1. introdução - uspo brasil apresenta um dos mais agudos processos de envelhecimento populacional...
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1. Introdução
Nos últimos anos, o envelhecimento da população tem-se tornado alvo
de intensa preocupação dos órgãos de saúde. Nos países desenvolvidos, este
fenômeno ocorreu lentamente, em uma situação de evolução econômica, de
crescimento do nível de bem-estar e de redução das desigualdades sociais.
Mais recentemente, este processo ganhou maior importância nos países em
desenvolvimento, com o aumento acentuado da população idosa em relação à
população geral (GIATII & BARRETO, 2003; LIMA-COSTA & VERAS, 2003).
No Brasil, a população na faixa etária acima dos 60 anos é a que mais
cresce em termos proporcionais. De acordo com as projeções estatísticas da
Organização Mundial de Saúde (OMS), entre 1950 e 2025, a população de
idosos no país crescerá na ordem de 16 vezes enquanto que, no mesmo
período, o crescimento da população mundial será de não mais que 5 vezes, o
que colocará o Brasil, em termos absolutos, como a sexta população de idosos
do mundo (BRASIL, 1999). Em decorrência de tais mudanças na pirâmide
populacional, a prevalência de doenças crônicas não-transmissíveis, em
destaque a osteoporose, vem aumentando e colocando em risco o bem-estar
das populações idosas.
Segundo a OMS, a osteoporose é definida como “uma doença
caracterizada pela perda de massa óssea e deterioração microestrutural do
tecido ósseo, levando a uma maior fragilidade e a um conseqüente aumento no
risco de fraturas” (WHO, 1998). Em humanos, os sítios de maior incidência de
fratura são a região distal do antebraço (fraturas de Colles), as vértebras
torácicas e lombares e a região proximal do fêmur (colo femoral) (APM, 1995a;
HEGSTED, 2001).
Em 1993, o custo total para o tratamento de fraturas nos Estados Unidos
(EUA) foi de US$ 20 bilhões, sendo mais de um terço deste valor apenas com
as fraturas da região da bacia. Em 1998, pesquisas epidemiológicas indicavam
que cerca de 28 milhões de norte-americanos possuíam algum nível de redução
na densidade mineral óssea (APM, 1995a).
Dentre os fatores de risco (idade, estado hormonal, atividade física,
constituição genética, medicamentos, álcool, fumo) para o desenvolvimento da
osteoporose, a nutrição exerce um papel preponderante. Assim, uma adequada
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ingestão e absorção de cálcio (Ca) asseguram uma mineralização durante
períodos de rápido crescimento e mantêm a massa e a densidade óssea
durante períodos críticos do desenvolvimento (BALLABRIGA, 2000; LOUIE,
1996). Neste contexto, pesquisas têm sido realizadas com o objetivo de
otimizar a biodisponibilidade dos minerais nos alimentos. Desta forma, uma
atenção significativa tem sido dada ao papel de determinados componentes
dos alimentos no metabolismo mineral.
A influência das fibras alimentares (FA) na biodisponibilidade de minerais
tem sido alvo de muitos estudos, nos últimos 20 anos. Em especial, a presença
de fitatos e oxalatos nos alimentos, ou dietas com elevado teor em fibras,
prejudica a absorção dos minerais no intestino delgado, através da formação de
complexos insolúveis entre a fibra, os fitatos e/ou oxalatos, e os minerais.
Entretanto, tal efeito negativo tem sido reavaliado quando se leva em
consideração a passagem deste complexo para as porções distais do intestino.
Através da fermentação bacteriana, frutanos (frutooligossacarídeos e
inulina), galactooligossacarídeos, lactulose e outros oligossacarídeos
resistentes, bem como polióis e amidos resistentes à digestão no intestino
delgado são intensamente metabolizados, proporcionando, desta forma, um
ambiente favorável para a absorção destes minerais (BROMMAGE, 1993;
CUMMINGS & ENGLYST, 1995; YOUNES et al., 1996; LOPEZ et al., 2000).
Sabendo-se que a osteoporose é resultante de uma perda progressiva
da massa óssea, e considerando-se que esta pode ser reduzida com uma maior
absorção de Ca, principalmente durante a infância e a adolescência, verifica-se
a importância em se estimular o consumo de alimentos com teores elevados
destes componentes.
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2. Revisão da literatura 2.1. Osteoporose: epidemiologia e fatores de risco
A partir da segunda metade do século vinte houve uma intensificação do
processo de envelhecimento populacional em praticamente todos os países do
mundo, conseqüência de um crescimento mais elevado da população idosa em
relação aos demais grupos etários (CAMARANO, 2002).
O Brasil apresenta um dos mais agudos processos de envelhecimento
populacional entre os países mais populosos. A proporção de pessoas idosas
com sessenta anos e mais aumentou de 6,1% (7.204.517 habitantes) em 1980,
para 8,6% (14.536.029 habitantes) em 2000, correspondendo a um aumento
absoluto de 7,3 milhões de indivíduos (IBGE, 1994, 2001). As projeções
mostram que esse segmento será responsável por 15% da população brasileira
no ano 2025, colocando o país entre as seis maiores populações do mundo, em
números absolutos (32 milhões), nesta faixa etária (BRASIL, 1999, 2003).
Este envelhecimento populacional tem ocorrido, principalmente, devido a
diminuições importantes dos coeficientes de mortalidade e das taxas de
fecundidade e natalidade. A queda da mortalidade em todas as faixas etárias
levou, inicialmente, ao aumento da expectativa de vida ao nascer e,
posteriormente, da expectativa de vida aos 60 anos [sobrevida]
(CAMARANO, 2002). Essa situação, conhecida como “transição demográfica”,
é acompanhada pela mudança da morbi-mortalidade, com aumento da
incidência e prevalência de doenças crônicas não-transmissíveis, levando ao
aumento do número de pessoas incapacitadas e dependentes de cuidados de
longa duração, um processo denominado “transição epidemiológica” (FRIES,
1980; KALACHE et al., 1987; TUCKER & BURANAPIN, 2001).
Entre estas doenças crônicas não-transmissíveis, pode-se destacar a
osteoporose, que é uma enfermidade crônica, multifatorial, relacionada à perda
progressiva da massa óssea, geralmente de progressão assintomática até a
ocorrência de fraturas. O envelhecimento no ser humano causa um declínio na
formação óssea, aumentando, como conseqüência, o risco de fraturas e de
pequenos traumas. Nos EUA, os recursos utilizados no tratamento de fraturas
por osteoporose representaram, em 1995, um total de 432 mil hospitalizações,
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aproximadamente 2,5 milhões de consultas médicas e 180 mil admissões em
casas de repouso (APM, 1995c; KOWALSKI et al., 2001).
A maior complicação da osteoporose encontra-se nas fraturas vertebrais,
no punho, no úmero e nas costelas. Entretanto, as do fêmur geralmente são de
maior morbidade, sendo que 50% destas evoluem para a incapacidade parcial
ou total. Cerca de 20 a 30% dos indivíduos com fratura de colo de fêmur por
osteoporose apresentam complicações circulatórias, respiratórias e
tromboembólicas, resultando em morte dentro dos dois primeiros anos após a
fratura (APM, 1995c).
A ocorrência da osteoporose está na dependência do pico de massa
óssea e da subseqüente velocidade de perda óssea (APM, 1995a; HEGSTED,
2001). Durante a infância e a adolescência a massa óssea se forma
progressivamente, com acréscimo de Ca durante a fase de consolidação
óssea, depois que a estatura adulta é alcançada. Ao término da consolidação,
quando a quantidade máxima de osso foi acumulada, diz-se que o adulto
atingiu sua massa óssea máxima (ou pico de massa óssea), embora a sua
cronologia possa variar com a idade do indivíduo e com a região do esqueleto
(CASHMAN, 2002; WEAVER & HEANEY, 2003).
Tem sido sugerido que cerca de 80% da variação da massa óssea é
predeterminada por fatores genéticos. Contudo, fatores étnicos, ambientais,
sociais e culturais constituem-se, também, em fatores associados à
possibilidade do desenvolvimento da osteoporose. Outras evidências relativas
de risco são atribuídas ao tabagismo, alcoolismo, cafeína em altas doses,
estresse emocional, doenças metabólicas (como o diabetes mellitus,
hipogonadismo e artrite reumatóide), baixa ingestão de Ca, além de condições
que alterem a sua absorção intestinal, como síndromes de má absorção,
pancreatite crônica e gastrectomias (APM, 1995c; CASHMAN, 2002).
A partir do conceito de que a osteoporose resulta de uma perda
progressiva de massa óssea, tanto em densidade quanto em qualidade, e
reconhecendo-se que esta perda é menor nos indivíduos que durante a infância
e a adolescência conseguiram formar mais massa óssea, é conveniente afirmar
que a prevenção da enfermidade deve ter início já na infância. Assim, durante
esse período, a importância de uma dieta e de programas de exercícios
adequados deve ser levada em consideração (APM, 1995a).
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Existem outras situações patológicas nas quais esta fragilidade encontra-
se aumentada, como ocorre na osteomalácia, no hiperparatireoidismo, na
osteogênese imperfeita, entre outras. Dentre estas, é a osteoporose a de maior
prevalência na população mundial e, portanto, a que tem recebido uma maior
atenção (SARAIVA & LAZARETTI-CASTRO, 2002). 2.2. O osso: estrutura e funções
O osso é um tecido extremamente complexo que, juntamente com a
cartilagem, constitui o sistema esquelético. Embora pareça um tecido rígido e
inerte, o osso é, na realidade, um tecido dinâmico e suprido por nervos e vasos
sangüíneos (GARNER et al., 1996). O tecido ósseo possui um alto grau de
rigidez e resistência à pressão, assim, suas principais funções estão
relacionadas à proteção e à sustentação. Além disso, também funciona como
alavanca e apoio para os músculos, aumentando a coordenação e a força do
movimento proporcionado pela contração do tecido muscular (SAHA, 1990;
HEANEY, 2003).
Cerca de 65% do osso é constituído por uma fase mineral ou inorgânica,
que é representada fundamentalmente pelos cristais de hidroxiapatita
[Ca10(PO4)6(OH)2], formados pelo Ca e pelo fósforo (P), circundados por íons
presentes em menor quantidade, como o bicarbonato, o magnésio, o potássio e
o sódio. Os cristais de hidroxiapatita encontram-se hidratados, existindo,
portanto, uma camada de água e íons em volta do cristal e do líquido intersticial
(APM, 1995b; GARNER et al., 1996). Além disso, os cristais encontram-se
depositados em uma fase orgânica de fibras colágenas, sendo 95% constituídas
pelo colágeno do tipo I (GARNER et al., 1996).
As células ósseas estão continuamente ativas, tanto na criança quanto
no adulto, alterando o tamanho longitudinal (crescimento) e a forma
(modelamento) do osso ou, simplesmente, renovando velhas estruturas sem
modificar a forma (remodelamento) (GARNER et al., 1996). Em geral, as células
ósseas podem ser divididas em dois tipos: os osteoblastos e os osteoclastos,
sendo que, dos primeiros, são derivadas as células de revestimento e os
osteócitos. Todas essas células são responsáveis tanto por manter as
propriedades mecânicas como por mediar a função homeostática do Ca nos
ossos, auxiliando o organismo a manter um nível constante do mineral nos
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fluidos circulantes, e um suprimento de reserva de fósforo, sendo essas funções
influenciadas por agentes hormonais sistêmicos e locais (GARNER et al., 1996;
HEANEY, 2003).
A atividade anabólica do osso (formação) é mediada pelos osteoblastos,
que derivam de células do estroma da medula, e são responsáveis pela síntese
dos constituintes orgânicos do osso (fibras colágenas e mucopolissacarídeos) e,
conseqüentemente, pela calcificação da matriz osteóide. Por sua vez, a
atividade catabólica (reabsorção) é mediada pelos osteoclastos, que são células
gigantes multinucleadas derivadas da linhagem monócito-macrófago e possuem
um grande número de enzimas (GARNER et al., 1996). Os osteócitos são
conhecidos como moduladores da atividade celular, já que são responsáveis
pelo monitoramento da tensão que ocorre nos seus domínios quando o osso é
mecanicamente carregado, e pela transmissão dessa informação às células de
revestimento nas superfícies anatômicas próximas do osso, o que pode então
iniciar a remodelação óssea nesse local (HEANEY, 2003).
