%
de acetonitrila, de 5 a 60 min, 5 a 100% de acetonitrila; de 60 a 65 min, 100 a 5%
de acetonitrila, a um fluxo de 1 mL/min). A absorbância foi monitorada em 254 nm
e a fluorescência foi monitorada em 450 nm (λexc. = 314 nm).
3.6. Análise estatística dos dados
A análise estatística dos dados de 8-oxodGuo foi feita através do teste t
Student para comparação entre duas populações. A análise estatística dos dados
de viabilidade celular foi feita através do teste ANOVA, se significativas realiza-se o
teste de Tukey-Kramer (comparações múltiplas).
39
4. Resultados
4.1. Oxidação do antantreno para quinonas e hidroquinonas
No estudo de mutagenicidade do antantreno em diferentes linhagens de S.
typhimurium (TA97, TA98, TA100 e TA104) conduzido por Platt et al., (2002), foi
verificado que produtos de oxidação desse HPA são os responsáveis pelos efeitos
mutagênicos. Nesse estudo foi investigado o metabolismo microssomal do
antantreno, tendo sido identificados alguns metabólitos mutagênicos, dentre os
quais 1,6-, 3,6- e 6,12-quinonas. Essas quinonas polinucleares não são
intrinsecamente mutagênicas, necessitando de biotransfomação (fração S9 (lisado
de fígado de ratos, contendo várias enzimas microssomais)) para que a
mutagenicidade seja observada (Platt et al., 2002). O baixo potencial de ionização
do antantreno (6,96 eV) propicia sua oxidação enzimática ou autoxidação para
cátion-radicais, que, na presença de oxigênio, originam as quinonas polinucleares
acima. Os cátion-radicais intermediários são espécies eletrofílicas que, ao serem
geradas nos seres vivos, podem modificar covalentemente o DNA e outras
biomoléculas. As quinonas polinucleares podem ser formadas por oxidação de
HPAs no meio ambiente (ex., oxidação por luz UV) ou por ação de enzimas, tais
como peroxidases e monooxigenases, nos sistema vivos. Como exemplo, estudos
mostram que peroxidases convertem BP para uma mistura de 1,6-, 3,6- e 6,12-
quinonas, as quais possuem efeito citotóxico, levando a uma diminuição da
proliferação de células epiteliais pulmonares humanas in vitro. As reações de
oxidação atmosférica e biológica podem levar à conversão significativa de HPAs
para quinonas. Tais quinonas podem ser reduzidas enzimaticamente e entrar em
um ciclo redox, catalisando a geração de espécies reativas de oxigênio. O
intermediário semiquinona gerado nesse processo também pode se adicionar a
macromoléculas celulares, formando adutos (Reed et al., 2003).
Diante dessas informações, resolvemos utilizar um procedimento para
obtenção de quinonas e hidroquinonas do antantreno, como descrito por Cho e
Harvey (1974 e 1976). O método de oxidação de HPAs com dicromato de sódio em
anidrido acético/ácido acético leva à formação de uma mistura de quinonas com
ótimo rendimento (~ 90%). Tal método de oxidação foi utilizado por Platt et al.
(2002) para obtenção de quinonas do antantreno. Para obtenção de hidroquinonas,
incubamos a mistura de quinonas com NaBH4/dimetilformamida como descrito por
40
Cho e Harvey (1976). Para incubação com as células, as hidroquinonas foram
acetiladas com anidrido acético/piridina, pois na sua forma livre as hidroquinonas
são rapidamente oxidadas de volta para quinonas (Cho e Harvey, 1976). O método
utilizado está descrito no item 3.3. Os cromatogramas obtidos para o antantreno,
quinonas e hidroquinonas acetiladas, bem como seus espectros de absorbância,
estão apresentados na figura 4.1. Na figura 4.2 são apresentados os espectros de
massas das quinonas e hidroquinonas acetiladas.
41
Figura 4.1: Cromatogramas obtidos por HPLC/UV (λ = 254nm) do antantreno e seus
produtos de oxidação. Condição cromatográfica descrita no item 3.3.1.a. Estão apresentados
os espectros de absorbância dos picos indicados.
42
Figura 4.2: Espectros de massas do antantreno e seus produtos de oxidação apresentados
na figura 4.1. Condição descrita no item 3.3.1.b.
4.2. Investigação da toxicidade do antantreno e seus produtos de oxidação
em células humanas em cultura
Foram utilizadas duas linhagens celulares de fígado humano para a
verificação da citotoxicidade do antantreno e seus produtos de oxidação (mistura
de quinonas e hidroquinonas acetiladas): uma linhagem de carcinoma
hepatocelular humano (HepG2) e uma linhagem de fígado humano normal (THLE-
2).
Nas figuras 4.3 e 4.4 são apresentados os dados de sobrevivência relativa
das células HepG2 e THLE-2, respectivamente. Ambas as linhagens cresceram
sobre filme de colágeno para que fosse possível fazer a comparação.
43
Figura 4.3: Viabilidade (MTT) de células HepG2 incubadas com: DMSO (controle), N =
antantreno, Q = quinonas e HQ = hidroquinonas acetiladas. Células crescidas sobre filme de
colágeno. Os valores mostram a média ± desvio padrão de quatro experimentos distintos
*p< 0,05 (one-way Analysis of variance – ANOVA em relação ao controle).
Figura 4.4: Viabilidade (MTT) de células THLE-2 incubadas com: DMSO (controle), N =
antantreno, Q = quinonas e HQ = hidroquinonas acetiladas. Células crescidas sobre filme de
colágeno. Os valores mostram a média ± desvio padrão de quatro experimentos distintos
*p< 0,05 (one-way Analysis of variance – ANOVA em relação ao controle).
44
Observamos maior sensibilidade das células THLE-2 ao antantreno e à
mistura de hidroquinonas acetiladas, sendo bem evidente a diferença de toxicidade
do antantreno entre as duas linhagens. Entretanto, ambas as linhagens se
mostraram igualmente sensíveis à mistura de quinonas, sugerindo que o
metabolismo via CYP450 não seja tão importante neste caso, o que precisa ser
melhor investigado. A oxidação monoeletrônica do antantreno e hidroquinonas leva
à formação de radicais que podem reagir com macromoléculas e contribuir para a
maior toxicidade em relação às quinonas, que precisam ser reduzidas para
hidroquinonas por sistemas enzimáticos para, então, exercerem seus efeitos
tóxicos. Nos dois casos, o antantreno foi mais tóxico que seus produtos de
oxidação. Alguns fatores que podem contribuir para a maior toxicidade do
antantreno são a facilidade de penetração nas células (antantreno é mais
lipossolúvel que seus produtos de oxidação) e a reação dos produtos de oxidação
com constituintes do meio de cultura, reduzindo sua disponibilidade para as
células. Verificamos, ainda, a diminuição da sobrevivência das células com o
aumento da concentração dos compostos (citotoxicidade dose-dependente).
Nas figuras 4.5 e 4.6 são apresentados os dados de sobrevivência relativa
das células HepG2 cultivadas em meio DME e em meio de Earle modificado,
respectivamente. Nesse caso não foi utilizado filme de colágeno para o
crescimento das células. Observamos que as células cultivadas em meio de Earle
modificado foram mais sensíveis aos efeitos tóxicos das maiores concentrações de
antantreno utilizadas (100 e 200 µM). Não foi observada diferença de toxicidade de
quinonas e hidroquinonas entre as diferentes condições de cultura.
45
Figura 4.5: Viabilidade (MTT) de células HepG2 incubadas com: DMSO (controle), N =
antantreno, Q = quinonas e HQ = hidroquinonas acetiladas. Células cultivadas em meio
DME. Os valores mostram a média ± desvio padrão de quatro experimentos distintos
*p< 0,05 (one-way Analysis of variance – ANOVA em relação ao controle).
Figura 4.6: Viabilidade (MTT) de células HepG2 incubadas com: DMSO (controle), N =
antantreno, Q = quinonas e HQ = hidroquinonas acetiladas. Células cultivadas em meio de
Earle modificado. Os valores mostram a média ± desvio padrão de quatro experimentos
distintos *p< 0,05 (one-way Analysis of variance – ANOVA em relação ao controle).
46
Como o antantreno na concentração de 20 µM já levava à morte de 20 – 25% das
células HepG2, resolvemos verificar o nível de 8-oxodGuo no DNA dessas células
incubadas com antantreno, antantreno-quinonas e antantreno-hidroquinonas
acetiladas na concentração de 20 µM. As células foram incubadas e o DNA
extraído como descrito no item 3.4.2.2. Uma possível via de toxicidade de HPAs é
a indução de estresse oxidativo. Os dados obtidos na determinação de 8-oxodGuo
estão apresentados na figura 4.7. Observamos indução de dano oxidativo no DNA
das células incubadas com antantreno-quinonas ou antantreno-hidroquinonas
acetiladas.
Figura 4.7: Níveis de 8-oxodGuo em células HepG2 controles e incubadas com antantreno
e seus produtos de oxidação (quinonas e hidroquinonas acetiladas, concentração utilizada:
20 µM). Condições descritas no item 3.4.2.2.. Os valores mostram a média ± desvio padrão
de quatro experimentos distintos *p< 0,05 (one-way Analysis of variance – ANOVA em
relação ao controle).
47
4.3. Análise de formação de adutos a partir de incubações in vitro de 2’-
desoxiguanosina ou DNA com produtos de oxidação do antantreno
Além do dano oxidativo em DNA, outra possível via de indução de mutações
por antantreno seria a formação de adutos antantreno-DNA, o que também ainda
não foi investigado na literatura. A forma mais simples de se verificar se um
determinado composto interage com bases do DNA é através de incubações in
vitro de desoxirribonucleosídeos com o composto na sua forma reativa e análise
por HPLC (PDA, UV, fluorescência ou ESI/MS). No caso da análise por
HPLC/ESI/MS, ao haver a modificação da base do desoxirribonucleosídeo,
observa-se caracteristicamente um fragmento no espectro de massas
correspondente à perda da desoxirribose ([M – 116 + H]+), o que ajuda a identificar
possíveis adutos.
Iniciamos, portanto, a verificação de formação de adutos incubando dG,
antantreno e H2O2 como descrito no item 3.5.1 de Materiais e Métodos. Amostras
controles sem dG ou sem antantreno também foram incubadas. A análise das
reações por HPLC/ESI/MS e HPLC-UV (λ = 250 nm) revelou a formação de
produtos na incubação completa que estavam ausentes nos controles (Figura 4.8).