No processo fisiológico normal, a reabsorção e a formação ósseas estão
intimamente relacionadas em tempo, grau e espaço, tanto que a formação
óssea só é ativada depois que estiver estabelecida uma área de absorção. O
balanço entre formação e reabsorção mineral é claramente desviado para a
formação óssea em períodos de crescimento ósseo, como durante a infância e
a adolescência. Após esse período, e em condições normais, a intensidade de
formação e reabsorção ósseas é semelhante, de modo que a massa total do
osso permanece constante. Em décadas posteriores da vida, o balanço é
desviado para a reabsorção óssea, principalmente em mulheres após a
menopausa (SAHA, 1990; APM, 1995b; GARNER et al., 1996). Além disso, o
mecanismo de remodelação óssea é relativamente rápido no osso trabecular e
mais lento no osso cortical (SAHA, 1990).
O osso consiste de uma densa camada externa, ou córtex, e de uma
camada interna, que é um sistema interligado de lâminas, bastões e espículas,
dispostas de acordo com as solicitações mecânicas, chamada de osso
trabecular ou esponjoso. Na diáfise dos ossos longos, como o fêmur e a tíbia, o
componente cortical predomina, gerando um tubo oco, enquanto que próximo
às articulações, o córtex se torna mais fino e do lado interno apresenta uma
extensa rede de osso esponjoso (SAHA, 1990; HEANEY, 2003).
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Os segmentos distais dos ossos são chamados de epífises (Figura 1).
As hastes dos ossos longos são chamadas de diáfises e a porção onde as
mesmas se expandem, que emerge da região da placa de crescimento, é
chamada de metáfise. As células de revestimento do lado externo do osso
formam uma película ou membrana resistente chamada periósteo, enquanto
que as células nas superfícies internas, tanto de osso cortical quanto trabecular,
são chamadas de endósteo (HEANEY, 2003).
Figura 1– Regiões de um osso longo em crescimento. Extraído de HEANEY (2003).
Os espaços entre as placas trabeculares e as espículas são preenchidos
por medula óssea. No osso cortical denso, a remodelação ao longo dos anos
produz uma série de estruturas internas chamadas de ósteons ou sistemas de
Havers, nos quais camadas cilíndricas e concêntricas de osso são depositadas
ao longo do percurso de um capilar (HEANEY, 2003).
2.2.1. Propriedades mecânicas dos ossos
As propriedades mecânicas definem o comportamento de um material
quando sujeito a esforços de natureza mecânica e correspondem à sua
capacidade em transmitir e resistir aos esforços aplicados, sem romper ou sem
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que se produzam deformações incontroláveis (CHIAVERINI, 19791, citado por
SHIMANO, 2001).
O comportamento mecânico do osso pode ser estudado através da
realização de ensaios mecânicos em corpos de prova de tecido ósseo, com
dimensões e geometria definidas, de acordo com o ensaio a ser realizado, ou
através do exame do comportamento mecânico como uma unidade anatômica
inteira (osso inteiro), determinando as contribuições das suas propriedades
estruturais (HOLANDA, 1999).
O osso apresenta um limite de deformação elástica e um ponto crítico
que delimita o alcance da deformação de uma variação elástica ou não-elástica.
O osso não é linear, nem inteiramente elástico na porção inicial da curva carga
X deformação (Figura 2), mas deforma-se lentamente. Portanto, o osso está
sujeito a uma deformação não recuperável, mas pode ceder sob tensão e
recuperar-se da deformação dentro do seu limite [porção elástica da curva
tensão X deformação] (HOLANDA, 1999).
Figura 2– Gráfico carga X deformação (deflexão), a partir do qual são obtidas as principais propriedades mecânicas do ensaio de flexão. Adaptado de EINHORN (1996).
1 CHIAVERINI, V. Tecnologia mecânica-Estrutura e propriedades: processos de fabricação. São Paulo, v. 1, McGraw-Hill do Brasil, 1979.
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Uma outra propriedade do osso é conhecida como viscoelasticidade. No
material viscoelástico as propriedades mecânicas diferem de acordo com a taxa
de carregamento. Uma elevação na taxa de carregamento (ou deformação)
aumenta o módulo de elasticidade e a resistência máxima do osso cortical,
enquanto há decréscimo da deformação máxima. Com pequenas taxas de
deformação o osso não exibe deformação elástica apreciável, mas flui como um
líquido viscoso sendo que, com altas taxas de deformação, o mesmo osso pode
comportar-se como um sólido frágil e elástico (EINHORN, 1996).
A determinação das propriedades mecânicas de um material é realizada
por meio de vários ensaios, que podem ser destrutivos, quando promovem a
ruptura ou inutilização do material, ou não-destrutivos, em caso contrário
(SEDLIN & HIRSCH, 1966).
A tração é produzida no material quando duas forças são aplicadas em
sentidos opostos na mesma linha de aplicação, alongando o material. A
resistência à tração provém das forças moleculares atrativas, que tendem a
dificultar a separação do material. A compressão é o resultado de duas forças
atuando na mesma linha, uma em direção a outra, achatando o material. A
resistência à compressão provém das forças moleculares repulsivas, que
mantém as mínimas distâncias interatômicas (EINHORN, 1996). Se forças
atuam sobre um material de modo que tendem a induzir tensões de compressão
(em um lado da secção transversal) e tensões de tração (na parte restante), diz-
se que o material está sob flexão (EINHORN, 1996; SHIMANO, 2001).
Com o registro das forças e deformações ocorridas durante o ensaio
mecânico pode-se construir a curva carga X deformação (Figura 2). A porção
linear da curva carga X deformação é conhecida como região elástica. No ponto
onde a curva torna-se não-linear, a região elástica cede lugar à região plástica e
a tensão neste ponto é conhecida como limite elástico. O ponto na curva onde
isto ocorre é conhecido como ponto de escoamento, sendo que o carregamento
adicional além do ponto de escoamento causa deformação permanente no
material. Esta propriedade é conhecida como plasticidade e indica a resistência
de um material à deformação permanente. Na região elástica, o material
deforma somente enquanto a carga é aplicada, retornando ao seu tamanho e
dimensões originais quando a carga é removida. Abaixo do limite elástico, a
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força aplicada ao material alonga, mas não rearranja suas ligações atômicas
(EINHORN, 1996).
A resistência de um osso ou corpo de prova de tecido ósseo é avaliada
através da carga máxima (limite máximo) aplicada no material até a ruptura. A
integração da curva fornece a área, e esta é a medida da energia de
deformação. A energia total de deformação absorvida pelo material até o ponto
de ruptura é chamada de tenacidade. A energia transferida para o material até o
ponto de escoamento pode ser recuperada após a remoção da carga. A energia
recuperada é conhecida como resiliência e é a medida da habilidade de
armazenar energia. Embora esta energia não seja recuperável na forma útil,
não será perdida, contanto que o material não atinja a deformação permanente
(EINHORN, 1996; HOLANDA, 1999).
2.3. Cálcio e magnésio: considerações gerais
O Ca é o quinto elemento mais abundante na biosfera, o principal
mineral do esqueleto e um dos cátions mais abundantes no corpo humano,
representando de 2 a 4% do peso corporal bruto, ou seja, cerca de 1.000 a
1.500 g no indivíduo adulto. Aproximadamente 99% desse total encontram-se
no esqueleto; o restante (1%) encontra-se nos dentes, tecidos moles e no fluido
extracelular. Cerca de 1% do Ca ósseo é livremente intercambiável com o Ca
do fluido extracelular (LOBAUGH, 1996; Dos REIS & JORGETTI, 2000;
CASHMAN, 2002; WEAVER & HEANEY, 2003).
Como um elemento funcional do fluido extracelular e do citosol, o Ca
possui um papel decisivo em uma variedade de processos bioquímicos e
fisiológicos, incluindo a liberação de neurotransmissores durante a transmissão
dos impulsos nervosos, formação do tecido de sustentação dos animais (tecido
ósseo) juntamente com o fósforo e, com proteínas e fosfolipídeos, desempenha
um papel essencial na manutenção da integridade das membranas celulares,
além de atuar no processo de coagulação sangüínea, de contração e
relaxamento muscular e na ativação de várias enzimas (entre as quais, a
amilase e a lipase) (LOBAUGH, 1996; LOUIE, 1996; JONES et al., 1998).
Em relação ao magnésio (Mg), sua real importância foi estabelecida, em
estudos realizados no início da década de 1930, a partir de observações
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sistemáticas de sinais de deficiência em animais de experimentação (SHILS,
1988; SCHWARTZ, 1990). Mais recentemente, evidências cada vez maiores
têm indicado que a deficiência de Mg está associada com a etiologia de
diversas doenças metabólicas (SHILS, 1988; RUDE, 1998; RUDE et al., 2003;
TAM et al., 2003).
O Mg é o mais abundante cátion mineral divalente nas células, formando
complexos com uma variedade de moléculas orgânicas que apresentam
atividades biológicas, e suas concentrações extracelulares e intracelulares
relativamente altas, em comparação com outros eletrólitos, tendem a favorecer
sua ligação a essas moléculas (SHILS, 1988; SARIS, 2000; SHILS, 2003). O Mg
atua na regulação da atividade de mais de 300 reações enzimáticas, em geral,
de duas maneiras: ligando-se ao substrato, formando um complexo com o qual
a enzima interage, como na reação de cinases com o MgATP; ou ligando-se
diretamente à enzima, alterando sua estrutura ou servindo a um papel catalítico
(como exemplos, exonuclease, topoisomerase, e RNA e DNA isomerases).
Além disso, intervém, igualmente, na duplicação dos ácidos nucléicos, na
excitabilidade neural e na transmissão do influxo nervoso, agindo sobre as
trocas iônicas da membrana celular (RUDE, 1998; SARIS, 2000; SHILS, 2003).
Sua concentração corporal, em um indivíduo adulto e sadio, está entre
20 a 28 g, sendo que mais da metade do total encontra-se no osso e o restante
presente em tecidos moles (SARIS, 2000; SHILS, 2003). Embora o osso seja o
maior reservatório de Mg, grande parte encontra-se dentro da cápsula de
hidratação ou na superfície dos cristais de hidroxiapatita (SCHWARTZ, 1990;
SOJKA, 1995; GARNER et al., 1996). Assim, como o Mg neste compartimento
encontra-se prontamente intercambiável e, como as suas concentrações no
osso encontram-se reduzidas em situações de deficiência (RUDE, 1998;
CREEDON et al., 1999), tem sido sugerido que o osso serve como reservatório
para a manutenção do Mg extracelular. No plasma, 55% do Mg encontram-se
na forma ionizada ou livre, sendo 15% ligados a ânions e cerca de 30% ligados
a proteínas plasmáticas, em especial, a albumina (RUDE, 1998; SARIS, 2000).
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2.3.1. Aspectos metabólicos e nutricionais do cálcio
Os indicadores que refletem o estado nutricional referente ao Ca estão
intimamente relacionados à sua concentração no esqueleto. O Ca é um dos
principais constituintes da matriz óssea mineralizada formando, juntamente com
o P, os cristais de hidroxiapatita sendo, deste modo, fundamental para a
manutenção de um tecido ósseo saudável e resistente. Através da remodelação
óssea, estes íons sofrem um processo de solubilização durante a reabsorção,
sendo transferidos para a circulação e retornando ao estado sólido através da
mineralização do tecido osteóide recém-formado. A taxa de deposição do Ca no
esqueleto é mais alta em recém-nascidos, diminuindo a um nível muito mais
baixo à medida que o crescimento tende a cessar (APM, 1995b; GARNER et al.,
1996; BRONNER & PANSU, 1999).
O nível sérico normal de Ca, em humanos adultos, varia de 8,7 a 10,2 mg/dL
e permanece rigorosamente controlado, oscilando não mais que 5% durante as
24 h do dia (LOUIE, 1996). Sua manutenção é regulada por um sistema de
fatores controladores e mecanismos de feedback (retroalimentação),
envolvendo a interação de hormônios calciotrópicos (paratormônio [PTH],
vitamina D [1,25(OH)2D3] e calcitonina) com órgãos como o intestino, os rins e o
osso (Figura 3). O PTH e a 1,25(OH)2D3 são secretados quando a
concentração plasmática de Ca encontra-se diminuída (LOBAUGH, 1996;
WEAVER & HEANEY, 2003). A secreção do PTH parece ser regulada por um
receptor sensível ao Ca, que também está envolvido no controle da absorção
de Ca ao longo do trato gastrintestinal (CHATTOPADHYAY et al., 1998).
Quando tal concentração eleva-se em resposta à absorção aumentada
de Ca, à reabsorção tubular aumentada e à reabsorção óssea, o limiar de
excreção renal altera-se e Ca extra é excretado na urina. Outro mecanismo que
é ativado quando a concentração plasmática de Ca encontra-se aumentada é a
liberação, pela tireóide, da calcitonina, que retarda a reabsorção osteoclástica,
diminuindo a liberação óssea de Ca (LOBAUGH, 1996; CASHMAN, 2002;
WEAVER & HEANEY, 2003).