Um dos produtos apresentou íon molecular [M + H]+ com m/z 588 e um fragmento
[M – 116 + H]+ com m/z 472 (voltagem do cone = 50 V) (Figura 4.9). Tal produto
pode ser resultante da reação do grupo amino exocíclico da dG com uma molécula
de antantreno epoxidada em duas posições. Um dos epóxidos seria hidrolisado
para o dihidrodiol e oxidado para a quinona correspondente. O outro epóxido
reagiria com o grupo amino exocíclico da dG, abrindo para C-OH e sendo oxidado
para C=O (Figura 4.10). Incubações posteriores com maiores concentrações de
antantreno visando obter maior quantidade do possível aduto para coleta e
caracterização via ressonância magnética nuclear (RMN) não levaram mais à sua
formação. Uma possível explicação seria que a diminuição da proporção
dG/antantreno nas incubações posteriores tivesse favorecido a reação entre as
próprias moléculas do HPA oxidado e, com isso, teria sido desfavorecida a reação
com dG. De fato, nova incubação com a proporção dG/antantreno da incubação
inicial voltou a apresentar a formação do mesmo aduto.
48
Figura 4.8: Cromatogramas obtidos por HPLC-UV (λ = 250 nm) das incubações: (A)
antantreno + H2O2; (B) dG + H2O2; (C) dG + antantreno + H2O2. Flecha indicando a
formação de produtos na incubação de dG + antantreno + H2O2 que não se observam nas
amostras controles (antantreno + H2O2 e dG + H2O2).
49
100 200 300 400 500 600
m/z
0
100
0
100
Inte
nsid
ade
Rel
ativ
a (%
)588
588
472
273210
142
273
142
Cone : 30 V
Cone : 50 V
OH
O
OH
NN
NNH
O
NH
O O
O
[M+H-dR]+ = 472
[M+H]+ = 588
Figura 4.9: Espectros de massas obtidos do pico eluído em 47,6 min na figura 4.8.
50
Figura 4.10: Possível via de formação do aduto antantreno-dG
Realizamos também incubações de DNA com antantreno utilizando o sistema
HRP/H2O2 descrito no item 3.5.2. Como mencionado anteriormente, o baixo
potencial de ionização do antantreno (6,96 eV) propicia sua oxidação enzimática
para cátion-radicais, os quais são espécies eletrofílicas que podem modificar
covalentemente o DNA e outras biomoléculas.
Devido à grande fluorescência desses compostos, uma forma de se analisar a
ligação do HPA ao DNA é através da obtenção de espectros de fluorescência do
DNA na faixa de emissão de fluorescência do HPA em um determinado
comprimento de onda de excitação (Kishikawa et al., 2003; Wang et al., 2005;
Watanabe et al., 2005). É importante que o DNA seja bem lavado após a
incubação para que não haja a interferência de moléculas de HPA livres na solução
no momento de obtenção dos espectros. Obtivemos, portanto, espectros de
fluorescência (emissão) das amostras de DNA das incubações em diferentes
comprimentos de onda de excitação e, ao fixarmos λexc. em 314 nm, obtivemos
espectros de emissão que diferiam entre as soluções de DNA controle,
DNA/antantreno/HRP/H2O2, e antantreno, como apresentado na figura 4.11 (o
51
DNA da incubação completa possui um λmáx. de emissão em 445 nm, o qual está
deslocado em relação aos controles). Esses dados constituem forte indício de
ligação do antantreno ao DNA nas incubações realizadas na presença de
HRP/H2O2 e foram confirmados em novas incubações (dados não apresentados).
Figura 4.11: Espectros de emissão de fluorescência (λexc. = 314 nm) do DNA incubado com
antantreno/HRP/H2O2, do DNA controle e do antantreno.
O DNA incubado com antantreno/HRP/H2O2 e o DNA controle (verificar item
3.5.2 de Materiais e Métodos) foram hidrolisados enzimaticamente e analisados por
HPLC/UV/Fluorescência, como descrito no item 3.5.2.2 de Materiais e Métodos. É
possível observar nos cromatogramas apresentados na figura 4.12 a presença de
alguns produtos no DNA da incubação com antantreno que estão ausentes no DNA
controle (tanto na detecção por fluorescência quanto na detecção por UV).
52
Figura 4.12: Cromatogramas obtidos por HPLC/UV/Fluorescência do DNA incubado com
antantreno/HRP/H2O2 e do DNA controle. Condições descritas no item 3.5.2.2 de Materiais
e Métodos. Incubação completa (DNA/antantreno/HRP/H2O2) revelando a formação de
produtos (indicados por frações 1,2 e 3) que não são encontrados nas suas respectivas
amostras controle (DNA controle), tanto por detecção por HPLC/UV como
HPLC/fluorescência (os nucleosídeos são apontados com as abreviações: dC, dG, dT e dA).
53
Quinonas e hidroquinonas do antantreno obtidas como descrito no item 3.3
de Materiais e Métodos (neste caso, hidroquinonas não acetiladas) foram também
incubadas com DNA/HRP/H2O2 e, após hidrólise enzimática, o DNA foi analisado
por HPLC/UV/Fluorescência, comparando-se com DNA controle. Nos dois casos
também verificamos a formação de produtos na detecção por UV e por
fluorescência que não aparecem no DNA controle (Figuras 4.13 e 4.14).
54
Figura 4.13: Cromatogramas obtidos por HPLC/UV/Fluorescência do DNA incubado com
antantreno-quinonas/HRP/H2O2 e do DNA controle. Condições descritas no item 3.5.2.2 de
Materiais e Métodos, revelando a formação de produtos (indicados por frações 1, 2 e 3) que
não são encontrados nas suas respectivas amostras controle (DNA controle) (os
nucleosídeos são apontados com as abreviações: dC, dG, dT e dA).
55
Figura 4.14: Cromatogramas obtidos por HPLC/UV/Fluorescência do DNA incubado com
antantreno-hidroquinonas/HRP/H2O2 e do DNA controle. Condições descritas no item
3.5.2.2 de Materiais e Métodos, revelando a formação de produtos (indicados por frações
1,2) que não são encontrados nas suas respectivas amostras controle (DNA controle), tanto
por detecção por HPLC/UV como HPLC/fluorescência (os nucleosídeos são apontadas
com as abreviações: dC, dG, dT e dA).
56
5. Discussão
Muitos estudos são feitos com o intuito de identificar substâncias tóxicas
presentes no meio ambiente, mas a correta avaliação da exposição humana aos
múltiplos compostos químicos é um desafio (Sato e Aoki, 2002; Claxton et al.,
2004). O maior interesse está em substâncias envolvidas nos complexos
mecanismos do câncer. O teste feito com Salmonella typhimurium tem sido um
ensaio conveniente e muito utilizado para avaliação da atividade genotóxica de
substâncias (Claxton et al., 2004).
Há um grande interesse em identificar efeitos adversos à saúde humana
causados por poluentes presentes no meio ambiente. Centenas de compostos
químicos, incluindo HPAs, compostos orgânicos nitrados e halogenados, ácidos
orgânicos e compostos orgânicos metálicos têm sido identificados como poluentes
em amostras do ar. Alguns dos HPAs presentes como contaminates do ar, água,
solo e alimentos possuem a propriedade de lesar o DNA após biotransformação,
sendo que dentre as possíveis lesões está a formação de adutos. Adutos de DNA
podem levar a mutações após a replicação. A exposição a poluentes pode induzir
ainda a geração de espécies reativas de oxigênio, que também podem lesar o DNA
e outras biomoléculas. Adutos de DNA são potenciais marcadores de exposição a
substâncias genotóxicas, podendo ser dosados em sangue, urina ou células
extraídas de mucosas.
No nosso trabalho investigamos a possibilidade de o antantreno, um HPA
sem a região de baía ou fjord, lesar o DNA (dano oxidativo, formação de adutos),
uma vez que o estudo realizado por Platt et al. (2002) revelou que esse HPA é
mutagênico na presença de fração S9 em ensaios com diferentes linhagens de S.
typhimurium (TA97, TA98, TA100 e TA104). Sua mutagenicidade é comparável à
do benzo[a]pireno, um HPA que possui região de baía e é carcinogênico (Platt et
al., 2002).
Diante das informações de que produtos de biotransformação do antantreno
eram os responsáveis pelos efeitos mutagênicos observados em Salmonella
typhimurium, resolvemos utilizar um procedimento para obtenção de quinonas e
hidroquinonas do antantreno, como descrito por Cho e Harvey (1974 e 1976). O
método de oxidação de HPAs com dicromato de sódio em anidrido acético⁄ácido
acético leva à formação de uma mistura de quinonas com ótimo rendimento
57
(~90%). Tal método de oxidação foi utilizado por Platt et al., (2002) para obtenção
de quinonas do antantreno. Para obtenção de hidroquinonas, incubamos a mistura
de quinonas com NaBH4/dimetilformamida como descrito por Cho e Harvey (1976).
Para incubação com as células, as hidroquinonas foram acetiladas com anidrido
acético⁄piridina, pois na sua forma livre as hidroquinonas são rapidamente oxidadas
de volta para quinonas (Cho e Harvey, 1976) (Figuras 4.1 e 4.2). Alguns dos
metabólitos mutagênicos do antantreno identificados por Platt et al. (2002) foram
1,6-, 3,6- e 6,12-quinonas. Essas quinonas polinucleares não são intrinsecamente
mutagênicas, necessitando de biotransformação (fração S9) para que a
mutagenicidade seja observada (Platt et al., 2002).
O baixo potencial de ionização do antantreno (6,96 eV) propicia sua oxidação
enzimática ou autoxidação para cátion-radicais, que na presença de oxigênio,
originam as quinonas polinucleares acima (Cavalieri et al., 1983; Reed et al., 2003).
Os cátion-radicais intermediários são espécies eletrofílicas que, ao serem geradas
nos seres vivos, podem modificar covalentemente o DNA e outras biomoléculas. As
quinonas polinucleares podem ser formadas por oxidação de HPAs no meio
ambiente (p.ex.: oxidação por luz UV) (Zhang et al., 2004; Crallan et al., 2005; Gao
e col., 2005; Toyooka et al., 2006) ou por ação de enzimas, tais como peroxidases
e monooxigenases, nos sistemas vivos. Como exemplo, estudos mostram que
peroxidases convertem BP para uma mistura de 1,6-, 3,6- e 6,12-quinonas, as
quais possuem efeito citotóxico, levando a uma diminuição da proliferação de
células epiteliais pulmonares humanas in vitro (Reed et al., 2003) . As reações de
oxidação atmosférica e biológica podem levar à conversão significativa de HPAs
para quinonas. Tais quinonas podem ser reduzidas enzimaticamente e entrar em
um ciclo redox, catalisando a geração de espécies reativas de oxigênio. O
intermediário semiquinona gerado nesse processo também pode se adicionar a
macromoléculas celulares, formando adutos (Reed et al., 2003; Zhang et al., 2004;
Tooyoka et al., 2006).