Em condições de pH e temperatura normais, aproximadamente 50% do
Ca sérico encontram-se na forma ionizada, que é a fração fisiologicamente ativa
e importante no transporte e transmissão de sinais celulares. Outros 40% estão
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ligados às proteínas plasmáticas, sendo 36% ligados à albumina. Dessa forma,
alterações na concentração de albumina influenciam a concentração do Ca
sérico. Os 10% restantes formam complexos com outros componentes, como o
citrato e o P. Tanto a fração iônica quanto a complexada são ultrafiltradas pelo
rim, enquanto a ligada às proteínas é retida nos glomérulos (LOBAUGH, 1996;
LOUIE, 1996; JONES et al., 1998; Dos REIS & JORGETTI, 2000).
Em um adulto normal, existe um intercâmbio lento, mas contínuo, de Ca
entre o seu principal reservatório, o esqueleto, e o meio extracelular. Além
disso, há um balanço constante entre a absorção intestinal e a sua excreção
pelos rins (Figura 3). Se existe uma insuficiente ingestão de Ca, esse mineral é
removido do osso para que os níveis séricos permaneçam controlados.
Considerando que existem perdas diárias fixas pelas fezes e urina,
independentemente da quantidade ingerida, em dietas pobres o balanço de Ca
permanece negativo (APM, 1995b; LOUIE, 1996; Dos REIS & JORGETTI,
2000).
Dois mecanismos estão envolvidos na absorção intestinal do Ca: um
paracelular, passivo e não saturável, que é o principal responsável pela
absorção quando a quantidade de Ca ingerida é adequada ou elevada, sendo
diretamente influenciado pela quantidade de Ca presente no quimo; e um
transcelular, ativo e saturável, que envolve a participação de canais e proteínas
transportadoras de Ca encontrados no epitélio intestinal (BRONNER et al.,
1986; LOUIE, 1996; BRONNER, 1998; Dos REIS & JORGETTI, 2000; WEAVER
& HEANEY, 2003).
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Filtração
Figura 3– Representação esquemática dos compartimentos e a regulação da homeostasia do cálcio no organismo.
O movimento transcelular de Ca envolve três etapas: a entrada através
do pólo apical da membrana celular, a difusão através do citoplasma e a saída
através da membrana basolateral. A entrada na célula ocorre sob um gradiente
eletroquímico através de canais de Ca, que não são dependentes de voltagem.
O principal regulador fisiológico da absorção intestinal de Ca é a 1,25(OH)2D3,
que pode aumentar o transporte ativo em até 30%. A 1,25(OH)2D3, que é
responsiva às concentrações séricas de Ca, regula a síntese da calbindina (9
kDa) por transcrição de DNA, no momento em que a vitamina se liga a
receptores nucleares. A calbindina atua ligando-se ao Ca2+ na superfície da
célula, internalizando-o através de vesículas endocitóticas que, provavelmente,
fundem-se aos lisossomos, aumentando a taxa de difusão intracelular do íon.
Depois da liberação do Ca ligado no interior do lisossomo ácido, a calbindina
Absorção intestinal
Excreção fecal
CÁLCIO EXTRACELULAR
Absorção
PTH
Reabsorção
Formação
1,25 (OH)2D3 Vit D
Ingestão
Excreção urinária
15
retorna à superfície da célula, e os íons Ca2+ saem da célula pela membrana
basolateral. A saída do Ca da célula é uma etapa que é mediada pela
CaATPase, ocorre contra um gradiente eletroquímico e também parece ser
modulada pela 1,25(OH)2D3 (BRONNER et al., 1986; LOUIE, 1996; BRONNER,
1998; JONES et al., 1998; BRONNER & PANSU, 1999; WEAVER & HEANEY,
2003). O segundo movimento intestinal de Ca responde pela rota paracelular de
absorção do mineral. O fluxo de Ca pode ocorrer da mucosa em direção à
serosa ou vice-versa, e predomina nas regiões do jejuno e do íleo. Este
processo é independente da presença da 1,25(OH)2D3 e da calbindina, sendo
determinado pela solubilidade do mineral, pela permeabilidade das junções
oclusivas (tight junctions) e pelo tempo de residência do mineral em
determinada região do intestino (BRONNER et al., 1986; LOUIE, 1996;
BRONNER, 1998; BRONNER & PANSU, 1999).
Em humanos, a quantidade de Ca absorvido depende de uma variedade
de fatores, incluindo o comprimento do segmento intestinal, tempo de residência
do quimo em um determinado segmento do intestino, a sua concentração no
lúmen intestinal e a biodisponibilidade do mineral no alimento (LOUIE, 1996;
BRONNER & PANSU, 1999). A eficiência absortiva, geralmente, varia
inversamente com a ingestão, mas a quantidade absoluta absorvida aumenta
com a ingestão. Além disso, quando as demandas do mineral encontram-se
aumentadas, como durante a gravidez, a lactação e o crescimento do
esqueleto, a eficiência do transporte de Ca encontra-se aumentada (BRONNER
& PANSU, 1999; WEAVER & HEANEY, 2003).
O jejuno absorve uma maior quantidade de Ca do que o duodeno devido,
principalmente, ao seu maior comprimento. O duodeno, entretanto, possui uma
melhor capacidade absortiva (transporte ativo) por unidade de comprimento.
Quanto maior o tempo no qual o quimo reside em uma determinada região do
intestino, maior a chance do movimento de íons através da camada estacionária
de água para a mucosa intestinal, e a conseqüente absorção. O íleo possui uma
menor capacidade de absorção por unidade de comprimento do que o jejuno.
Entretanto, devido ao comprimento ligeiramente maior do íleo e a sua
habilidade para absorver mais Ca através do movimento paracelular, o íleo
absorve uma maior quantidade do que os outros segmentos intestinais (LOUIE,
16
1996). Cerca de 11% do Ca absorvido pelo movimento paracelular, ao longo de
todo o intestino, é absorvido no intestino grosso. Quando a ingestão de Ca é
elevada, os transportadores de Ca nas regiões superiores do trato
gastrintestinal ficam saturados, permitindo, desse modo, que uma maior
quantidade de Ca seja absorvida pela rota paracelular, e que uma maior
quantidade do mineral se encontre disponível para absorção no intestino grosso
(BRONNER et al., 1986; DUFLOS et al., 1995; BRONNER, 1998). Além disso,
estudos realizados in vivo, têm evidenciado a presença de um sistema ativo,
dependente da vitamina D, no intestino grosso (AMMANN et al., 1986;
BRONNER & PANSU, 1999). De acordo com AMMANN et al. (1986), a injeção
de Ca radioativo (45CaCl2) diretamente no ceco de ratos resultou em um
aumento de 36% na absorção ativa do mineral. Entretanto, tal sistema mostrou-
se ineficaz quando o mineral foi oferecido através da dieta. De acordo com os
autores, houve uma provável transformação do Ca, ao longo do trato
gastrintestinal, para uma forma menos absorvível.
Neste contexto, estudos adicionais com animais e humanos têm
sugerido que o intestino grosso poderia ser o principal local de absorção de Ca,
à medida que a fermentação ocorresse (DEMIGNÉ et al., 1995; YOUNES et al.,
1996; OHTA et al., 1998; VAN DEN HEUVEL et al., 1999). No cólon, a
fermentação ocorre através da ação de enzimas específicas produzidas pela
microbiota intestinal sobre determinados substratos, dos quais os carboidratos
são os mais importantes (CUMMINGS & ENGLYST, 1995). Além disso, a
fermentação pode ser mantida, em uma certa extensão, por substratos
endógenos, tais como mucinas e células esfoliadas, o que poderia explicar, de
alguma forma, a absorção do Ca no intestino grosso em animais alimentados
com uma dieta isenta de fibra alimentar (FA) (SHIGA et al., 1998).
Durante a digestão, o Ca é desembaraçado de complexos na dieta e
liberado em uma forma solúvel e provavelmente ionizada para a absorção. Para
que isso ocorra é necessário a atuação de enzimas digestivas e um pH
relativamente ácido. Entretanto, complexos de baixo peso molecular, como o
oxalato de cálcio e o carbonato de cálcio, podem ser absorvidos intactos (APM,
1995b; LOUIE, 1996; WEAVER & HEANEY, 2003).
Existe uma seqüência de fatores que podem interferir na
biodisponibilidade do Ca, incluindo a forma química do mineral, a ligação
17
molecular, a quantidade ingerida e o estado nutricional do indivíduo. Além
desses, diversos componentes presentes na matriz do alimento podem
influenciar consideravelmente a utilização do Ca pelo organismo (LOUIE, 1996;
COZZOLINO, 1997; BROUNS & VERMEER, 2000). Desta forma, o
conhecimento das interações entre os fatores que afetam a biodisponibilidade e
os mecanismos envolvidos na absorção do Ca, pode permitir o desenvolvimento
de estratégias que visem um melhor aproveitamento do mineral pelo organismo
e a conseqüente diminuição do risco de doenças. 2.3.2. Aspectos metabólicos e nutricionais do magnésio
A homeostasia do indivíduo em relação a um mineral depende das
quantidades ingeridas, da eficiência da absorção e excreção intestinal e renal, e
da presença de componentes inibidores ou promotores na dieta (SHILS, 2003).
Em animais e humanos, o Mg absorvido pode variar entre 35 e 70% do Mg
ingerido (BRINK & BEYNEN, 1992; COUDRAY et al., 2003).
Os dados disponíveis na literatura, relacionados ao local e ao
mecanismo envolvido no transporte intestinal do Mg são, em geral,
controversos. A maioria dos estudos indica que a absorção do Mg ocorre
predominantemente no íleo, sendo que tal conclusão foi obtida
independentemente da metodologia experimental utilizada, bem como do tipo
de dieta, da idade ou do estado nutricional relativo ao magnésio estudado
(BRINK & BEYNEN, 1992; KAYNE & LEE, 1993; RUDE, 1998; COUDRAY et
al., 2003). Outros estudos têm evidenciado que a absorção intestinal do Mg em
função da sua ingestão obedece a um padrão curvilíneo, refletindo um processo
transcelular e saturável (COUDRAY et al., 2003; SHILS, 2003). Entretanto, tem
sido demonstrada, em ratos, a existência de uma correlação direta entre a
absorção de Mg e a sua concentração na dieta e no lúmen intestinal
(COUDRAY et al., 2002).
Em níveis usuais de ingestão, a absorção intestinal do Mg ocorre
principalmente por mecanismos de difusão e de arraste pelo solvente. Desta
forma, a solubilidade do Mg no lúmen intestinal é o principal fator no controle da
sua absorção (BRINK & BEYNEN, 1992; COUDRAY et al., 2003). Neste
contexto, tem sido verificada, em animais e humanos, uma contribuição
significativa de carboidratos fermentáveis para a absorção de Mg quando estes
18
são metabolizados pelas bactérias presentes no intestino grosso (OHTA et al.,
1994b; BABA et al., 1996; TAHIRI et al., 2001; COUDRAY et al., 2003). Com a
fermentação, é produzido um ambiente favorável para o aumento da
concentração de Mg na forma solúvel e, conseqüentemente, disponível para a
absorção. Além disso, outros componentes presentes na dieta, tais como fitatos,
oxalatos e fósforo, podem influenciar negativamente na absorção do Mg (RUDE,
1998).
O Mg absorvido é retido e utilizado ou para o crescimento tecidual
(incluindo os ossos) ou para demandas específicas dos demais sistemas no
organismo (SHILS, 1988; SHILS, 2003), sendo o restante excretado na urina.
Cerca de 10% (aproximadamente 2.400 mg) do Mg corporal total são filtrados
diariamente através dos glomérulos, em um indivíduo adulto e saudável. Desta
quantidade, cerca de 5% são excretados na urina. Aproximadamente 75% do
Mg sérico são ultrafiltráveis nos glomérulos, com 20 a 30% sendo reabsorvidos
no túbulo proximal (SHILS, 2003). O ramo ascendente espesso da alça de
Henle parece ser o principal sítio de controle da excreção do Mg, principalmente
na sua porção cortical. Cerca de 50 a 55% do Mg filtrado são reabsorvidos entre
o ramo descendente e o túbulo distal (SHILS, 1988; RUDE, 1998).
2.4. Frutanos e o conceito de fibra alimentar
A partir da década de 1950, estudos epidemiológicos passaram a
demonstrar a existência de uma forte correlação entre o aumento da incidência
de doenças crônicas não-transmissíveis com o consumo de alimentos
processados e refinados, o que levou a se estabelecer uma relação causal
entre o surgimento dessas doenças e a quantidade de FA presente na dieta
(BURKITT, 1973). Desde então, as pesquisas têm revelado inúmeros benefícios
das fibras na redução do risco de doenças e na manutenção da saúde,
enfatizando a importância do consumo de alimentos que contenham um teor
elevado destes componentes.