Para investigarmos a citotoxicidade do antantreno e seus produtos de
oxidação (quinonas e hidroquinonas acetiladas), utilizamos duas linhagens
celulares de fígado humano: uma linhagem de carcinoma hepatocelular humano
(HepG2) e uma linhagem de fígado humano normal (THLE-2).
A linhagem HepG2 é muito utilizada em estudos toxicológicos. Ela retém
algumas funções de biotransformação de fase I e fase II, apesar de suas atividades
58
serem geralmente mais baixas que as encontradas em hepatócitos primários
(Harris et al., 2004; Sevastyanova et al., 2007). No caso do crescimento dessa
linhagem em meio DME, a atividade de CYP450 verificada foi 5 – 10 vezes menor
que a atividade encontrada em hepatócitos humanos recém isolados, enquanto as
atividades de glicuroniltransferase e glutationa-S-transferase foram semelhantes
(Doostdar et al., 1988). No entanto, a atividade de CYP450 pode ser modulada
pela composição do meio de cultura dessas células, como demonstrado por
Doostdar et al. (1988) que verificaram um aumento de 498%, 4700%, 2957% e
750% nas atividades de metoxiresorufina-o-dealquilase (MROD), etoxiresorufina-o-
dealquilase (EROD), benziloxiresorufina-o-dealquilase (BROD) e pentoxiresorufina-
o-dealquilase (PROD), respectivamente, quando células HepG2 cresceram em
meio de Earle modificado em relação às crescidas no meio DME (Doostdar et al.,
1988).
A linhagem THLE-2 é derivada de células primárias de fígado humano normal
por infecção com SV40. Expressa características fenotípicas de células epiteliais
de fígado adulto normal (Harris et al., 2004). Há poucos trabalhos na literatura
comparando as respostas de células HepG2 e hepatócitos humanos primários em
cultura (ou células com características de hepatócitos primários, como é o caso da
linhagem THLE-2) a estímulos externos. Diferenças na expressão gênica e,
conseqüentemente, nas respostas celulares são esperadas entre uma linhagem
transformada e proliferante (HepG2) e uma linhagem mais diferenciada e de
proliferação mais lenta (THLE-2) (Harris et al., 2004). As células HepG2 são
deficientes na expressão de muitas isoformas de CYP450 (ex., apresentam níveis
baixos ou não detectáveis de CYP2E1) e álcool desidrogenase. São, portanto,
resistentes aos efeitos citotóxicos do etanol, sendo que hepatócitos primários são
sensíveis a esses efeitos (Harris et al., 2004; Knasmüller et al., 2004; Staal et al.,
2006; Sevastyanova et al., 2007).
Uma vez que o cultivo e proliferação das células HepG2 é mais fácil que o
das células THLE-2 e uma vez que para extração de DNA para análise de lesões
necessitamos de grande quantidade de células (aproximadamente 3x107 células),
resolvemos comparar primeiramente a sensibilidade de ambas as linhagens ao
antantreno e seus produtos de oxidação. Observando-se respostas semelhantes
das duas linhagens nos ensaios de citotoxicidade, poderíamos então utilizar as
células HepG2 (tumorais, de proliferação mais rápida e cultivo mais fácil) para
59
análise do dano oxidativo em DNA. Investigamos também se a alteração da
composição do meio de cultura (meio DME x meio de Earle modificado como
descrito por Doostdar et al., 1988) levaria a respostas diferentes (citotoxicidade)
das células HepG2.
Nas figuras 4.3 e 4.4 são apresentados os dados de sobrevivência relativa
das células HepG2 e THLE-2, respectivamente. Ambas as linhagens cresceram
sobre filme de colágeno para que fosse possível fazer a comparação.
De acordo com o esperado, observamos maior sensibilidade das células
THLE-2 ao antantreno e à mistura de hidroquinonas acetiladas, sendo bem
evidente a diferença de toxicidade do antantreno entre as duas linhagens.
Entretanto, ambas as linhagens se mostraram igualmente sensíveis à mistura de
quinonas, sugerindo que o metabolismo via CYP450 não seja tão importante neste
caso, o que precisa ser melhor investigado. A oxidação monoeletrônica do
antantreno e hidroquinonas leva à formação de radicais que podem se adicionar a
macromoléculas e contribuir para a maior toxicidade em relação às quinonas, que
precisam ser reduzidas para hidroquinonas por sistemas enzimáticos para, então,
exercerem seus efeitos tóxicos. Nos dois casos, o antantreno foi mais tóxico que
seus produtos de oxidação. Alguns fatores que podem contribuir para a maior
toxicidade do antantreno são a facilidade de penetração nas células (antantreno é
mais lipossolúvel que seus produtos de oxidação) e a reação dos produtos de
oxidação com constituintes do meio de cultura, reduzindo sua disponibilidade para
as células. Verificamos, ainda, a diminuição da sobrevivência das células com o
aumento da concentração dos compostos (citotoxicidade dose-dependente), como
esperado.
Nas figuras 4.5 e 4.6 são apresentados os dados de sobrevivência relativa
das células HepG2 cultivadas em meio DME e em meio de Earle modificado,
respectivamente. Nesse caso não foi utilizado filme de colágeno para o
crescimento das células. Observamos que as células cultivadas em meio de Earle
modificado foram mais sensíveis aos efeitos tóxicos das maiores concentrações de
antantreno utilizadas (100 e 200 µM). Não foi observada diferença de toxicidade de
quinonas nas diferentes condições de cultura e no caso da exposição a
hidroquinonas (100 e 200 µM) houve maior sobrevivência relativa das células
HepG-2 cultivadas no meio de Earle modificado. Para verificarmos se o meio de
Earle que utilizamos está, realmente, levando ao aumento de atividade de CYP450
60
nas células HepG2, como descrito por Doostdar et al., 1988, é necessário fazer a
determinação da atividade EROD cultivando essas células nos dois tipos de meio.
A determinação pode ser feita no próprio meio de crescimento das células,
adicionando-se 7-etoxiresorufina que é o-desetilada para resorufina na presença
de atividade de CYP450 (principalmente CYP1A1). A concentração de resorufina é
determinada por medida da fluorescência de uma alíquota do meio de cultura em
590 nm (λexc. = 530 nm) (Donato et al., 1993). Ao compararmos a sobrevivência
relativa das células THLE-2 (Figura 4.4) com a das células HepG2 em meio DME
sem utilização de filme de colágeno (Figura 4.5), verificamos que as duas
linhagens foram igualmente sensíveis aos efeitos tóxicos do antantreno e seus
produtos de oxidação. Pudemos, portanto, utilizar as células HepG2 para a análise
de dano oxidativo no DNA. Como o antantreno na concentração de 20µM já levava
à morte de 20-25% das células, verificamos o nível de 8-oxodGuo nas células
HepG2 incubadas com antantreno, quinonas e hidroquinonas acetiladas na
concentração de 20µM. Como pode ser observado na Figura 4.7., quinonas e
hidroquinonas acetiladas do antantreno levaram ao aumento significativo do nível
de 8-oxodGuo no DNA das células, o mesmo não sendo observado para o
antantreno. Quinonas e hidroquinonas podem participar de ciclos redox e levar à
geração de grande quantidade de espécies reativas de oxigênio que acabam
danificando biomoléculas. Radicais HO• gerados a partir da redução de H2O2 por
metais de transição presentes no DNA nuclear atacam a posição C-8 da
desoxiguanosina, originando a lesão 8-oxodGuo.
A indução de dano oxidativo por esses compostos em organismos expostos
pode levar ao desenvolvimento de doenças crônicas, como o câncer, porém os
mecanismos cruciais ainda precisam ser desvendados (Harri et al., 2005; Rybicki et
al., 2006; Garte et al., 2007; Nilsson et al., 2007).
Além do dano oxidativo em DNA, outra possível via de indução de mutações
seria a formação de adutos HPA-DNA, como é demonstrado na literatura em testes
in vitro e in vivo feitos principalmente com HPAs comprovadamente carcinogênicos
(p.ex.: benzo[a]pireno, benzo[a]antraceno, ciclopenta[c,d]pireno, dibenzo[a,l]pireno)
(Cizmas et al., 2004; Park et al.,2004; Palmqvist et al., 2006 Tai et al., 2007). A
formação de adutos antantreno-DNA não foi anteriormente investigada na
literatura.
61
A forma mais simples de se verificar se um determinado composto interage
com bases do DNA é através de incubações in vitro de desoxirribonucleosídeos
com o composto na sua forma reativa e análise por HPLC (PDA, UV, fluorescência
ou ESI/MS). No caso da análise por HPLC/ESI/MS, ao haver a modificação da
base do desoxirribonucleosídeo, observa-se caracteristicamente um fragmento no
espectro de massas correspondente à perda da desoxirribose ([M – 116 + H]+), o
que ajuda a identificar possíveis adutos (Loureiro et al., 2000; Martinez et al., 2003;
Márquez et al., 2004; Hermida et al., 2006).
Iniciamos, portanto, nossa investigação de formação de adutos incubando dG,
antantreno e H2O2. A análise das reações por HPLC/ESI/MS e HPLC-UV (λ = 250
nm) revelou a formação de produtos na incubação completa que estavam ausentes
nos controles (Figura 4.8). Um dos produtos apresentou íon molecular [M + H]+
com m/z 588 e um fragmento [M – 116 + H]+ com m/z 472 (voltagem do cone = 50
V) (Figura 4.9). Tal produto pode ser resultante da reação do grupo amino
exocíclico da dG com uma molécula de antantreno epoxidada em duas posições.
Um dos epóxidos seria hidrolisado para o dihidrodiol e oxidado para a quinona
correspondente. O outro epóxido reagiria com o grupo amino exocíclico da dG,
abrindo para C-OH e sendo oxidado para C=O (Figura 4.10). A formação desse
produto foi confirmada em incubações posteriores nas quais a mesma proporção
dG/antantreno/H2O2 foi mantida. Entretanto, não foi possível sua purificação para
confirmação estrutural via RMN.
Como é de conhecimento geral o potente carcinógeno benzo[a]pireno exerce
sua atividade carcinogênica após ser biotransformado, principalmente pelo fígado,
produzindo espécies eletrofilicas que podem reagir covalentemente com várias
macromoléculas, formando adutos (Stansbury et al., 2002; Garry et al., 2003;
Fields et al., 2004). Há muitos experimentos descritos na literatura à respeito da
formação de adutos de DNA após bioativação de xenobióticos utilizando
microssomos de fígado de ratos e camundongos (Yoon et al., 2004; Svihalkova et
al., 2007). Realizamos também incubações de DNA com antantreno utilizando o
sistema HRP/H2O2. Como mencionado anteriormente e segundo Cavalieri et al.,
(1983) o baixo potencial de ionização do antantreno (6,96 eV) propicia sua
oxidação enzimática para cátion-radicais, os quais são espécies eletrofílicas que
podem modificar covalentemente o DNA e outras biomoléculas. Os cátion-radicais
são obtidos por meio da remoção de um elétron, ocorrendo mais facilmente a
62
formação desses intermediários para HPAs com potencial de ionização (PI) menor
que 7,35 eV. Outros fatores importantes para a reação com alvos celulares incluem
a localização da carga no cátion-radical, orientação e geometria adequada
(Cavalieri et al., 1983). O sistema HRP/H2O2 é conhecido por catalizar a oxidação
de um elétron de uma série de substâncias. Evidências apresentadas sugerem que
o sistema HRP/H2O2 leva à ligação de HPAs ao DNA (Cavalieri et al., 1983).
Devido à grande fluorescência desses compostos, uma forma de se analisar a
ligação do HPA ao DNA é através da obtenção de espectros de fluorescência do
DNA na faixa de emissão de fluorescência do HPA em um determinado
comprimento de onda de excitação (Kishikawa et al., 2003; Watanabe et al., 2005).
É importante que o DNA seja bem lavado após a incubação para que não haja a
interferência de moléculas de HPA livres na solução no momento de obtenção dos
espectros. Obtivemos, portanto, espectros de fluorescência (emissão) das
amostras de DNA das incubações em diferentes comprimentos de onda de
excitação e, ao fixarmos λexc. em 314 nm, obtivemos espectros de emissão que
diferiam entre as soluções de DNA controle, DNA/antantreno/HRP/H2O2, e
antantreno, como apresentado na figura 4.11 (o DNA da incubação completa
possui um λmáx. de emissão em 445 nm, o qual está deslocado em relação aos
controles). Esses dados foram confirmados em novas incubações (dados não
mostram) com os espectros de emissão das amostras de DNA diferindo entre as
incubações controle. Esses resultados constituem forte indício de ligação do
antantreno ao DNA nas incubações realizadas na presença de HRP/H2O2.
O DNA incubado com antantreno/HRP/H2O2 e o DNA controle foram
hidrolisados enzimaticamente e analisados por HPLC/UV/Fluorescência.
Quinonas e hidroquinonas do antantreno (neste caso, hidroquinonas não
acetiladas) foram também incubadas com DNA/HRP/H2O2 e, após hidrólise
enzimática, o DNA foi analisado por HPLC/UV/Fluorescência, comparando-se com
DNA controle. Em todos os casos verificamos a formação de produtos na detecção
por UV e por fluorescência que estavam ausentes no DNA controle (Figuras 4.12,
4.13 e 4.14). Esses dados indicam a ligação de produtos de oxidação do
antantreno ao DNA. Entretanto, as estruturas dos possíveis adutos gerados ainda
precisam ser elucidadas.
63
6. Conclusões
Este trabalho possibilitou a obtenção de novos dados, ainda não
mencionados na literatura, que mostram que o antantreno e produtos de sua
oxidação em baixas concentrações (20µM) são citotóxicos para linhagens celulares
de fígado humano em cultura. Ao compararmos a citotoxicidade em células HepG2
(tumorais) submetidas a diferentes condições de cultivo com a citotoxicidade em
células THLE-2 (normais) verificamos respostas semelhantes das células HepG2
crescidas em meio DME sem filme de colágeno e das células THLE-2 crescidas no
meio PFMR-4 sobre filme de colágeno. Diante dessa observação, mostrou-se
muito mais conveniente o cultivo das células HepG2 para análise de dano
oxidativo, uma vez que necessitamos de um número grande de células que é mais
facilmente atingido por essa linhagem. Nas incubações das células HepG2 com
antantreno ou seus produtos de oxidação, verificamos a indução de formação de 8-
oxodGuo no DNA por baixas concentrações de quinonas e hidroquinonas
acetiladas do antantreno (20µM).
Paralelamente, em incubações in vitro de dG ou DNA com antantreno
oxidado química ou enzimaticamente, observamos a ligação desse HPA às
moléculas estudadas. No caso das incubações com dG, houve a formação
reprodutiva de um aduto com m/z 588 ([M+H]+), cuja estrutura e via de formação
foram sugeridas, mas precisam ser confirmadas por RMN após futura purificação
de massa suficiente dessa lesão. No caso das incubações com DNA utilizando o
sistema HRP/H2O2, observamos alteração do espectro de fluorescência do DNA
indicando sua ligação ao HPA. Além disso, o DNA hidrolisado enzimaticamente e
analisado por HPLC/UV/Fluorescência revelou a presença de produtos ausentes
no controle. Os dados obtidos até o momento nos indicam que duas vias podem
estar envolvidas na genotoxicidade do antantreno observada nos estudos com S.
typhimurium realizados por Platt et al., (2002): indução de dano oxidativo e
formação de adutos com o DNA.
64
7. Referências bibliográfias:
ALBERTINI, R.; ANDERSON, J.D.; DOUGLAS, G.R.; HAGMAR, L.; HEMMINKI, K.; MERLO, F.; NATARAJAN, A.T.; NORPPA, H.; SHUKER, D.E.; TICE, R.; WATERS, W.D.; AITIO, A. IPC guidelines for the monitoring of genotóxica effects of carcinogens in humans. International programe safety. Mutation Research, v.463, p.111-172, 2000.
ALLAN, L.L.; SCHLEZINGER, J.J.; SHANSAB, M.; SHERR, D.H. CYP1A1 in polycyclic aromatic hydrocarbon - induced B lymphocyte growth suppression. Biochemical and Biophysical Research Communications, v.342, p.227-235, 2006.
AMERICAN CONFERENCE OF GOVERNMENTAL INDUSTRIAL HYGIENIST. 2003 TLVs and BEIs: based on documentation for threshold limit values for chemical substances and physical agents & biological exposure indices. Cincinnati: ACGIH, 2003. 219p.
AMIN, S.; LIN, J.M., KRZEMINSKI, J.; BOYIRI, T., DESAI, D.; EL-BAYOUMY, K. Metabolism of benzo[c]chrysene and comparative mammary gland tumorigenesis of benzo[c]chrysene bay and fjord region diol epoxides in female CD rats. Chem. Res. Toxicol.v.16, p.227-231, 2003.
BELAND, A.F.; CHURCHUELL, M.I.; TUNGELN, L.S.V.; CHEN, S.; FU, P.P.; CULP, S.J.; SCHOKET, B.; GYORFFY, E.; MINÁROVITS, J.; POIRIER, M.C.; BOWMAN, E.D.; WESTON, A.; DOERGE, D.R. High-performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry for the detection and quantitation of benzo[a]pyrene-DNA adducts. Chemical Research in Toxicology, v.18, p.1306-1315, 2005.
BELOUSOVA, E.A.; RECHKUNOVA, N.I.; LAVRIK, O.I. Thermostable DNA polymerases can perform translesion synthesis using 8-oxoguanine and tetrahydrofuran-containing DNA templates. Biochimica et Biophysica Acta, v.1764, p.97–104, 2006.
BHATTACHARYA, S.; BARBACCI, D.C.; SHEN, M.; LIU, J.N.; CASALE, G.P. Extraction and purification of depurinated benzo[a]pyrene-adducted DNA bases from human urine by immunoaffinity chromatography coupled with HPLC and analysis by LC/quadrupole ion-trap MS. Chemical Research in Toxicology, v.16, p.479-486, 2003.
BIGGER, C.A.; PONTEN, I.; PAGE, J.E.; DIPPLE, A. Mutational spectra for polycyclic aromatic hydrocarbons in the supF target gene. Mutation Research, v.450, p.75-93, 2000.
65
BJORSETH, A.; RAMDAHL, T. Emission sources and recent progress in analytical chemistry. Handbook of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, v.2, p.416, 1985.
BOER, J.; HOEIJMAKERS, J.H. Nucleotide excision repair and human syndromes carcinogenesis. Carcinogenesis, v.21, p.453-460, 2000.
BOFFETTA, P.; JOURENKOVA, N.; GUSTAVSSON, P. Cancer risk from occupational and environmental exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. Cancer Causes & Control: CCC, v.8, p.444-472, 1997.
BOYSEN, G.; HECHT, S.S. Analysis of DNA and protein adducts of benzo[a]pyrene in human tissues using structure-specific methods. Mutation Research, v.543, p.17-30, 2003.
BRAITHWAITE, E.; WU, X.; WANG, Z. Repair of DNA lesions: mechanisms and relative repair efficiencies. Mutation Research, v.424, p.207-219, 1999.
BREIMER, L. H.; LINDHAL, T. DNA glycosylase activities for thymine residues damaged by ring saturation, fragmentation, or ring contraction are functions of endonuclease III in Escherichia coli. J. Biol. Chem, v.259, p.5543-5548,1984.
BUSBY Jr., W.F.; STEVENS, E.K.; KELLENBACH, E.R.; CORNELISSE, J.; LUGTENBURG, J. Dose-response relationships of the tumorigenicity of cyclopenta[cd]pyrene, benzo[a]pyrene and 6-nitrochrysene in a newborn mouse lung adenoma bioassay. Carcinogenesis, v.9, p.741-746, 1988.
CAVALIERI, E.L.; ROGAN, E.G.; ROTH, R.W.; SAUGIER, R.K.; HAKAM, A. The relationship between ionization potential and horseradish peroxidase⁄ hydrogen peroxide-catalyzed binding of aromatic hydrocarbons to DNA. Chem. Biol. Interactions, v.47, p.87-109, 1983.
CAVALIERI, E.L.; ROGAN, E.G. Central role of radical cations in metabolic activation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Xenobiotica, v.25, p.677-688, 1995.
CHAKRA, O.R.A.; JOYEUX, M.; NERRIÉRE, E,; STRUB, M.P.; NAVIER, D.Z. Genotoxicity of organic extracts of urban airborne particulate matter: An assessment within a personal exposure study. Chemosphere, v.66, p.1375-1381 2007.
CHANG, H.F.; HUFFER, D.M.; CHIARELLI, M.P.; BLANKENSHIP, L.R.; CULP, S.J.; CHO, B.P. Characterization of DNA adducts derived from syn-benzo[ghi]fluoranthene-3,4-dihydrodiol-5,5a-epoxide and comparative DNA binding studies with structurally-related anti-diolepoxides of benzo[ghi]fluoranthene and benzo[c]phenanthrene. Chemical Research in Toxicology, v.15, p.198-208, 2002b.
66
CHANG, H.F.; HUFFER, D.M.; CHIARELLI, M.P.; CHO, B.P. Characterization of DNA adducts and tetraols derived from anti-benzo[ghi]fluoranthane-3,4-dihydrodiol-5,5a-epoxide. Chemical Research in Toxicology, v.15, p.187-197, 2002a.