Neste contexto, tem-se verificado um crescente interesse por parte de
nutricionistas e órgãos oficiais de saúde em estabelecer recomendações para o
consumo de FAs. De acordo com MENEZES et al. (2001), a ingestão média de
FA pela população brasileira era, na década de 1970, de 19,3 g/dia, caindo
19
para 16,0 g/dia na década de 1980, e chegando a 12,4 g/dia na década de
1990. As recomendações nutricionais propostas para a população brasileira
sugerem que a dieta de uma família deva conter mais do que 8 g/1000 kcal de
FA ou, no mínimo, 20 g/dia para jovens e adultos (VANNUCCHI et al., 1990).
A FA foi originalmente definida como “polissacarídeos e lignina
encontrados na parede celular dos vegetais que não sofrem hidrólise pelas
enzimas do trato gastrintestinal em humanos e animais” (TROWELL, 1972;
TROWELL et al., 1976). Entretanto, essa definição torna-se inadequada a partir
do momento em que não inclui outros componentes que não fazem parte da
parede celular e que também não sofrem a ação das enzimas digestivas no
intestino delgado, tais como os frutanos (FOS e inulina), oligossacarídeos e
amido resistentes, entre outros. Assim, vários trabalhos foram publicados com o
objetivo de estabelecer uma classificação para os diferentes tipos de
carboidratos, levando-se em consideração critérios químicos e fisiológicos
(ASP, 1995; ASP, 1996; CUMMINGS et al., 1997).
Recentemente, a Associação Americana de Químicos de Cereais
(American Association of Cereal Chemists) definiu a fibra dos alimentos como:
“a parte comestível de vegetais ou carboidratos análogos que resistem à
digestão e absorção no intestino delgado do homem, sendo fermentada
completa ou parcialmente no intestino grosso. Incluem polissacarídeos,
oligossacarídeos, lignina e substâncias associadas aos vegetais, promovendo
efeitos fisiológicos benéficos incluindo laxação, e/ou atenuação do colesterol
sangüíneo e/ou atenuação da glicose sangüínea” (AACC, 2001). Deste modo, a
diversidade dos efeitos fisiológicos da FA deve basear-se na caracterização
química dos seus constituintes. A combinação das características químicas e
fisiológicas permitirá uma melhor visão sobre o papel das fibras na nutrição e na
saúde. Neste sentido, justifica-se o crescente interesse, por parte da
comunidade científica e da população em geral, em componentes específicos
(bioativos) dos alimentos que apresentem um papel na manutenção da saúde.
O termo “alimentos funcionais” refere-se a estes alimentos, os quais podem
proporcionar benefícios nutricionais e metabólicos específicos, contribundo para
o controle e redução do risco de doenças.
20
2.5. Frutanos e a sua importância na alimentação
Os frutanos são carboidratos de reserva constituídos de uma ou mais
(até 70) unidades de frutose, ligadas (GFn) ou não (Fn) a uma molécula terminal
de sacarose (DELZENNE & ROBERFROID, 1994; CUMMINGS et al., 1997;
ROBERFROID & DELZENNE, 1998). Podem apresentar uma estrutura linear ou
ramificada, com moléculas unidas por ligações frutosil-frutose do tipo β(2→6),
vistas em frutanos do tipo levano, ou ligações β(2→1), encontradas em frutanos
do tipo inulina (ROBERFROID & DELZENNE, 1998; CARABIN & FLAMM, 1999).
Por sua vez, os frutanos do tipo inulina se dividem em dois grupos de
componentes: a inulina e seus produtos de hidrólise (oligofrutose), e os FOS,
que são sintetizados a partir da sacarose. Em geral, estes carboidratos têm sido
diferenciados pelo seu grau de polimerização (GP). O GP da inulina pode variar
de 2 a 70 unidades monossacarídicas, com um valor médio de 10. A
oligofrutose e os FOS são termos sinônimos utilizados para descrever frutanos
com um GP menor do que 10 (CARABIN & FLAMM, 1999; ROBERFROID &
SLAVIN, 2001).
A fórmula estrutural dos frutanos do tipo inulina está representada na
Figura 4. De acordo com a União Internacional de Química Pura e Aplicada
(International Union of Pure and Applied Chemistry), um oligossacarídeo é
constituído por 2 até 10 unidades monossacarídicas (VAN LOO et al., 1999;
ROBERFROID & SLAVIN, 2001). No entanto, determinados carboidratos,
independentemente do seu GP, apresentam efeitos fisiológicos semelhantes.
Assim, um critério utilizado para distinguí-los quimicamente é a sua solubilidade
em etanol a 80% e a resistência, in vitro, às enzimas intestinais (CUMMINGS et
al., 2001).
Atualmente, os oligossacarídeos ou polissacarídeos que contêm frutose
(frutanos), como os FOS e a inulina, vêm sendo estudados e comercializados
(principalmente em mercados como Japão, EUA e Europa) como produtos para
a indústria de alimentos com teor calórico reduzido (NRC, 1989; OHYAMA et al.,
1990; ZARDINI, 1991; LOBO & LEMOS SILVA, 2003a). Estima-se que o consumo
diário de inulina e FOS nos EUA esteja em torno de 1 a 4 g, chegando a 11
g/dia na Europa (VAN LOO et al., 1995).
21
Figura 4– Representação da estrutura química geral dos frutanos. Extraído de OHTA et al. (1996).
Apesar do interesse crescente na produção e na utilização de alimentos
com teores elevados de frutanos, a determinação da ocorrência desses
açúcares em vegetais utilizados na alimentação ainda é escassa, e não se
compara à de vegetais que contêm amido (De CARVALHO & FIGUEIREDO-
RIBEIRO, 2001).
Cerca de 36 mil espécies vegetais apresentam frutanos como
carboidratos de reserva. Dentro da classe das dicotiledôneas, os frutanos são
encontrados em quase todas as espécies da família Asteraceae, muitas das
quais apresentando importância econômica, como o almeirão (Cichorium
intybus) e o tupinambo (Helianthus tuberosus) (FIGUEIREDO-RIBEIRO, 1993;
CARABIN & FLAMM, 1999; De CARVALHO & FIGUEIREDO-RIBEIRO, 2001).
O yacón (Polymnia sonchifolia Poepp. & Endl.) é uma espécie da família
Asteraceae ou Compositae, originária da região dos Andes, estendendo-se da
Colômbia até o noroeste da Argentina. Suas raízes tuberosas são consumidas
cruas, cozidas ou fritas, apresentando sabor semelhante ao da pêra (Figura 5).
No Brasil, a espécie foi introduzida por volta de 1991 no Estado de São Paulo,
na região de Capão Bonito, pela colônia japonesa, que utilizava as raízes in
natura ou desidratadas no tratamento contra hipercolesterolemia e diabetes
(KAKIHARA et al., 1996).
22
Figura 5– Raízes tuberosas do yacón (Polymnia sonchifolia Poepp. & Endl.).
Suas raízes tuberosas destacam-se pelo elevado teor de umidade (cerca
de 90%) (CAPITO, 2001; YOSINO, 2001). Em base seca, apresentam entre 3 e
7% de cinzas, 3 e 7% de proteínas e 0,4 e 1,3% de lipídeos (NRC, 1989).
NIETO (1991), estudando a composição de raízes tuberosas de 10 linhagens de
yacón, encontrou valores médios de 3,7% de proteínas, 3,5% de cinzas, 1,5%
de lipídeos e 3,4% de fibras. Com relação à composição em minerais, em base
seca, o potássio encontra-se presente em maior quantidade (1,34%), seguido
23
pelo Ca (0,14%), magnésio (0,12%), fósforo (0,08%) e sódio (0,06%). Dentre os
microminerais, o ferro e o zinco se destacam com 87 e 36 µg/g,
respectivamente (INIAP, 1995-1996, citado por CAPITO, 2001). YOSINO (2001)
verificou, em raízes submetidas a autoclavagem, consideráveis teores de
potássio (195,29 mg/100 g), seguidos pelo sódio (27,51 mg/100 g) e pelo Ca
(10,73 mg/100 g).
Estudos recentes têm evidenciado um potencial antioxidante, tanto nas
raízes quanto no extrato obtido de suas folhas, demonstrado pela presença de
compostos fenólicos como os ácidos caféico (e derivados) e clorogênico, bem
como do triptofano (YAN et al., 1999; TAKENARA et al., 2003; VALENTOVA et
al., 2003). Além disso, atualmente, o yacón vem sendo considerado como
matéria-prima promissora para a produção de frutose e frutosil-sacarose, devido
ao seu elevado teor de frutose livre e de FOS (CAPITO & FILISETTI, 1999). De
acordo com o NATIONAL RESEARCH COUNCIL (1989), os tubérculos e raízes
tuberosas de yacón apresentam de 60 a 80% de FOS, em base seca. OHYAMA
et al. (1990) encontraram uma alta concentração de FOS, com 6% de 1-cestose
(GF2), 4,7% de nistose (GF3) e 3,36% de 1,1,1-cestopentaose (GF4). FUKAI et
al. (1993) reportaram uma concentração de 11% de GF2, 8% de GF3 e 4,0% de
GF4. CAPITO (2001), avaliando os teores de carboidratos em 10 raízes
tuberosas provenientes de uma única planta, colhida após 11 meses de plantio,
encontrou valores de 1,58 a 2,44% de frutose, de 0,55 a 1,15% de glicose, de
0,31 a 1,24% de sacarose e de 0,85 a 4,11% de frutanos com GP médio de
4,59, no vegetal in natura, evidenciando uma grande variação no teor dos
carboidratos entre as amostras analisadas.
2.6. Efeitos fisiológicos dos frutanos
A maior parte dos oligo – e polissacarídeos presentes na dieta são
quantitativamente hidrolisados nas regiões superiores do trato gastrintestinal.
Os monossacarídeos resultantes são absorvidos e transportados através da
circulação portal para o fígado e, subseqüentemente, para a circulação
sistêmica. Estes carboidratos servem como substratos e reguladores das
principais vias metabólicas, e atuam influenciando a liberação de diversos
hormônios gastrintestinais. Entretanto, determinadas propriedades físico-
químicas e a configuração das ligações entre os seus monossacarídeos podem
24
influenciar na digestibilidade destes carboidratos (DELZENNE &
ROBERFROID, 1994; CUMMINGS & ENGLYST, 1995; CUMMINGS &
MacFARLANE, 2002; LOBO & LEMOS SILVA, 2003b).
Como conseqüência, podem alcançar a região do intestino grosso onde
são, em uma maior ou menor extensão, hidrolisados e metabolizados pela
microbiota local. Nesse processo metabólico, conhecido como fermentação,
são produzidos gases (H2, CO2, CH4), ácidos orgânicos (como fumarato, lactato
e succinato), e ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), como acetato,
propionato e butirato, que produzem variados efeitos para a saúde do
hospedeiro. Estes últimos são rapidamente absorvidos (de 90 a 95%) e, com
exceção do butirato, alcançam a circulação portal, sendo metabolizados no
fígado. Entretanto, uma parte do acetato (de 25 a 50%) pode escapar desta
rota metabólica e, via circulação sistêmica, alcançar os tecidos periféricos,
principalmente o muscular (DELZENNE & ROBERFROID, 1994;
ENGELHARDT, 1995; RÉMÉSY et al., 1995; CUMMINGS et al., 2001;
CHERBUT, 2002). O butirato, por sua vez, tem sido reconhecido como a
principal fonte de energia para a mucosa colônica, atuando na proliferação e na
regulação da diferenciação e da apoptose dos colonócitos (LIVESEY & ELIA,
1995; SAKATA, 1995; SMITH et al., 1998; CAVAGLIERI et al., 2002;
JOHNSON, 2002; PRYDE et al., 2002).
Neste contexto, um especial enfoque tem sido dado para os frutanos
(inulina e FOS), devido a sua capacidade de estimular seletivamente o
crescimento de determinadas espécies bacterianas, consideradas benéficas
para o hospedeiro. O conceito de prebiótico foi introduzido por GIBSON &
ROBERFROID (1995), e definido como “um componente presente nos
alimentos resistente à digestão pelas enzimas endógenas do trato
gastrintestinal, que afeta beneficamente o hospedeiro através da estimulação
seletiva do crescimento e/ou da atividade de uma ou de um limitado número de
bactérias no cólon proporcionando, desta forma, um estado de saúde para o
hospedeiro”. Assim, a fermentação bacteriana passa a ter significado clínico e
efeitos metabólicos importantes na fisiologia do intestino grosso. Estudos em
animais e humanos indicam que os frutanos, através de seus efeitos
gastrintestinais, podem afetar indiretamente o metabolismo de carboidratos, de
lipídeos e de minerais, bem como atuar na modulação da função imunológica
25
(WOLEVER, 1995; ROBERFROID & DELZENNE, 1998; DELZENNE et al.,
2002; SCHLEY & FIELD, 2002; SCHOLZ-AHRENS et al., 2001; SCHOLZ-
AHRENS & SCHREZENMEIER, 2002; LOBO & FILISETTI, 2003a; LOBO &
FILISETTI, 2003b).