CHEN, Y.C.; HUNTER, D.J. Molecular Epidemiology of Câncer. CA Cancer J. Clin, v.55, p.45-54, 2005.
CHENG, S.C.; HILTON, B.D.; ROMAN, J.M.; DIPPLE, A. DNA adducts from carcinogenic and no carcinogenic enantiomers of benzo[a]pyrene dihydrodiol epoxide. Chemical Research in Toxicology, v.2, p.334-340, 1989.
CHO, H.; HARVEY, R.G. Synthesis of K-region quinones and arene oxides of polycyclic aromatic-hydrocarbons. Tetrahedron Letters, v.16, p.1491-1494, 1974.
CHO, H.; HARVEY, R.G. Synthesis of hydroquinone diacetates from polycyclic aromatic quinones. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1: Organic and Bio-Organic Chemistry, v.1, n.8, p.836-839, 1976.
CIGANEK, M.; NECA, J.; ADAMEC, V.; JANOSEK, J.; MACHALA, M. A combined chemical and bioassay analysis of traffic-emitted polycyclic aromatic hydrocarbons. Science of the Total Environment, v.335, p.141-148, 2004.
CIZMAS, L.; ZHOU, G.D.; SAFE, S.H.; MCDONALD, T.J.; ZHU, L.; DONNELLY, K.C. Comparative in vitro and in vivo genotoxicities of 7H-benzo[c]fluorene, manufactured gas plant residue (MGP), and MGP fractions. Environmental and Molecular Mutagenesis, v.43, p.159-168, 2004.
CLAXTON, L. D.; MATTHEWS, P. P.; WARREN, S. H. The genotoxicity of ambient outdoor air, a review: Salmonella mutagenicity. Mutation Research, V.567, P.347–399, 2004.
COUPIER, I.; PUJOL, P. Hereditary predispositions to gynaecological cancers. Gynécologie, Obstétrique & Fertilité, v.33, p.851-856, 2005.
CROSS, A.; SINHA, R. Meat-related mutagens/carcinogens in the etiology of colorectal cancer. Environmental and Molecular Mutagenesis, v.44, p.44-55, 2004.
DAI, D.; RAN, C.; HARVEY, R.G. Synthesis of o-quinone metabolites of carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons with 2’- deoxyribonucleosides. Organic Letters, v.7, p.999-1002, 2005.
DE BONT, R.; VAN LAREBEKE, N. Endogenous DNA damage in humans: a review of quantitative data. Mutagenesis, v.19, p.169-185, 2004.
67
DE KOK, T.M.; MOONEN, H.J.; VAN DELFT, J.; VAN SCHOOTEN, F.J. Methodologies for bulky DNA adduct analysis and biomonitoring of environmental and accupational. J. Chromatogr. B, v. 778, p.345-355, 2002.
DELEUZE, M.S. Valence one-electron and shake-up ionization bands of polycyclic aromatic hydrocarbons. III. Coronene, 1.2,6.7-dibenzopyrene, 1.12-benzoperylene, anthanthrene. Journal of Physical Chemistry A, v.108, n.42, p.9244-9259, 2004.
DEMPLE, B.; HARRISON, L. Repair of oxidative damage to DNA. Annu. Rev. Biochem, v.63, p.915-948, 1994.
DENNIS, M.J.; MASSEY, R.C.; CRIPPS, G.; VENN, I.; HOWARTH, N.; LEE, G. Factors affecting the polycyclic aromatic hydrocarbon content of cereals, fats and other food products. Food Additives & Contaminants, v.8, p.517-530, 1991.
DIXON, K.; KOPRAS, E. Genetic alterations and DNA repair in human carcinogenesis. Seminars in Cancer Biology, v.14, n.6, p.441-448, 2004.
DONATO, N.J.; YAN, D.H.; HUNG, M.C.; ROSENBLUM, M.G. Epidermal growth factor receptor expression and function control cytotoxic responsiveness to tumor necrosis factor in ME-180 squamous carcinoma cells. Cell Growth Differ, v.4 p.411-419, 1993.
DOR, F.; HAGUENOER, J.M.; ZMIROU, D.; EMPEREUR-BISSONNET, P.; JONGENEELEN, F.J.; NEDELLEC, V.; PERSON, A.; FERGUSON, C.C.; DAB, W. Urinary 1-hydroxypyrene as a biomarker of polycyclic aromatic hydrocarbons exposure of workers on a contaminated site: influence of exposure conditions. Journal of Occupational and Environmental Medicine, v.42, n.4, p.391-397, 2000.
DOOSTDAR, H.; DUTHIE, S.J.; BURKE, M.D.; MELVIN, W.T.; GRANT, M.H. The influence of culture medium composition on drug metabolising enzyme activities of the human liver derived HepG2 cell line. FEBS Lett,v.241, p.15-18, 1988.
DREIJ, K.; SUNDBERG, K.; JOHANSSON, A.S.; NORDLING, E.; SEIDEL, A.; PERSSON, B.; MANNERVIK, B.; JERNSTROM, B. Catalytic activities of human alpha class glutathione transferases toward carcinogenic dibenzo[a,l]pyrene diol epoxides. Chemical Research in Toxicology, v.15, p.825-831, 2002.
DREIJ, K.; SEIDEL, A.; BENGGT, J. Differential removal of DNA adducts derived from anti-diol epoxides of dibenzo[a,l]pyrene end benzo[a]pyrene in human cells. Chemical Research in Toxicology, v.18, p.655-664, 2005.
68
EISENSTADT, E.; GOLD, A. Cyclopenta[c,d]pyrene: a highly mutagenic polycyclic aromatic hydrocarbon. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.75, p.1667-1669, 1978.
FALCÓN, M.S.G.; AMIGO, S.G.; YUSTI, M.A.L.; LOZANO, J.S. Determination of benzo[a]pyrene in Some Spanish commercial smoked products by HPALC-FL. Food Additives & Contaminants, v.16, p.9–14, 1999.
FALLONE, F.; VILLARD, P.H.; DECOME, L.; SÉRÉE, E.; MÉO, M.; CHACON, C.; DURAND, A.; BARRA, Y.; LACARELLE, B. PPARα activation potentiates AhR-induced CYP1A1 expression. Toxicology, v.216, p.122-128, 2005.
FANOU, L.A.; MOBIO, T.A.; CREPPY, E.E.; FAYOMI, B.; FUSTONI, S,. MOLLER, P., KYRTOPOULOS, S., GEORGIADES, P., LOFT, S.; SANNI, A.; SKOV, H.; OVREBO, S.; AUTRUP, H. Survey of air pollution in Cotonou, Benin—air monitoring and biomarkers. Science of the Total Environment, v.358, p.85-96.
FARMER, P.B.; SINGH, R.; KAUR, B.; BINKOVA, S.B.; KALINA, I.; POPOV, T.P.; GARTE, S.; TAIOLI, E.; GABELOVA, A.; WASILEWSKAH, A.C. Molecular epidemiology studies of carcinogenic environmental pollutants Effects of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in environmental pollution on exogenous and oxidative DNA damage. Mutation Research, v,544, p.397-402, 2003.
FIALA, Z.; VYSKOCIL, A.; KRAJAK, V.; MASIN, V.; EMMINGER, S.; SRB, V.; TEJRAL, J. Polycyclic aromatic hydrocarbons. I. Environmental contamination and environmental exposure. Acta Medica, v.42, n.2, p.77-89, 1999.
FIELDS, W.R.; DESIDERIO, J.G.; LEONARD, R.M.L.; BURGER, E.E.; BROWM, B.G.; DOOLITTLE, D.J. Differential c-myc expression profiles in normal human bronchial epithelial cells following treatment with benzo[a]pyrene, benzo[a]pyrene-4,5 epoxide, and benzo[a]pyrene-7,8-9,10 diol epoxide. Molecular Carcinogenesis, v.40,p.79-89, 2004.
FLESHER, J.W.; MYERS, S.R. Bioalkylation of benz[a]anthracene as a biochemical probe for carcinogenic activity. Lack of bioalkylation in a series of six noncarcinogenic polynuclear aromatic hydrocarbons. Drug Metabolism and Disposition, v.18, p.163-167, 1990.
FLORIN, I.; RUTBERG, L.; CURVALL, M.; ENZELL, C.R. Screening of tobacco smoke constituents for mutagenicity using the Ames' test. Toxicology, v.15, p.219-232, 1980.
FRENZILLI, G.; SCARCELLI, V.; BARGA, I.B.; NIGRO, M.; FORLIN, L.; BOLOGNESI, C.; STURVE, J. DNA damage in eelpout (Zoarces viviparus) from Göteborg harbour. Mutation Research, v.552, 187-195, 2004.
69
GARCEA, G.; SHARMA, R.A.; DENNISON, A.; STEWARD, W.P.; GESCHER, A.; BERRY, D.P. Molecular biomarkers of colorectal carcinogenesis and their role in surveillance and early intervention. European Journal of Cancer, v.39, p.1041–1052, 2003.
GARRY, S.; NESSLANY, F.; ALIOUAT, M.; HAGUENOER, J.M.; MARZIN, D. Potent genotoxic activity of benzo[a]pyrene coated onto hematite measured by unscheduled DNA synthesis in vivo in the rat. Mutagenesis,v.18, p.449-455, 2003. GARTE, S.; TAIOLI, E.; POPOV, T.; KALINA, I.; SRAM, R.; FARMER, P. Role of GSTT1 deletion in DNA oxidative damage by exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons in humans. Int. J. Câncer, v.120, p.2499-2503, 2007.
GIRARD, P.M.; BOITEUX, S. Repair of oxidized DNA bases in the yeast Saccharomyces cerevisae. Biochimie, v.79, p.559-566, 1997.
GLASSSNER, B.J.; POSNICK, L.M.; SAMSON, L.D. The influence of DNA glycosylases on spontaneous mutation. Mut. Res. FUNDAM. Mol. Mech. Mutagen, v.400, p.33-44, 1998.
GODSCHALK, R.W.L.; VAN SCHOOTEN, F.J.; BARTSCH, H. A critical evaluation of DNA adducts as biological markers for human exposure to polycyclic aromatic compounds. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, v.36, p.1-11, 2003.
GOLDMAN, R.; ENEWOLD, L.; PELLIZZARI, E.; BEACH, J.B.; BOWMAN, E.D.; KRISHNAN, S.S.; SHIELD, P.G. Smoking increases carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons in human lung tissue. Cancer Research, v.61, p.6367-6371, 2001.