2.6.1. Efeitos no trato gastrintestinal
As evidências relacionadas à resistência a digestão dos frutanos no
intestino delgado têm surgido de estudos in vitro e in vivo (TOKUNAGA et al.,
1989; ELLEGÅRD et al., 1997; CUMMINGS et al., 2001; CHERBUT, 2002).
TOKUNAGA et al. (1989) demonstraram que, em comparação à sacarose e à
lactose, a afinidade e atividade de enzimas intestinais purificadas são
negligenciáveis, após a incubação de FOS com homogenatos do conteúdo
intestinal de ratos. Em ensaios in vivo, têm sido utilizados indivíduos
ileostomizados permitindo, desta forma, a determinação direta e quantitativa do
material que sai do intestino delgado. Uma alternativa a essa metodologia é a
aspiração do conteúdo intestinal diretamente do íleo, através da intubação por
uma cânula. De acordo com CUMMINGS et al. (2001), a utilização de ambas
as técnicas tem resultado em uma taxa de recuperação média de 88%, tanto
para inulina quanto para oligofrutose.
Atravessando intactos o intestino delgado, os frutanos passam a
contribuir com o pool de substratos fermentáveis para a microbiota do intestino
grosso, que incluem ainda outros carboidratos fermentáveis (amidos e
oligossacarídeos resistentes, polissacarídeos diferentes do amido), proteínas e
material endógeno (mucinas, células esfoliadas). No intestino grosso normal
existem cerca de 1.500 g de bactérias em concentrações que atingem de 1011 a
1012 organismos por grama de fezes, sendo mais de 400 espécies de bactérias,
com predomínio dos organismos anaeróbios sobre os aeróbios da ordem de
1.000 para 1 (CUMMINGS & MacFARLANE, 1991; CUMMINGS, 1997; KUDO,
2003).
Segundo KUDO (2003), as bactérias intestinais podem ser classificadas
em 3 classes. Dentre os gêneros pertencentes à classe I encontram-se os
Bacteroides, Fusobacterium, Mitsuokella, Megamonas, Eubacterium,
Bifidobacterium, Peptostreptococcus, Megashaera, entre outros, que são
encontrados em uma elevada concentração (109-11/ g de fezes). Os da classe II
26
incluem Lactobacillus, Escherichia coli (não patogênica), Streptococcus e
Veillonella. As bactérias pertencentes a esse grupo encontram-se em uma
concentração relativamente baixa (105-8/g fezes) e predominam durante o
período pós-nascimento, sendo substituídas pelas bactérias do grupo I dentro
de poucos dias. As bactérias presentes em menor concentração, como
Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, E.
coli patogênica e Bacteroidaceae, pertencem à classe III.
Embora existam diferenças consideráveis entre indivíduos, em cada um
a composição da microbiota intestinal é estável por longo tempo. Sabe-se ainda
que a sua composição não é a mesma nos diferentes segmentos do intestino
grosso e que existem diferenças entre a microbiota da luz e a que está em
íntimo contato com a mucosa (CUMMINGS, 1997; KLEESSEN et al., 2003; Le
BLAY et al., 2003).
O processo fermentativo envolve a interação entre as diferentes espécies
de bactérias presentes no intestino grosso. O ecossistema bacteriano é
extremamente complexo, com os resíduos de uma espécie microbiana servindo
de substrato para outra. Além disso, as necessidades por fatores relacionados
ao crescimento bacteriano também são supridas de maneira sinérgica
(CUMMINGS & MacFARLANE, 1991; MacFARLANE & GIBSON, 1995;
CUMMINGS, 1997; CUMMINGS & MacFARLANE, 2002). Desta forma, a
modulação da composição e da atividade metabólica da microbiota intestinal
através de intervenções dietéticas tem despertado um crescente interesse na
utilização de componentes que possam influenciar beneficamente na fisiologia
do intestino.
Em particular, o efeito prebiótico dos frutanos é proporcionado através da
estimulação seletiva da atividade e do crescimento de determinadas espécies
bacterianas, incluindo as dos gêneros Bifidobacterium e Lactobacillus, em
detrimento de espécies consideradas nocivas para o hospedeiro, e corroborado
por estudos realizados in vivo e in vitro (GIBSON & ROBERFROID; 1995;
CAMPBELL et al., 1997; ROBERFROID et al., 1998; Le BLAY et al., 1999a;
MENNE et al., 2000; CUMMINGS et al., 2001; KLEESSEN et al., 2001; Le
BLAY et al., 2003). Além disso, baseando-se na premissa maior de que as
propriedades físico-químicas das FA influenciam na cinética da fermentação,
estudos têm sido conduzidos com o objetivo de avaliar o efeito da interação
27
entre diferentes carboidratos fermentáveis na composição e na atividade
metabólica da microbiota intestinal (HENNINGSSON et al., 2002; Le BLAY et
al., 2003).
Os principais produtos do metabolismo bacteriano são gases, como H2,
CO2, e CH4, e os AGCC, dos quais os principais são o acetato (cerca de 60%
do total), o propionato e o butirato, produzidos em uma proporção molar de
60:25:15 mmol/L, respectivamente. Esta proporção, entretanto, não é constante
e depende do tipo de substrato fermentado. Em menores proporções, são
produzidos o fumarato, o lactato e o succinato. Os gases são utilizados pelas
bactérias ou absorvidos e excretados na respiração ou, ainda, excretados nas
fezes (STONE-DORSHOW & LEVITT, 1987; SCHEPPACH et al., 1995;
CAMPOS et al., 1998; CHERBUT, 2002; CUMMINGS & MacFARLANE, 2002).
Da ação enzimática sobre os carboidratos, são liberados os
monossacarídeos na fase líquida, externamente às células microbianas. Uma
vez absorvidas por tais células, os monossacarídeos entram na via glicolítica,
ou de Embden-Meyerhof-Parnas, com exceção das células das bifidobactérias.
O catabolismo da pentose ou da hexose inicial, através dessa via, origina duas
moléculas de piruvato. No processo, duas moléculas de nicotinamida-adenina
dinucleotídeo oxidada (NAD+) são reduzidas a NADH, e duas de trifosfato de
adenosina (ATP) são formadas a partir do difosfato de adenosina (ADP). A
energia potencial representada pelo ATP, neste ponto e no ponto de
ramificação do acetil-CoA, é a principal fonte energética para a manutenção e
crescimento dos microorganismos (MacFARLANE & GIBSON, 1995;
CUMMINGS, 1997; CAMPOS et al., 1998).
Como muito dos AGCC formados apresentam pK inferior ao pH das
fezes, eles são mantidos na forma de ânions dissociados. Grande parte desses
ânions é responsável pela neutralização do bicarbonato (HCO3-) secretado pela
mucosa intestinal, com liberação de água (H2O) e gás carbônico (CO2). Os
ânions dos AGCC representam cerca de 75% dos ânions presentes na luz do
intestino grosso (ENGELHARDT, 1995; CUMMINGS, 1997).
Além de serem excretados nas fezes e, em parte, aproveitados pelas
próprias bactérias (biomassa), a maior parte dos AGCC é rapidamente
absorvida. O seu transporte envolve a combinação de uma difusão simples,
após protonação dos ânions na superfície da mucosa, com um processo de
28
troca de ânions com o HCO3-, mediado por carreadores (ENGELHARDT, 1995).
De acordo com ENGELHARDT (1995), a proporção da contribuição dos dois
mecanismos de transporte para a absorção dos AGCC parece variar nos
diferentes segmentos do intestino grosso. Além disso, a composição lipídica e a
fluidez da membrana apical e basolateral podem influenciar na cinética da
absorção dos AGCC. Este processo também contribui para a absorção de
sódio, potássio e água, e aumenta a concentração luminal de HCO3-
(CUMMINGS, 1997; CAMPOS et al., 1998).
Os AGCC podem ser metabolizados nas células intestinais, fígado e
tecidos periféricos. A maior parte do butirato é oxidada em CO2 ou convertida
em corpos cetônicos na mucosa do cólon durante o transporte para o sangue.
O restante é captado pelo fígado, onde é convertido pela enzima butiril-CoA
sintetase em butiril-CoA, que é rapidamente convertido em acetil-CoA, ácidos
graxos de cadeia longa ou corpos cetônicos (RÉMÉSY et al., 1995; ZHANG et
al., 1998; CAVAGLIERI et al., 2002; PRYDE et al., 2002). Sob condições
normais, o propionato é totalmente metabolizado no fígado onde, através da
enzima propionil-CoA sintetase, é convertido em propionil-CoA. Uma parte do
propionil-CoA pode ser metabolizada até succinil-CoA, entrando no ciclo do
ácido tricarboxílico onde é formado o oxaloacetato, em seguida o piruvato e,
finalmente, a glicose (através da gliconeogênese) (DEMIGNÉ et al., 1986;
RÉMÉSY et al., 1995; CAVAGLIERI et al., 2002). Uma pequena fração do
acetato é metabolizada no fígado, sendo inicialmente convertida em acetil-CoA,
através da enzima acetil-CoA sintetase, que será utilizada para a lipogênese
(RÉMÉSY et al., 1995; CAVAGLIERI et al., 2002). Aproximadamente 95% do
butirato produzido são transportados através do epitélio, sendo que sua
concentração no sangue portal é relativamente baixa, como resultado da sua
rápida utilização (PRYDE et al., 2002).
Além do seu papel como combustível, o butirato tem sido implicado na
diminuição do crescimento de linhagens celulares de câncer de cólon, através
da inibição da proliferação celular e da modificação da arquitetura das células,
induzindo-as à diferenciação e à apoptose (SCHEPPACH et al., 1995; SMITH
et al., 1998; Le BLAY et al., 2000; JOHNSON, 2002). Em células tumorais de
câncer colo-retal, o butirato inibe o crescimento e induz a diferenciação celular,
evidenciado pela expressão de proteínas marcadoras como a fosfatase alcalina
29
e o antígeno carcinoembriogênico. Outros estudos realizados in vitro têm
demonstrado que o butirato pode influenciar a expressão gênica através da
inibição das desacetilases de histonas, levando a uma hiperacetilação da
cromatina e culminando na interrupção do ciclo celular e na indução da
diferenciação celular (KRUH et al., 1995; SMITH et al., 1998; CAVAGLIERI et
al., 2002; HINNEBUSCH et al., 2002; PRYDE et al., 2002).
Deste modo, estudos com inulina e oligofrutose têm sido realizados
utilizando-se modelos animais para determinar os efeitos quimiopreventivos do
butirato em lesões pré-neoplásicas no cólon (HUGHES & ROWLAND, 2001;
POULSEN et al., 2002; VERGHESE et al., 2002a; VERGHESE et al., 2002b).
Em geral, a multiplicidade das chamadas criptas aberrantes (focos de criptas
aberrantes) - lesões microscópicas associadas à formação de neoplasias -
induzidas por compostos carcinogênicos como o azoximetano (AOM), um
derivado químico da dimetilhidrazina (DMH), é usualmente utilizada como
marcador biológico na investigação da carcinogênese no cólon de ratos
(PRETLOW et al., 1992; PEREIRA et al., 1994). Além disso, a modulação
nutricional de tumores no cólon também tem sido estudada utilizando-se
camundongos MIN (Multiple Intestinal Neoplasia), os quais apresentam uma
predisposição ao desenvolvimento de tumores intestinais. Tais animais detêm
uma mutação constitutiva no gene APC (Adenomatous Polyposis Coli), e
possuem fenótipo semelhante ao da síndrome da polipose adenomatosa
familiar (POOL-ZOBEL et al., 2002).
Entretanto, inserido neste contexto, um efeito paradoxal dos AGCC sobre
células epiteliais normais e neoplásicas tem sido documentado quando a
carcinogênese colônica é investigada. Enquanto o butirato e, em uma menor
extensão, o propionato, reduzem a proliferação de células tumorais in vitro,
todos os três principais AGCC estimulam a proliferação em células epiteliais
normais (SAKATA, 1995; SCHEPPACH et al., 1995). O propionato, por
exemplo, da mesma forma que o butirato, tem sido implicado na inibição da
proliferação celular em células tumorais e em linfócitos (CURI et al., 1993;
CAVAGLIERI et al., 2000). Tem sido observado que o efeito do propionato
ocorre via inibição da síntese de lipídeos, em uma etapa limitante da produção
de componentes da membrana, como fosfolipídeos e colesterol (CAVAGLIERI
et al., 2002). Ainda, em dietas ricas em fibras solúveis (farelo de aveia) e
30
insolúveis (farelo de trigo), foram verificadas alterações na composição de
lipídeos neutros e fosfolipídeos de macrófagos (CAVAGLIERI, 1997).
A presença do alimento no intestino é um fator preponderante para a
manutenção de uma massa celular funcional. As evidências relacionadas aos
efeitos tróficos de carboidratos fermentáveis no trato gastrintestinal surgiram de
estudos que demonstraram uma associação entre dietas enterais deficientes
em fibras e atrofia da mucosa intestinal (GOODLAD & WRIGHT, 1983;
SCHEPPACH et al., 1995). A magnitude destes efeitos, entretanto, depende da
fermentabilidade do carboidrato, isto é, do perfil de AGCC produzidos pela
fermentação bacteriana. Assim, de acordo com SCHEPPACH e colaboradores
(1995), é improvável que a estimulação de um padrão fisiológico de
proliferação esteja relacionado com o processo de carcinogênese.
A proliferação celular no intestino grosso ocorre na região basal (zona
proliferativa) das criptas intestinais. Nas regiões superiores, o processo de
divisão celular cessa e os colonócitos sofrem diferenciação antes de alcançar a
superfície da cripta. Na superfície, as células senescentes são esfoliadas no
lúmen intestinal antes de sofrerem apoptose (SCHEPPACH et al., 1995;
WONG & WRIGHT, 1999; JOHNSON, 2002). Este processo é conhecido como
anoikis, no qual as células perdem a sua propriedade de adesão o que, em
contrapartida, induz à apoptose. A habilidade da célula em sofrer apoptose é
determinada pela posição (ou hierarquia) da célula na cripta, e de possíveis
mudanças que tais células encontram no meio extracelular à medida que
alcançam o topo da cripta (POTTEN et al., 1997; POTTEN, 1997).
Além disso, a zona proliferativa da cripta também é responsável pela
ocorrência de apoptoses espontâneas, que funcionam como um mecanismo de
controle da expansão da população de células tronco nas criptas, embora tal
mecanismo ocorra em uma proporção significativamente menor (cerca de 10
vezes menos) no intestino grosso, quando comparado com o intestino delgado
(SCHEPPACH et al., 1995; POTTEN, 1997; POTTEN et al., 1997; JOHNSON,
2002). De acordo com POTTEN (1997), este processo não é fortemente
regulado no intestino grosso devido ao aumento da expressão do gene
antiapoptótico Bcl-2. Desta forma, as diferenças posicionais observadas na
incidência da apoptose nos intestinos delgado e grosso podem apresentar
importantes repercussões em termos de risco de carcinogênese. Considerando
31
que o intestino grosso possui uma menor capacidade de remover sua
população adicional de células tronco, o maior número dessas células resultaria
em um aumento da quantidade de criptas susceptíveis ao desenvolvimento de
mutações e, desta forma, na expansão clonal das células iniciadas (POTTEN et
al., 1997; McCULLOUGH et al., 2001; WONG & GIBSON, 2003).
Por outro lado, estudos têm sugerido que existe um limiar para o número
de células tronco que cada cripta é capaz de suportar (TOTAFURNO et al.,
1987; LOEFFLER et al., 1997). Se o número de células tronco excede esse
limiar, ocorre a bifurcação da cripta, resultando em um aumento no número
total de células tronco [Figura 6] (PARK et al., 1997; WONG & GIBSON, 2003).
Neste contexto, a quantidade de criptas pode atuar como um marcador
biológico para o número de células tronco no cólon (WONG & GIBSON, 2003).
Além disso, tem sido postulado que a taxa de bifurcação das criptas é também
estimulada pelo aumento no tamanho da cripta (TOTAFURNO et al., 1987),
embora um estudo (PARK et al., 1997) tenha demonstrado, no cólon de ratos,
que o efeito hipertrófico do fator de crescimento epidermal (EGF) não está
associado com o aumento da taxa de bifurcação das criptas. Ainda,
McCULLOUGH et al. (2001) verificaram um significativo aumento na
quantidade de criptas ramificadas no cólon proximal de animais convencionais
e de animais isentos de germe (‘germ-free’), sem evidências de um processo
hiperplásico.
Existe uma considerável discussão sobre o papel da proliferação celular
no desenvolvimento de neoplasias no cólon. Se, por um lado, existe um
número de estudos demonstrando que o consumo de FA previne o
desenvolvimento de tumores, por outro lado, um número equivalente tem
evidenciado um efeito contrário, isto é, que o consumo de fibras pode estimular
o processo carcinogênico. Existem diferenças marcantes na quantidade e na
resposta da bifurcação da cripta nos diferentes locais do intestino, sendo que a
significância destas diferenças ainda permanece obscura. Assim, se a
desregulação do processo de bifurcação da cripta pode apresentar um papel
importante na iniciação de tumores e na expansão neoplásica, cresce a
necessidade de estudos adicionais sobre o real papel da divisão das criptas na
fisiologia do intestino grosso (McCULLOUGH et al., 2001; WONG & GIBSON,
2003).
32
De acordo com LUPTON (2000, 2004), o efeito do butirato sobre a
carcinogênese colônica pode depender do momento de sua
produção/administração em relação ao estágio de desenvolvimento do
processo carcinogênico. Segundo o autor, as FA parecem ser protetoras nos
estágios recentes de formação de pólipos, sendo que tal efeito não ocorre na
transição de um pólipo para um carcinoma. Além disso, o local no qual a
fermentação ocorre pode influenciar no efeito biológico apresentado por cada
AGCC (ZORAN et al., 1997; HENNINGSSON et al., 2002; Le BLAY et al.,
2003).
Figura 6– Representação esquemática do ciclo da cripta. Extraído de PARK et al. (1997).
33
LUPTON (2000, 2004) relata ainda que o tipo de gordura oferecida na
dieta pode influenciar no efeito do butirato. Em estudos com ratos, nos quais
carboidratos fermentáveis foram oferecidos em suplementação a dietas nas
quais a fonte de lípideos era óleo de milho, ocorreu uma regulação positiva da
proliferação celular na região do cólon. Por outro lado, quando os mesmos
carboidratos eram suplementados em dietas nas quais a fonte lipídica era o
óleo de peixe, rico em ácidos graxos da família ω-3, foi observado um aumento
da apoptose em todos os estágios de desenvolvimento dos tumores, isto é, nas
fases de iniciação, promoção e progressão. De acordo com HONG et al.
(2002), um mecanismo envolvido na regulação positiva da apoptose após o
consumo de pectina, uma fibra fermentável, associado ao óleo de peixe, deve-
se a incorporação dos ácidos graxos ω-3 nos fosfolipídeos das mitocôndrias
(especialmente a cardiolipina) que aumenta, por sua vez, a susceptibilidade à
peroxidação e à liberação de espécies reativas de oxigênio o que, em
contrapartida, inicia a cascata de eventos envolvidos no processo apoptótico.
Além desses, os efeitos do butirato também estão associados a um
aumento no número de células caliciformes nas criptas intestinais e,
subseqüentemente, com a modificação e com o aumento na secreção de
mucinas (SHIMOTOYODOME et al., 2000; POOL-ZOBEL et al., 2002;
KLEESSEN et al., 2003). Assim, existe um interesse crescente em substratos
que produzam espectros específicos de AGCC, em particular, aqueles com
atividade butirogênica. Um estudo recente demonstrou que somente as fibras
que promoveram uma produção estável de butirato, ao longo do tempo, no
ecossistema colônico foram capazes de diminuir o desenvolvimento dos focos
de criptas aberrantes (PERRIN et al., 2001). Existem, ainda, estudos que
demonstram que a ingestão crônica de amido resistente e de frutanos promove
um aumento na concentração intracolônica de butirato, resultante de um lento
processo adaptativo da microbiota intestinal (Le BLAY et al., 1999a; Le BLAY et
al., 1999b).
Outros efeitos da fermentação de carboidratos no intestino grosso
incluem uma redução no pH em decorrência da produção dos AGCC, o que
favorece uma diminuição na concentração de amônia (NH3) no lúmen, sendo
produzido o íon amônio (NH4+), que é eliminado nas fezes. Como a NH3 que
ganha a circulação portal é utilizada no fígado para a ressíntese de uréia, a
34
diminuição na sua circulação êntero-hepática passa a ter repercussões
positivas na terapêutica da encefalopatia hepática (YOUNES et al., 1997).
Ainda, ocorre uma diminuição na solubilidade de ácidos biliares potencialmente
tóxicos para a mucosa intestinal; e uma redução na produção, dispersão e
atividade de algumas enzimas bacterianas (nitroredutases, 7-α-desidroxilases,
azoredutases), através do controle seletivo de linhagens da microbiota
intestinal (LEVRAT et al., 1991a; CAMPBELL et al., 1997; Le BLAY et al.,
1999b; HUGHES & ROWLAND, 2001; KLEESSEN et al., 2001; CHERBUT,
2002; GUDIEL-URBANO & GOÑI, 2002).
2.6.2. Efeitos na biodisponibilidade de minerais
O efeito das fibras em estudos envolvendo a biodisponibilidade de
minerais tem sido alvo de muitas controvérsias, ao longo dos anos. Embora
componentes da fração FA, como a pectina ou a celulose, não sejam
hidrolisados pelas enzimas endógenas do intestino delgado, da mesma forma
que os frutanos ou outros oligossacarídeos resistentes, algumas propriedades
físico-químicas, incluindo a dispersibilidade, a viscosidade e a capacidade de
adsorção de água, são fatores que podem explicar a variação nos efeitos
fisiológicos apresentados por diferentes carboidratos (SCHOLZ-AHRENS &
SCHREZENMEIER, 2002; JENKINS et al., 2003).
Outros fatores como o tempo de duração do estudo, o estado nutricional
do indivíduo, a forma química e a quantidade ingerida do mineral, além de
componentes presentes na matriz do alimento, podem influenciar na utilização
do mineral pelo organismo (LOUIE, 1996; COZZOLINO, 1997; BROUNS &
VERMEER, 2000). Neste contexto, a presença de fitatos e outros componentes
associados à fração FA pode prejudicar a absorção de minerais através da
formação de complexos insolúveis, embora tal efeito seja menos relevante em
ratos (LOPEZ et al., 2000).
Nas últimas décadas, os efeitos positivos do consumo de frutanos (FOS
e inulina) e de outros carboidratos fermentáveis na absorção de Ca, Mg e Fe
têm sido amplamente investigados e demonstrados através da utilização de
diferentes protocolos experimentais (OHTA et al., 1994a; OHTA et al., 1994b;
OHTA et al., 1995; BABA et al., 1996; OHTA et al., 1999; SAKAI et al., 2000;
35
YOUNES et al., 2001; SCHOLZ-AHRENS et al., 2002). O consumo de 5% de
oligofrutose em uma dieta suplementada com 1% de Ca reduziu de uma
maneira persistente o teor do mineral nas fezes de ratos ovariectomizados ao
longo de 4 a 8 semanas de experimento sendo que, após 16 semanas, tal efeito
se tornou significativo (SCHOLZ-AHRENS et al., 2002). BROMMAGE et al.
(1993) evidenciaram um significativo aumento na absorção de Ca (cerca de
65%) em ratos alimentados com dietas suplementadas com 5% de oligofrutose
e outros carboidratos não-digeríveis. YOUNES et al. (1993) verificaram um
aumento na absorção de Ca em ratos alimentados com uma dieta
suplementada com amido resistente e diferentes teores de Ca (3 e 6 g/kg),
sendo que este aumento foi 77% maior nas dietas com 6 g/kg de Ca do que nas
dietas com 3 g/kg.
MOROHASHI et al. (1998) evidenciaram, em ratos alimentados com
dietas suplementadas com 5% de FOS, um aumento significativo na absorção e
no balanço de cálcio, sugerindo que o seu consumo poderia melhorar a
calcificação dos ossos. Comprovando esta hipótese, ainda em 1998, OHTA e
colaboradores verificaram, em ratos submetidos à gastrectomia total, uma
densidade e um conteúdo mineral ósseo, no fêmur e na tíbia, significativamente
maiores nos animais que consumiram uma dieta suplementada com 7,5% de
FOS, em relação ao grupo controle. Este efeito foi corroborado em estudos
posteriores (MOROHASHI et al., 2000; HIRAMA et al., 2003), nos quais a
massa óssea e a estrutura do fêmur de ratos gastrectomizados, submetidos a
dietas suplementadas com 7,5% de FOS, foram avaliadas utilizando-se a
densitometria por tomografia computadorizada e análises histomorfométricas,
demonstrando a contribuição dos FOS na prevenção dos sintomas relacionados
à gastrectomia.