GRIMMER, G.; JACOB, J.; DETTBARN, G.; NAUJACK, K.W. Determination of urinary metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) for the risk assessment of PAH-exposed workers. International Archives of Occupational and Environmental Health, v.69, p.231-239, 1997.
HANSEN, M.B.; NIELESEN, S.E.; BERG, K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J. Immunol. Methods, v.119, p.203-210, 1989.
HARRI, M.; SVOBODA, P.; MORI, T.; MUTANEM, P.; KASAI, H.; SAVELA, K. Analysis of 8-hydroxydeoxyguanosine among workers exposed to diesel particulate exhaust: Comparison with urinary metabolites and PAH air monitoring. Free Radical Research, v.39, p.963-972, 2005.
HARRIS, C.C. Chemical and physical carcinogenesis: advances and perspectives for the 1990’s. Journal of Cancer Research, v.51, suppl., p.5013–5044, 1991.
70
HARRIS, A.J.; DIAL, S.L.; CASCIANO, D.A. Comparison of basal gene expression profiles and effects of hepatocarcinogens on gene expression in cultured primary human hepatocytes and HepG2 cells. Mutat. Res. v.18, 79-89, 2004.
HERMIDA, S.A.S.; POSARI, E.P.M.; SOUZA, D.B., CAMPOS, I.P.A.; GOMES, O.F.; DI MASCIO.; MEDEIROS, M.H.G.; LOUREIRO, A.P.M. 2’-deoxyguanosine, 2’-deoxycytidine, and 2’-deoxyadenosine adducts resulting from the reaction of tetrahydrofuran with DNA bases. Chem. Res. Toxicol., v.19, p.927-936, 2006.
HSIEH, Y.N.; HUANG, P.C.; SUN, I.W.; WHANG, T.J.; HSU, C.Y.; HUANG, H.H.; KUEI, C.H. Nafion membrane-supported ionic liquid-solid phase microextraction for analyzing ultra trace PAH’s in water samples. Analytica Chimica Acta, v.557, p.321-328, 2006.
HSU, C.H.; SKIPPER, P.L.; TANNENBAUM, S.R. DNA adduct formation by secondary metabolites of cyclopenta[cd]pyrene in vitro. Cancer Letters, v.136, p.137-141, 1999.
HU, S.W.; CHEN, C.C.; KUO, C.Y.; LIN, W.H.; LIN, P. Increased cytochrome P4501B1 gene expression in peripheral leukocytes of municipal waste incinerator workers. Toxicology Letters, v.160, p.112-120, 2006.
INTERNATIONAL AGENCY FOR RESEARCH ON CANCER. Working Group on the Evouation on the Carcinogenic Risk of Chemicals of Humans. Polynuclear aromatic compounds: chemical, environmental and experimental data. Lyon: IARC, 1983. (IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risk of chemicals to humans, v.32).
JANKOWIAK, R., ARIESE, F.; HEWER, A.; LUCH, A.; ZANZOW, D.; HUGHES, C.N.; PHILIPS, D.; SEIDEL, A.; PLATT, K.L.; OESCH, F.; SMALL, G.J. Struture, conformations, and repair of DNA addusts from dibenzo[a,l]pyrene: 32P-postlabeling and fluorescence studies. Chemical Research in Toxicology, v.11, p.674-685, 1998.
JARED, M.F., ROBBINS, S.B., AL-ZOUGHOOL, M., KANNAMKUMARATH, S.S., STRINGER, S.L., LARSON, J.S., CARUSO, J.A., TALASKO, G., STAMBROOKE, P.J., STRINGER, J.R. Co-mutagenic activity of arsenic and benzo[a]pyrene in mouse skin. V.588, p.35-46, 2005.
JÖGERSTAD, M.; SKOG, K. Genotoxicity of heat-processed foods. Mutation Research, v.574, p.156-172, 2005.
JOSEPHY, P.D.; MANNERVIK, B.; ORTIZ DE MONTELLANO, P.R. Molecular toxicology. New York: Oxford University Press, 1997. 368p.
71
KATCHER, H.L.; WALLACE, S.S. Characterization of the Escherichia coli X-ray endonuclease, endonuclease III. Biochemistry, v.22, p.4071-4081, 1983.
KATSOUYANNI, K.; PERSHAGEN, G. Ambient air pollution exposure and cancer. Cancer Causes & Control: CCC, v.8, p.284-291, 1997.
KAWAI, Y.; UCHIDA, K.; OSAWA, T. 2’-deoxycytidine in free nucleosides and double stranded DNA as the major target of lipid peroxidation products. Free Radical Biology & Medicine, v.36, p.529-541, 2004.
KNASMULLER, S.; MERCH-SUNDERMANN, V., KEVERKORDES, S.; DARROUDI, F.; HUBER, W.W.; HOELZL, C.; BICHLER, J.; MAJER, B.J. Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge. Toxicology, v.198, p.315-328, 2004.
KIPOPOULOU, A.M.; SAMARA, C. Bioconcentration of polycyclic aromatic hydrocarbons in vegetables grown in na industrial área. Environmental Pollution, v.105, p.369–380, 1999.
KISHIKAWA, N.; WADA, M.; KURODA, N.; AKIYAMA, S.; NAKASHIMA, K. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in milk samples by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. v.2, p.257-264, 2003.
KORASHY, H.M.; EL-KADI, A.O.S. The role of aryl hydrocarbon receptor and the reactive oxygen species in the modulation of glutathione transferase by heavy metals in murine hepatoma cell lines. Chemico-Biological Interactions, v.162, p.237-248, 2006.
KYRTOPOULOS, S.A.; GEORGIARDIS, P.; AUTRUP, H.; DEMOPOULOS, N.; FARMER, P.; HAUGEN, A.; KATSOUYANNI, K.; LAMBERT, B.; OVREBO, S.; SRAM, R.; STEFANOUS, G.; TOPINKA, J. Biomarkers of genotoxicity of urban air pollution: overview and descriptive data from a molecular epidemiology study on populations exposed to moderate-to-low levels of polycyclic aromatic hydrocarbons: the AULIS project. Mutation Research, v.496, p.207-228, 2001.
LAFONTAINE, M.; PAYAN, J.P.; DELSAUT, P.; MORELE, Y. Polycyclic aromatic hydrocarbons exposure in an artificial shooting target factory: assessment of 1-hydroxypirene urinary excretion as a biological indicator of exposure. Journal of Occupational and Environmetal Medicine, v.40, p.529-537, 2000..
LAWRENCE, B.P.; VORDERSTRASSE, B.A. Activation of the aryl hydrocarbon receptor diminishes the memory response to homotypic influenza virus infection but does not impair host resistance. Toxicological Sciences, v.79, p.304-314, 2004.
72
LIU, Y.; BEARD, W.A.; SHOCK, D.D.; PRASAD, R.; HOU, W.; WILSON, S.H. DNA Polymerase and flap endonucleases 1 enzymatic specificities sustain DNA synthesis for long patch base excision repair. Journal of Biological Chemistry, v.280, p.9665-9674, 2005.
LIU, W.X.; CHEN, J.L.; LIN, X.M.; TAO, S. Distribution and characteristics of organic micropollutants in surface from Bohai Sea. Environmental Pollution, v.140, p.4-8, 2006.
LOEB, A.L.; BECKMAN, R. A. Genetic instability in cancer: Theory and experiment. Seminars in Cancer Biology, v. 15, p.423-435, 2005.
LOTEM, J.; SACHS, L. Epigenetics wins over genetics: induction of differentiation in tumor cells. Seminars in Cancer Biology, v.12, p.339-346, 2002.
LOUREIRO, A.P.M.; DI MASCIO,P.; GOMES, O.F.; MEDEIROS, M.H.G. trans,trans-2,4-decadienal-induced 1,N2-etheno-2’-deoxyguanosine adduct formation. Chem. Res. Toxicol,. v.13, p.601-609, 2000.
LOUREIRO, A.P.M.; DI MASCIO, P.; MEDEIROS, M.H.G. Formação de adutos exocíclicos com bases de DNA: Implicações em mutagênese e carcinogênese. Química Nova, v.25, p.777-793, 2002b.
LUCH, A. Nature and nurture – lessons from chemical carcinogenesis. Nature Reviews Cancer, v.5, n.2, p.113-125, 2005.
MAHADEVAN, B.; LUCH, A.; BRAVO, C.F.; ATKIN, J.; STEPPAN, L.B.; PEREIRA, C.; KERKVLIET, N.I.; BAIRD, W.M. Dibenzo[a,l]pyrene enduced DNA adduct formation in lung tissue in vivo. Cancer Letters, v.227, p.25-32, 2005.
MALEJKA-GIGANTI, D.; BENNETT, K.K.; CULP, S.J.; BELAND, F.A.; SHINOZUKA, H.; BLISS, R.L. Suppression of 7,12-dimethylbenz[a]anthracene-induced mammary carcinogenesis by pre-initiation treatment of rats with b-naphthoflavone coincides with decreased levels of the carcinogens-derived DNA adducts in the mammary gland. Cancer Detection and Prevention, v.29, p.338-347, 2005.
MALKIN, R.; KIEFER, M.; TOLOS, W. 1-Hydroxypyrene levels in coal handling workers at a coke oven. Journal of Occupational and Environmetal Medicine, v.11, p.1141-1144, 1996.
73
MARLOWE, J.L.; PUGA, A. Aryl hydrocarbon receptor, cell cycle regulation, toxicity, and tumorigenesis. Journal of Cellular Biochemistry, v.96, p.1174-1184, 2005.
MARNETT, L.J.; PLASTARAS, J.P. Endogenous DNA damage and mutation. Trends in Genetics, v.17, p.214-221, 2001.
MARQUES, S. A.; LOUREIRO, A. P. M.; GOMES, O. F., GARCIA, C. M.; DI MASCIO, P.; MEDEIROS, M. H. G. Induction of 1,N2-etheno-2P-deoxyguanosine in DNA exposed to L-carotene oxidation products. FEBS Letters, v.560, p.125-130, 2004.
MARTINEZ, G.R.; LOUREIRO, A.P.M.; MARQUES, S.A.; MIYAMOTO, S.; YAMAGUCHI, L.F.; ONUKI, J., ALMEIDA, E.A.; GARCIA, C.C.M.; BARBOSA, L.F.; MEDEIROS, M.H.G.; DI MASCIO, P. Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutation Research, v.544, P.115-127, 2003.
MASTRANGELO, G.; MARZIA, V.; PARUZZOLO, P.; SAIA, B. Reduction of the lung cance risk among dairy ranchers: dose response relationship with the traditional indicators of professional exposure. Giornale Italiano di Medicina del Lavoro ed Ergonomia, v.19, n.1, p.33-35, 1997.