TAKAHARA et al. (2000) verificaram valores médios significativamente
maiores para o volume trabecular ósseo, da metáfise e do colo do fêmur, em
ratos em crescimento que consumiram uma dieta suplementada com 5% de
FOS (33,8 ± 5,91% e 78,3 ± 1,82%, respectivamente), em relação ao grupo
controle (25,3 ± 6,06% e 72,7 ± 5,17%, respectivamente). ROBERFROID et al.
(2002), através de absorção de dupla energia por raios X (dual energy x-ray
absorptiometry, DEXA), avaliaram a densidade mineral óssea do corpo total de
ratos em crescimento alimentados com dietas suplementadas com diferentes
36
teores de inulina (0, 5 e 10%) e Ca (0,2; 0,5 e 1%) ao longo de 22 semanas. De
acordo com os autores, os efeitos foram mais pronunciados quando o teor de
inulina na dieta aumentou de 0 para 5% (p<0,001) independente do teor de Ca
na dieta.
Em humanos, embora a quantidade de estudos ainda seja limitada, os
efeitos positivos na absorção de Ca parecem ocorrer sob condições nas quais o
requerimento do mineral é maior, como na adolescência e em mulheres no
período após a menopausa (COUDRAY et al., 1997; TAHIRI et al., 2003a).
Várias hipóteses têm sido sugeridas para explicar o aumento da
absorção de minerais no intestino grosso após o consumo destes carboidratos.
A fermentação dos FOS é acompanhada por uma intensa produção de AGCC,
que resulta em uma diminuição no pH luminal e em um aumento na
concentração de minerais ionizados (DEMIGNÉ et al., 1995). Como
conseqüência, ocorre um aumento na solubilidade do mineral e um
subseqüente estímulo a sua difusão passiva e ativa (LUTZ & SCHARRER,
1991; BOUGLÉ et al., 2002). Além disso, os AGCC podem influenciar
diretamente a absorção mineral modificando a difusão de íons (Ca-hidrogênio,
Mg-hidrogênio) pela membrana. TRINIDAD et al. (1996) demonstraram que o
acetato e o propionato aumentam a absorção de Ca, sendo que este último,
devido a sua maior solubilidade em lipídeos, é rapidamente absorvido por
difusão direta em uma forma protonada. Uma vez no meio intracelular, os íons
H+ se dissociariam dos AGCC e seriam secretados para o lúmen em troca de
uma absorção dos minerais.
Outra hipótese foi sugerida por MINEO et al. (2002) que, através de
estudos realizados in vitro, demonstraram que vários tipos de carboidratos
resistentes, incluindo polióis e oligossacarídeos, promovem a absorção de Ca
nos intestinos delgado e grosso através do aumento da permeabilidade das
junções oclusivas.
Ainda, a fermentação de carboidratos no ceco de animais também é
acompanhada por uma hipertrofia do ceco, um efeito que poderia aumentar a
superfície absortiva para os minerais (LEVRAT et al., 1991b; YOUNES et al.,
1993; DEMIGNÉ et al., 1995; ROBERFROID & DELZENNE, 1998; SCHOLZ-
AHRENS et al., 2001; LOBO & FILISETTI, 2003b). Tem sido sugerido que o
desenvolvimento na parede do ceco ocorre devido a uma combinação entre
37
hipertrofia e hiperplasia das células (RÉMÉSY et al., 1993). Além disso, tal
efeito é acompanhado por um aumento do fluxo sangüíneo e uma vasodilatação
das artérias do ceco (DEMIGNÉ et al., 1989; LEVRAT et al., 1991b; YOUNES et
al., 1993; YOUNES et al., 2001; AALKJÆR, 2002). Através da produção do
butirato, os FOS podem indiretamente influenciar no aumento da absorção de
Ca, em virtude do reconhecido efeito no crescimento e na proliferação celular
proporcionado pelo butirato (SMITH et al., 1998; Le BLAY et al., 1999a; PRYDE
et al., 2002). Além disso, os FOS poderiam estimular também o transporte ativo
de Ca, via produção de butirato. Foi demonstrado um aumento na atividade do
receptor para 1,25(OH)2D3 estimulada pelo butirato de sódio, em cultura
primária de células de rins de aves (ANITA & ANTHONY, 1992, citado por
SCHOLZ-AHRENS & SCHREZENMEIER, 2002). Estudos adicionais, realizados
em ratos, têm evidenciado que a absorção de Ca estimulada pelos FOS pode
ocorrer em resposta a um aumento na expressão da calbindina na mucosa do
intestino grosso, em um mecanismo independente da regulação pela
1,25(OH)2D3 (OHTA et al., 1998a; OHTA et al., 1998b; TAKASAKI et al., 2000).
Assim, muitos estudos têm confirmado os efeitos positivos dos
carboidratos fermentáveis, em especial os frutanos (FOS e inulina), na absorção
intestinal e na retenção óssea de Ca. Assim, neste estudo procurou-se avaliar o
possível efeito dos FOS, presentes nas raízes tuberosas do yacón e em um
produto disponível no mercado contendo FOS purificado (Raftilose®), sobre
parâmetros intestinais e ósseos de ratos em crescimento.
38
3 Objetivos 3.1 Geral
Estudar o efeito do consumo dos FOS, provenientes de duas fontes
distintas (Raftilose e raiz tuberosa do yacón) na mineralização óssea de ratos
em crescimento.
3.2 Específicos
Verificar a influência dos FOS na absorção intestinal e no balanço de Ca
e Mg nos animais;
Verificar a retenção de Ca e Mg nos ossos através de análises químicas
(espectrofotometria de absorção atômica) e físicas (densidade mineral
óssea e propriedades mecânicas);
Realizar exames histológicos em tecidos do intestino grosso, com a
finalidade de avaliar os prováveis mecanismos envolvidos com a
absorção mineral e a subseqüente mineralização óssea.
39
4. Material e métodos 4.1. Material 4.1.1. Amostras
O presente estudo foi constituído por 2 ensaios biológicos. Para o 1º, as
rações experimentais foram suplementadas com Raftilose® P95 (Orafti-Active
Food International, Tienen, Bélgica), produto fornecido pela Clariant S.A., São
Paulo, e constituído de 94,96% de FOS extraídos da raiz do almeirão. Neste
produto, os FOS são obtidos a partir da hidrólise enzimática parcial da inulina, e
são constituídos por moléculas (GFn) com um GP médio de 4 (COUDRAY et al.,
2003a). Para o 2º ensaio biológico, foi utilizado cerca de 70 Kg de raízes
tuberosas de yacón, provenientes do Sítio São Sebastião, Município de Ibiúna,
Estado de São Paulo, colhidas após oito meses de plantio.
4.1.2. Animais
Para ambos os ensaios foram utilizados ratos machos (Rattus
novergicus, var. albinus) da linhagem Wistar Hannover, heterogênicos, com
cerca de 4 semanas de idade, obtidos a partir de colônias mantidas no biotério
de produção e experimentação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF)
e do Instituto de Química (IQ) da Universidade de São Paulo (USP). 4.2. Reagentes e equipamentos utilizados
Enzimas: amiloglicosidase de Rhizopus mold (Sigma A-7255); α-amilase
termoestável (Sigma A-3306); protease (Sigma P-3910); amiloglicosidase de
Aspergillus niger (Sigma A-9913); amiloglicosidase liofilizada de Aspergillus
niger (Sigma A-7420); frutanase (Frutanase Mixture, Megazyme, cat. E-
FRMXLQ).
Reagentes: MES, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfônico (Sigma M-8250); TRIS,
tris(hidroximetil)aminometano (Sigma T-1503); ácido nítrico 65% (HNO3, Merck,
cat. nº 1.00456.1000); ácido clorídrico fumegante 37% (HCl, Merck, cat. nº
1.00317.1000); peróxido de hidrogênio 30% (H2O2, Merck, cat. nº
1.07210.1000); óxido de lantânio III (La2O3, Merck, cat. nº 1.12220.0100);
40
solução alcoólica de Bouin [solução estoque: 80% de etanol, 750 mL;
formaldeído, 300 mL; ácido pícrico, 5 g. Solução de trabalho: solução estoque,
14 mL; ácido acético, 1 mL] (disponível em Pathology Laboratory: http://www-
medlib.med.utah.edu/WebPath/webpath.html).
Padrões e reagentes para a cromatografia e espectrofotometria de
absorção atômica: α-D-glicose (25,307-3); D-frutose (23,970-4); sacarose
(24,761-8) (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, EUA); solução de hidróxido
de sódio (NaOH) 50% (p/p), livre de carbonato (SS254-1, Fisher Scientific);
padrão de cálcio (Merck, cálcio 9943 titrisol); solução padrão de nitrato de
magnésio (Merck). Materiais especiais: lã de vidro (Merck, cat. nº 1.04086.0500); filtros de
microfibra de vidro GF/F, 25 mm ∅ (Whatman, cat. nº 1825 025), membranas
filtrantes de nylon, 0,2 µm, 25 mm ∅ (Whatman, cat. nº 7402 002) e unidade
filtrante GV Millex em polietileno com membrana Durapore, 0,22 µm, 13 mm ∅
(Millipore, cat nº JBR6 10268); coluna analítica com película de troca aniônica
CarboPac PA1 de 25 cm x 4 mm e pré-coluna analítica CarboPac PA1 de 5 cm x
4 mm (Dionex Corp., Califórnia, EUA); filme de 35 mm, Kodak Ultra 400.
Equipamentos: Cromatógrafo líquido de alta eficiência com coluna de troca
iônica, com bomba de gradiente (GP40) 3000 psi LC, equipado com módulo
degasificante de eluente, válvula microinjetora, detector de pulso eletroquímico
(ED40) do tipo PAD (Pulsed Amperometric Detector) e injetor manual e
automático de amostras AS50 (Dionex Corp.); espectrofotômetro de absorção
atômica (Polarized Zeeman AAS, Hitachi® Z-5000); pDEXA Sabre Bone
Densitometer e programa pDEXA Sabre versão 3.9.4 (Norland Medical
Systems, Wisconsin, EUA), ambos desenhados para animais de pequeno porte;
microscópio de luz e ocular integradora nº 2 (Carl Zeiss, Alemanha), analisador
de textura TA-XT2 (Texture Analyzer) e programa Texture Expert versão 1.2
(Stable Micro Systems Ltd., UK).
41
4.3. Métodos 4.3.1. Processamento das raízes tuberosas do yacón
As raízes tuberosas de yacón foram adquiridas diretamente do produtor
e imediatamente transportadas para o Laboratório de Tecnologia de Alimentos,
do Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica (FCF/USP), onde
foram mantidas armazenadas em caixas de madeira por dois dias, em
temperatura e umidade ambientes, sob baixa luminosidade. Posteriormente, foram
retiradas das caixas, lavadas cuidadosamente em água corrente, acondicionadas
em sacos de fibra de algodão e submetidas à autoclavagem (121oC) por 20
minutos. Em seguida, foram resfriadas em temperatura ambiente, descascadas,
cortadas no sentido transversal, acondicionadas em sacos plásticos vedados a
vácuo, e armazenadas em câmara frigorífica, com a temperatura variando entre
-15oC e -19oC.
Para a homogeneização das amostras autoclavadas, foi utilizado um
liquidificador industrial. Após esta etapa, foram novamente acondicionadas em
sacos plásticos vedados a vácuo e armazenadas em câmara frigorífica.
Posteriormente, as amostras foram submetidas à liofilização (Liotécnica Ind. e
Com. Ltda, Embu, São Paulo) sendo, em seguida, processadas em moinho para
a obtenção da farinha de yacón. Devido a característica demasiadamente
higroscópica dos FOS, a farinha de yacón foi acondicionada em potes plásticos
vedados e armazenada em refrigerador (cerca de 4°C) até o momento da
elaboração das rações. Segundo YUN (1996), os FOS são altamente estáveis
em temperaturas de refrigeração em períodos em torno de 1 ano. Da
quantidade total de farinha obtida, foram retiradas alíquotas para a
caracterização da composição química, sendo o restante destinado à
elaboração das rações experimentais.
4.3.2. Rações experimentais
Para o 1º ensaio biológico, as rações foram elaboradas nas
dependências do setor semi-industrial da FCF/USP e analisadas no Laboratório
de Química, Bioquímica e Biologia Molecular de Alimentos, do Departamento de
Alimentos e Nutrição Experimental da FCF/USP. Após o preparo, as rações
foram pesadas, divididas em pequenos lotes, separadas alíquotas para análise
42
da composição química e, o restante, foi acondicionado hermeticamente em
sacos plásticos, identificado e armazenado em refrigerador (cerca de 4°C), até o
momento da sua utilização.