MATHIEU, M.C.; LAPIERRE, I.; BRAULT, K.; RAYMOND, M. Aromatic hydrocarbon receptor (AhR).AhR nuclear translocator- and p53-mediated induction of the murine multidrug resistance mdr1 gene by 3-methylcholanthrene and benzo(a)pyrene in hepatoma cells. Journal of Biological Chemistry, v.276, p.4819-4827, 2001.
MCCOULL, K.D.; RINDGEN, D.; BLAIR, I.A.; PENNING, T.M. Synthesis and characterization of polycyclic aromatic hydrocarbon o-quinone depurinating N7-guanine adducts. Chemical Research in Toxicology, v.12, p.237-246, 1999.
MELENDEZ-COLON, V.J.; LUCH, A.; SEIDEL, A. BAIRD, W.M. Formation of stable DNA adducts and apurinic sites upon metabolic activation of bay and fjord region polycyclic aromatic hydrocarbons in human cell cultures. Chemical Research in Toxicology, v.13, p.10-17, 2000.
MERLO, F.; ANDREASSEN, A.; WESTON, A.; PAN, C.F.; HAUGEN, A.; VALERIO, F.; REGGIARDO, G.; FONTANA, V.; GARTE, S.; PUNTONI, R.; ABBONDANDOLO, A. Urinary excretion of 1-hydroxypyrene asa marker for exposure to urban air levels of polycyclic aromatichydrocarbons. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, v.2, p.147-155, 1998.
74
MICHAELS, M.L.; MILLER, J.H. The GO system protects organisms from the mutagenic effect of the spontaneous lesion 8-hydroxyguanine (7,8-dihydro-8-oxoguanine). J. Bacteriol, v.174, p.6321-6325, 1992.
MICHOR, F.; IWASA, Y.; VOLGELSTEIN, B.; LENGAUER, C.; NOWAK, M.A. Can chromosomal instability initiate tumorigenesis? Seminars in Cancer Biology, v.15, p.43–49, 2005.
MIELYNSKA, D.; BRAZCYNSKA, Z.; SIWINSKA, E.; SMOLIK, E.; BUBAK, A.; SOKAL, J.A. Exposure of coke-oven workers to polycyclic aromatic hydrocarbons based on biological monitoring results. American Industrial Hygiene Association Journal, v.58, p.661-666, 1997.
MIGLIORE, R.; COLOGNATO, R.; NACCARATI, A.; BERGAMASCHI, E. Relantionship between genotoxicity biomarker in somatic and germ cells: findings from a biomonitoring study. Mutagenesis, Mutagenesis Advance Access p.1-4. Published march 27, 2006.
MITRA, S.; HAZRA, T.K.; ROY, R.; IKEDA, S.; BISWAS, T.; LOCK, J.; BOLDOGH, I.; IZUMI, T. Complexities of DNA base excision repair in mammalian cells Mol. Cell, v.7, p.305-312, 1997. .
MORET, S.; CONTE, L.; DEAN, D. Assessment of polycyclic aromatic hydrocarbons content of smoked fish by means of fast HPLC/HPLC method. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.47, p.1367–1371, 1999.
MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for celular growth and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods, v.65, p.55-65, 1983.
NESNOW, S.; ROSS, J.A.; NELSON, G.; WILSON, K.; ROOP, B.C.; JEFFERS, A.J.; GALATI, A.J.; STONER, G.D.; SANGAIAH, R.; GOLD, A.; MASS, M.J. Cyclopenta[cd]pyrene-induced tumorigenicity, Ki-ras codon-12 mutations and DNA-adducts in strain A/J mouse lung. Carcinogenesis, v.15, n.4, p.601-606, 1994.
NETTO, A.D.P.; MOREIRA, J.C.; DIAS, A.E.X.O.; ARBILLA, G.; FERREIRA, L.F.V.; OLIVEIRA, A.S.; BAREK, J. Evaluation of human contamination with polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and their nitrated derivatives (NHPAs): a review of methodology. Química Nova, v.23, p.765-773, 2000.
NILSSON, R.; NORDLINDER, R.; MOEN, B.E.; OVREBO, S,. BLEIE, K.; SKORVE, A.H.; HOLLUND, B.E.; TAGESSON, C. Increased urinary excretion of 8- hydroxydeoxyguanosine inengine room personnel exposed to polycyclic aromatichydrocarbons. Downloaded from oem.bmj.com on 1 June 2007.
75
NOLL, D.M.; GOGOS, A.; GRANEK, J.A.; CLARKE, N.D. The C-terminal domain of the adenine-DNA glycosylase MutY confers specificity for 8-oxoguanine - adenine mispairs and may have evolved from MutT, an 8-oxo-dGTPase. Biochemistry, v.38, p.6374-6379, 1999.
OKONA-MENSAH, K.B.; BATTERSHILL, J.; BOOBIS, A.; FIELDER, R. An approach to investigating the importance of high potency polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in the induction of lung cancer by air pollution. Food and Chemical Toxicology, v.43, p.1103–1116, 2005.
OESCH-BARTLOMOWICZ, B.; OESCH, F. Cytochrome-P450 phosphorulation as a functional switch. Archives of Biochemistry and Biophysics, v.409, p.228-234, 2003.
ORLINSKI, R., ZASTAWNY, T.H., FOKSINSKI, M., BARECKI, A e DIZDAROGLU, M. DNA base modifications and antioxidant enzyme activities in human benign prostatic hyperplasia.Free Rad. Biol. Med., v.18, p.807-813, 1995.
PALMQVIST, A.; RASMUSSEN, L.J.; FORBES, V.E. Influence of biotransformation on trophic transfer of the PAH, fluoranthene. Aquatic Toxicology, v.80, p.309-319, 2006.
PARK, J.H.; GOPISHETTY, S.; SZEWCZUK, M.L.; TROXEL, B.T.; HARVEY, R.G.; PENNING, T.M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH’s o- Quinones: Involvement of reative oxygen species and copper (II)/ copper (I) redox cycling. Chemical Research in Toxicology, v.18, p.1026-1037, 2005.
PERERA, F.P.; TANG, D.; RAUH, V.; LESTER, K.; TSAI.; W.Y.; TU, Y.H.; WEISS, L.; HOEPNER, L.; KING, J.; PRORE, G.D.; LEDERMAN, S.A. Relationships among polycyclic aromatic hydrocarbon–DNA adducts, proximity to the world trade center, and effects on fetal growth. Environmental Health Perspectives, v.113, p.1062-1067, 2005.
PHILLIPS, D.H. Polycyclic aromatic hydrocarbons in the diet. Mutation Research, v.443, p.139–147, 1999.
PLATT, K.L.; DEGENHARDT, C.; GRUPE, S.; FRANK, H.; SEIDEL, A. Microsomal activation of dibenzo[def,mno]chrysene (anthanthrene), a hexacyclic aromatic hydrocarbon without a bay-region, to mutagenic metabolites. Chemical Research in Toxicology, v.15, p.332-342, 2002.
PLATT, K.L.; GRUPE, S. Microssomal biotransformation of benzo[ghi]peylene, a mutagenic polycyclic aromatic hydrocarbon without a “classic” bay region. Chemical Research in Toxicology, v.18, p.700-710, 2005.
76
POIRIER, M.C.; WESTON, A. Human DNA adducts measurements: state the art. Enmviromental Health Perspectives, v.104, p.883-893, 1996.
POIRIER, M.C. Chemical induced DNA damage and human cancer risk. Nature Reviews Cancer, v.4, n.8, p.630-637, 2004.
POPE III, C.A.; BURNETT, R.T.; THUN, M.J.; CALLE, E.E.; KREWSKI, D.; ITO, K.; THURSTON, G.D. Lung cancer, cardiopulmo nary mortality and long-term exposure to fine particulate air pollution. JAMA, the Journal of the American Medical Association, v.287 9, p.1132-1141, 2002.
POPP, W.; VAHRENHOLZ, C.; SCHELL, C.; GRIMMER, G.; DETTBARN, G.; KRAUS, R.; BRAUKSIEPE, A.; SCHMELING, B.; GUTZEIT, T.; VONBULOW, J.; NORPOTH, K. DNA single strand breakage, DNA adducts, and sister chromatid exchange in lymphocytes and phenanthrene and pyrene metabolites in urine of coke oven workers. Occupational and Environmental Medicine, v.54, p.176-183, 1997.
PORELLO, S.L.; LEYES, A.E.; DAVID, S.S. Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates. Biochemistry, v.37, p.14756-14764, 1998.
PUFULETE, M.; BATTERSHIL, A.; BOOBIS, A.; FIELDER, R. Approaches to carcinogenic risk assessment for polycyclic aromatic hydrocarbons : a UK perspective. Regulatory Toxicology and Pharmacology, v.40, p.54-66, 2004.
PURMAL, A.A.; LAMPMAN, G.W.; BOND, J.P.; HATAHET, Z.; WALLACE, S.S. Enzimatic processing of uracil glycol, a major oxidative product of DNA cytosine. J. Biol. Chem, v.273 p.10026-10035, 1998.
REED, M.; MONSKE, M.; LAUER, F.; MESEROLE, S.; BORN, J.; BURCHIEL, S. Benzo[a]pyrene diones are produced by photochemical and enzymatic oxidation and induce concentration-dependent decreases in the proliferative state of human pulmonary epithelial cells. J. Toxicol Environ Health A, v.13 p.1189-1205, 2003.
RÉ-POPPI, N.; SANTIAGO-SILVA, M. Polycyclic aromatic hydrocarbons and other selected organic compounds in ambient air of Campo Grande City, Brazil. Atmospheric Environment, v.39, p.2839-2850, 2005.
ROGGI, C.; MONOIA, C.; SCIARRA, G.F.; APOSTOLI, P.; MACCARINI, L.; MAGNAGHI, S.; CENNI, A.; FONTE, A.; NIDASIO, G.F.; MICOLI, G. Urinary 1-hydroxypyrene as a marker of exposure to pyrene: an epidemiological survey on general population group. Science of the Total Environment, v.199, p.247-254, 1997.
77
RYBICKI, B.A.; NOCK, N.L.; SAVERA, A.T.; TANG, D.; RUNDLE, A. Polycyclic aromatic hydrocarbon-DNA adduct formation in prostate carcinogenesis. Cancer Letters, v.239, 157-167, 2006.
SAMANTA, S.K.; SINGH, O.V.; JAIN, R.K. Polycyclic aromatic hydrocarbons: environmental pollution and bioremediation. Trends in Biotechnology, v.20, p.243-248, 2002.
SANTELLA, R.M.; GAMMON, M.; TERRY, M.B.; SENIE, R.; SHEN, J.; KENNEDY, D.; AGRAWAL, M.; FARAGLIA, B.; ZHANG, F.F. DNA adducts, DNA repair genotype/phenotype and cancer risk. Mutation Research, v.592, p.1-2, 2005.
SATO, H.; AOKI, Y.; Mutagenesis by environmental pollutants and bio-monitoring of environmental mutagens. Current Drug Metabolism, v.3, p.311-319, 2002.
SEVASTYANOVA, O.; BINKOVA, B.; TOPINKA, J.; SRAM, R.J.; KALINA, I., POPOV, T., NOVAKOVA, Z.; FARMER, P.B. In vitro genotoxicity of PAH mixtures and organic extract from urban air particles Part II: human cell lines. Mutation Research, v.620, p.123-134, 2007.
SHAROVSKAYA, J.; KOBLIAKOVA, I.; SOLOMATINA, N.; KOBLIAKOV, V. Effect of some carcinogenic and non-carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons on gap junction intercellular communication in hepatoma cell cultures. European Journal of Cell Biology, v.85, p.387-397, 2006.
SCHERER, G.; FRANK, S.; RIEDEL, K.; MEGER-KOSSIEN, I.; RENNER, T. Biomonitoring of exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons of non occupationally exposed persons. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, v.9, p.373–380, 2000.
SCHOKET, B.; POIRIER, M.C.; MAYER, G.; TOROK, G.; KOLOZSI-RINGELHANN, A.; BOGNAR, G.; BIGBEE, W.L.; VINCZE, I. Biomonitoring of human genotoxicity induced by complex occupational exposures. Mutation Research, v.445, p.193-203, 1999.
SCHOR, S.L.; SCHOR, A.M. Tumour-stroma interactions. Phenotypic and genetic alterations in mammary stroma: implications for tumour progression. Breast Cancer Research, v.3, n.6, p.373-379, 2001. [Review].
SCRIBNER, J.D. Tumor initiation by apparently noncarcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons. J. Natl. Cancer Inst. V.50, p.1717-1719.
SINGER, B.; HANG, B. What structural features determine repair enzyme specificity and mechanism in chemically modified DNA? Chem. Res. Toxicol, v.10, p.713-732, 1997.
78
SINGH, R.; FARMER, P.B. Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry: the future of DNA adduct detection. Carcinogenesis, v.27, p.178-196, 2006.
SINGH, R.; KAUR, B.; KALINA, I.; POPOV, T.A.; GEORGIEVA, T.; GARTE, S.; BINKOVA, B.; SRAM, R.J.; TAIOLI, E,; FARMER, P.B. Effects of environmental air pollution on endogenous oxidative DNA damage in humans. Mutation Research,
v.620, p.71-82, 2007.
SINDLEROVA, S.L.; MACHALA, M.; PENCIKOVA, K.; MARVANOVA, S.; NECA, J.; TOPINKA, J.; SEVASTYANOVA, O.; KOZUBIK, A.; VONDRACEK, J. Dibenzanthracenes and benzochrysenes elicit both genotoxic and nongenotoxic events in rat liver ‘stem-like’ cells. Toxicology, v.232, 147-159, 2007. SOLAHAUG, A.; REFSNES, M.; LAERG, M.; SCHWARZE, P.E.; HUSUY, T.; HOLME, J.A. Polycyclic aromatic hydrocarbons induce both apoptotic and anti-apoptotic signals in Hepa1c1c7 cells. Carcinogenesis, v.25, p.809-819, 2004.
SORENSEN, M.; AUTRUP, H.; HERTEL, O.; WALLIN, H.; KNUDSEN, L.E.; LOFT, S. Personal exposure to PM2.5 and biomarkers of DNA damage. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, v.12, p.191–196, 2003.
SRAM, R.J.; BINKOVA, B. Molecular epidemiology studies on occupational and environmental exposure to mutagens and carcinogens, 1997-1999. Environmental Health Perspectives, v.108, suppl., p.57-70, 2000.
STAAL, Y.C.M.; HERWIJNEN, M.H.M.; VAN SCHOOTEN, F.J.; VAN DELFT, J.H.M. Modulation of gene expression and DNA adduct formation in HepG2 cells by polycyclic aromatic hydrocarbons with different carcinogenic potencies. Carcinogenesis, v.27, p.646-655, 2006.
STANSBURY, K.H.; NOLL, D.M.; GROOPMAN, J.D.; TRUSH, M.A. Enzyme-Mediated dialdehyde formation: An alternative pathway for benzo[a]pyrene 7,8-dihydrodiol bioactivation. Chem. Res. Toxicol., v.13, p.1174-1180, 2000.
STEGEMAN, J.J.; SCHLEZINGER, J.J.; CRADDOCK, J.E.; TILLITT, D.E. Cytochrome P450 1A expression in midwater fishes: potential effects of chemical contaminants in remote oceanic zones. Environmental Science & Technology, v.35, n.1, p.54-62, 2001.
SVILVÁLTOVÁ-SINDLEROVÁ, L.; MACHALA, M.; PENCIKOVÁ, K.; MARVANOVÁ, S.; NECA, J.; TOPINKA, J.; SEVASTYANOVA, O.; KOZYBIC, A.; VONDRÁCEK, J. Dibenzanthracenes and benzochrysenes elicit both genotoxic and nongenotoxic events in rat liver ‘stem-like’ cells. Toxicology, v.232, p.147-159, 2007.
TAI, M.H.; UPHAM, B.L.; OLSON, L.K.; TSAO, M.S.; REED, D.N.; TROSKO, J.E. Cigarette smoke components inhibited intercellular communication and
79
differentiation in human pancreatic ductal epithelial cells. Int. J. CAncer, v.120, p.1855-1862, 2007.
TAJIRI, T.; MAKI, H.; SEKIGUCHI, M. Functional cooperation of MutT, MutM e MutY proteins in preventing mutations caused by spontaneous oxidation of guanine nucleotide in Escherichia coli. Mutat. Res, v.336, p.257-267, 1995.
THOMPSON, M.W.; MCINNES, R.R.; WILLARD, H.F. Thompson & Thompson genética médica. 5.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1993. cap.16, p.250-254.
THURMOND, T.S.; SILVERSTONE, A.E.; BAGGS, R.B.; QUJIMBY, F.W.; STABLES, J.E.; GASIEWICZ, T.A. A chimeric aryl hydrocarbon receptor knockout mouse model indicates that aryl hydrocarbon receptor activation in hematopoietic cells contributes to the hepatic lesions induced by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Toxicology and Applied Pharmacology, v.158, p.33-40, 1999.
TOLEDO, M.C.F.; CAMARGO, M.S.F.O. Benzo[a]pireno em óleos de milho produzidos e comercializados no Brasil. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.18, p.73–76, 1998.
TURESKY, J.R.; VOUROS, P. Formation and analysis of heterocyclic aromatic amine-DNA adducts in vitro and in vivo. Journal of Chromatography, B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, v.802, n.1, p.155-166, 2004.
VINEIS, P.; HUSGAFVEL-PURSIANEN. Air pollution and cancer: biomarker studies in human populations. Carcinogenesis, v.26, p.1846-1855, 2005.
VODICKA, P.; KOSKINEN, M.; ARAND, M.; OESCH, F.; HEMMINKI, K. Spectrum of styrene-induced DNA adducts: the relationship to other viomarkers and prospects in human biomonitoring. Mutation Research, v.3, p.239-254, 2002.
VOUTSA, D.; SAMARA, C. Dietary intake of trace elements and polycyclic aromatic hydrocarbons via vegetables grown in an industrial Greek area. Science of the Total Environment, v.218, p.203–216, 1998.
VRZAL, R.; ULRICHOVA, J.; DVORÁK, Z. Aromatic hydrocarbon receptor status in the metabolism of xenobiotics under normal and pathophysiological conditions. Biomedical Papers, v.148, p.3-10, 2004.
XUE, W.; WARSHAWSKY, D. Metabolic activation of polycyclic and heterocyclic aromatic hydrocarbons and DNA damage: a review. Toxicology and Applied Pharmacology, v.206, p.73-93, 2005.
80
YOON, J.H.; BERASATINA, A.; FENG, Z.; TANG, M.S.; AMIN, S.; LUCH, A.; PFEIFER, G. DNA Damage, repair, and mutation induction by (+)-syn and (-)-anti-dibenzo[a,l]pyrene-11,12-diol-13,14-epoxides in mouse cells. Cacer Research, v.64, 7321-7328, 2004.
WANG, J.J.; MARSHAL, W.D.; FRAZER, D.G.; LAW, B.; LEWIS, D.M. Characterization of DNA adducts from lung tissue of asphalt fume-exposed mice by nanoflow liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry, v.322, p.79–88, 2003.
WATANABE, T.; HASEI, T.; TAKAHASHI, T.; ASANOMA, M.; MURAHASHI, T.; HIRAYAMA, T., WAKABAYASHI, K. Detection of a novel mutagen, 3,6-dinitrobenzo[e]pyrene, as a major contaminant in surface soil in Osaka and Aichi prefectures, Japan. Chem. Res.Toxicol. v.18, p.283-289, 2005.
WEINSTEIN, I.B.; JEFREI, A.M.; JENNETTE, K.W.; BLOBSTEIN, S.H.; HARVEY, R.G.; HARRYS, C. Benzo(a)pyrene diol epoxides as intermediates in nucleic acid binding in vitro and in vivo. Science, v.193, p.592-595, 1976.
WEY, M.Y.; CHEN, J.C.; WU, H.Y.; YU, W.J.; TSA, T.H. Formations and controls of HCl and PAH’s by different additives during waste incineration. Fuel, v.85, p.755-763, 2006.
WISEMAN, H.; HALLIWELL, B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal, v.313, p.17-29, 1996.
WORLD HEALTH ORGANISATION. Polynuclear aromatic hydrocarbons. In: ______. Guidelines for drinking water quality: Health criteria and other supporting information. 2.ed. Geneva: WHO, 1996. v.2, p.495-505.
WOGAN, G.N.; HECHT, S.S.; FELTON, J.S.; CONNEY, A.H.; LOEB, L.A. Environmental and chemical carcinogenesis. Seminars in Cancer Biology, v.14, p.473-486, 2004.
YANG, Y.; GRIFFITHS, W.J.; NORDLING, M.; NYGREN, J.; MOLLER, L.; BERGMAN, J.; LIEPINSH, E.; OTTING, G.; GUSTAFSSON, J.A.; RAFTER, J.; SJOVALL, J. Ring opening of benzo[a]pyrene in the germ-free rat is a novel pathway for formation of potentially genotoxic metabolites. Biochemistry, v.39, p.15585-15591, 2000.
ZHIVOTOVSKY, B.; ORRENIUS, S. Apoptosis and cancer: where we are and where to go. Seminars in Cancer Biology, v.13, p.93-95, 2003.