Para o 2º ensaio biológico, as rações foram elaboradas na Universidade
Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina, acondicionadas em sacos
plásticos e, transportadas para o Laboratório de Química, Bioquímica e Biologia
Molecular de Alimentos da FCF/USP. As rações foram acondicionadas e
armazenadas da mesma forma que no 1º ensaio biológico. Todas as rações
experimentais foram elaboradas seguindo-se as recomendações do American
Institute of Nutrition (AIN-93G) (REEVES et al., 1993). Porém, para o preparo
das misturas salinas, foram utilizadas 7,5 g de Ca/kg de ração (Tabela 1), na
forma de carbonato de cálcio (CaCO3).
Para o 1º ensaio biológico, o teor de FOS utilizado na formulação da
ração (5%, p/p) foi descontado do teor de sacarose (10%, p/p, segundo a AIN-
93G). No 2º, os componentes presentes na farinha do yacón (FOS, glicose,
frutose, sacarose, proteínas, etc) foram descontados dos teores de sacarose e
de amido (Tabela 1). Para controlar a aceitação e a diferença na oferta
energética das rações experimentais, foi introduzido, no 1º ensaio, um grupo
pareado, cujo consumo da ração norteou a quantidade de ração oferecida para
os animais do grupo controle, no dia seguinte. Desta forma, pôde-se avaliar
possíveis diferenças no padrão de consumo de ração entre os grupos
experimentais.
O cálculo do valor energético das rações experimentais foi realizado
através da multiplicação dos fatores 4, para carboidratos disponíveis e
proteínas, 9 para lipídeos e 1 para os frutanos (ROBERFROID et al., 1993). Os
resultados foram expressos em kcal por 100 g de amostra.
43
Tabela 1: Distribuição dos ingredientes nas rações experimentais do 1º (Raftilose) e do 2º ensaio biológico (farinha de yacón)1
Raftilose Farinha de yacón
Ingredientes (%)
Controle Pareado FOS 5% Controle FOS 5% FOS 7,5%
Caseína (92% de proteína)† 20,00 20,00 20,00 20,24 20,24 20,24 Fibra 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 Óleo de soja 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 L-cistina 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 Bitartarato de colina2 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 Mistura vitamínica3 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 Mistura salina modificada4 3,50 3,50 3,50 3,50 3,50 3,50 Sacarose 10,00 10,00 5,00 10,00 1,76 - Amido de milho 52,95 52,95 52,95 52,71 51,61 48,70 Farinha de yacón5 - - - - 9,34 14,01 Raftilose® 6 - - 5,00 - - - Total 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 1 Conforme as especificações do AIN-93G, com algumas modificações (REEVES, P.G. et al. AIN-93 Purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition, Philadelphia, v.123, p. 1939-1951, 1993); † O teor de proteína da caseína (1º ensaio) foi determinado após a realização do ensaio, pelo método do microKjeldahl. O valor médio (n=3) encontrado foi de 92,94%. Neste sentido, a quantidade de proteína nas rações foi de 18,59%. 2 41,1% de colina; 3 Em ambos os ensaios, as misturas apresentaram, em g/kg de mistura: ácido pantotênico, 3,0; pantotenato de cálcio, 1,6; piridoxina-HCl, 0,7; tiamina-HCl, 0,6; riboflavina, 0,6; ácido fólico, 0,2; vitamina B12, 2,5; vitamina E, 15; vitamina A, 0,8; vitamina D3; vitamina K, 0,075; sacarose, 974,655; 4 A quantidade de Ca foi modificada de 0,5003 g para 0,7542 g /100 g de ração. Em ambos os ensaios, as misturas apresentaram, em g/kg de mistura: CaCO3, 538,18; KH2PO4, 196; NaCl, 74; K2SO4, 46,6; K3C6H5O7.H2O, 70,78; MgO, 24; citrato férrico, 6,06; ZnCO3, 1,65; MnCO3, 0,63; CuCO3, 0,3; KIO3, 0,01; Na2SeO4, 0,01025; paramolibdato de amônio, tetra-hidratado, 0,00795; Na2SiO3, 1,45; KCr(SO4)2.12H2O, 0,275; H3BO3, 0,0815; NaF, 0,0635; NiCO3, 0,0318; LiCl, 0,0174; NH4VO3, 0,0066; sacarose, 39,846. 5 A raiz tuberosa do yacón foi proveniente do Sítio São Sebastião, Ibiúna, São Paulo, colhida após 8 meses de plantio. GP médio de 2,65; 6 Fornecida pela Clariant S.A., São Paulo. GP médio de 4.
4.3.3. Determinação da composição química da farinha do yacón e das rações experimentais 4.3.3.1. Determinação da umidade, cinzas, proteínas e lipídeos
O teor de umidade foi determinado através da aferição da perda de peso
das amostras submetidas ao aquecimento em estufa a vácuo regulada a 70°C.
Para a determinação do teor de cinzas, utilizou-se a metodologia proposta pelo
Instituto Adolfo Lutz (1985), que se fundamenta na determinação do peso do
material restante, na amostra dessecada, após destruição da matéria orgânica a
550°C. Para a análise dos lipídeos, foi determinado o peso do material extraído,
por meio de éter etílico anidro, a partir da amostra dessecada (IAL, 1985). Para
a determinação do nitrogênio, foi empregado o método do microKjeldahl,
44
utilizando-se o fator de conversão 6,25 para obtenção do teor de proteína (AOAC,
1995).
4.3.3.2. Determinação da fração fibra alimentar
Para a análise da fibra alimentar solúvel (FAS) e insolúvel (FAI), utilizou-
se o método enzimático-gravimétrico com o tampão MES-TRIS (0,05M MES,
0,05M TRIS, pH 8,2, 24°C), de acordo com LEE et al. (1992), com algumas
modificações. O auxiliar de filtração proposto pelo método (Celite) foi substituído
pela lã de vidro, que foi tratada com HCl 1N. Este método consiste na
digestão enzimática da amostra com α-amilase termoestável, amiloglicosidase
(Sigma A-9913) e protease (para a remoção do amido e da proteína,
respectivamente), precipitação da fração solúvel com etanol a 98% (v/v) e
posterior filtração onde o resíduo é lavado com etanol a 78% e a 95%, e com
acetona, sendo posteriormente seco e pesado.
4.3.3.3. Determinação de cálcio e magnésio
As determinações de Ca e Mg foram realizadas no Laboratório de
Nutrição (Minerais) do Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental,
FCF/USP, seguindo-se a metodologia descrita por JULSHAMN et al. (1998).
Para as análises, as amostras foram previamente digeridas, em bloco digestor,
com HNO3 a 65% e H2O2 a 30% na proporção de 5:1, e a temperatura variando
entre 100 e 150ºC. Posteriormente, o material digerido foi adequadamente
diluído (1:100, para Mg e 1:2.000, para Ca, para as rações experimentais; e
1:100, para Ca e Mg, para a farinha do yacón) com água desmineralizada, na
presença de solução de La2O3 a 5% (p/v), com a finalidade de minimizar as
interferências causadas por outros minerais.
A leitura foi realizada em espectrofotômetro de absorção atômica,
utilizando-se uma lâmpada de catodo oco, calibrado na região ultravioleta, com
chama oxidante ar/acetileno, nas seguintes condições para Ca e Mg,
respectivamente: comprimento de onda, 422,7 e 202,6 nm, e fenda, 0,7 e 1,3
nm. Para o Ca, a curva de calibração foi preparada a partir da solução padrão
de Ca, após diluição com HNO3 a 1%, nas concentrações de 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 e
5,0 µg/mL. A curva de Mg foi preparada a partir da solução padrão de nitrato de
45
Mg, nas concentrações de 0,5; 1,0; 3,0; 5,0; 7,5 e 10,0 µg/mL. Para o controle
de qualidade de cada ensaio, amostras do padrão de referência secundário
[ração à base de caseína AIN-93G (REEVES et al., 1993)] foram submetidas,
em duplicata, ao mesmo procedimento de digestão e diluição (1:100 para Mg e
1:1.000 para Ca). As concentrações médias de Ca e Mg encontradas,
expressas em base úmida e seca, foram de 4,39 ± 0,50 e 4,91 ± 0,57 mg de
Ca/g de ração, e de 0,26 ± 0,01 e 0,29 ± 0,01 mg de Mg/g de ração,
respectivamente. Os gráficos de controle de qualidade das determinações de
Ca e Mg no padrão de referência secundário encontram-se nos Anexos 1 a 6,
bem como as curvas de calibração médias e as suas linearidades. Todo o
material utilizado (vidraria, recipientes de plástico), para as análises de Ca e Mg,
foi submetido previamente à desmineralização em banho de HNO3 a 30% por,
no mínimo, 12 h.
4.3.3.4. Determinação dos frutanos, frutose, glicose e sacarose
Para a análise dos frutanos e dos açúcares contidos na farinha de yacón
e na ração, foi empregada a metodologia proposta por HOEBREGS (1997),
sendo que, para a análise da farinha de yacón, foram realizadas algumas
modificações. A tomada de ensaio inicial das amostras analisadas
correspondeu a aproximadamente 1 g de frutanos (Figura 7). Para a extração
dos frutanos, foi acrescentada água destilada em ebulição ao material a ser
analisado (M1), controlando-se o pH (entre 6,5 a 8,0) e a temperatura (85o ±
2oC). A solução foi transferida para um balão volumétrico de 100 mL (para a
farinha do yacón) ou 250 mL (para as rações experimentais), mantendo-se em
agitação durante 10 minutos e a temperatura em torno de 85o ± 2oC. Após
resfriar em temperatura ambiente, o volume do balão contendo o extrato foi
completado e o balão, pesado (M2). Nesta etapa do método, uma alíquota do
extrato (M3), que seria hidrolisada com a amiloglicosidase (Sigma A-7420), foi
pesada (M4) e descartada. Posteriormente, a amostra remanescente (M5) foi
tratada com frutanase (M6). Para a análise das rações experimentais, esta
alíquota do extrato (M3) foi hidrolisada com amiloglicosidase (M4) e,
posteriormente, uma parte deste hidrolisado (M5) foi tratada com frutanase (M6).
Da amostra integral (A0) e dos hidrolisados (A1 e A2), foram retiradas alíquotas
(M7, M8 e M9, respectivamente) que foram submetidas à purificação com hexano
46
e, em seguida, filtradas através de filtros de microfibra de vidro (GF/F), e de
filtros de membrana de nylon (0,2 µm), respectivamente. Os filtrados foram
adequadamente diluídos e analisados através de cromatografia líquida de alta
eficiência em coluna de troca aniônica, com detector de pulso amperométrico
(CLAE-DPA).
Para a análise dos açúcares presentes, as condições cromatográficas
incluíram temperatura de 25o ± 0,5oC, com fase móvel A, NaOH 300 mM (livre
de carbonato) e fase móvel B, NaOH 18 mM (livre de carbonato), com fluxo de
1,0 mL/min, e volume de injeção de 25 µL. As concentrações dos açúcares
foram determinadas a partir de uma curva padrão externa, nas concentrações
de 10,0; 20,0; 30,0; 40,0; 50,0 e 60,0 µg/mL.
Figura 7 - Fluxograma para a determinação dos frutanos. A tomada de ensaio inicial, para cada amostra, correspondeu a 1 g de frutanos. Para a determinação dos teores de frutanos, glicose, frutose e sacarose,
partiu-se do princípio de que na análise do A0 foram determinadas a frutose
livre (Fl), glicose livre (Gl) e a sacarose (S); na análise de A1, a frutose livre (Fl),
a sacarose (S) e a soma da glicose livre (Gl) e da glicose proveniente do amido
análise A0 M7
amostra inicial
extração (85 ± 2 °C, pH 6,5 a 8,0)
15 g do extrato + 15 g de tampão acetato pH 4,5amiloglicosidase 30 min, 60 ± 2°C
análise A1 M8
frutanase 30 min, 60 ± 2° C
análise A2 M4
solubilização (10 min, 85 ± 2 °C)
47
(Ga); e na análise de A2, o teor total de glicose (Gt) e o teor total de frutose (Ft).
Para a determinação da glicose (Gf) e da frutose (Ff) provenientes dos frutanos
utilizaram-se as seguintes expressões:
Para o cálculo do teor de frutanos (f) foi utilizada a seguinte expressão:
Onde: k = [180 + 162(n −1)]/180n e n = [(Ff/Gf) +1], sendo ‘n’ a média
do grau de polimerização.
4.3.4. Ensaio biológico
Para cada ensaio biológico, foram utilizados vinte e quatro animais
recém-desmamados. Para o 1º ensaio, os animais foram divididos em 3 grupos
de 8 ratos cada um, sendo denominados de controle, pareado e Raftilose. Para
o 2º ensaio, foram divididos em 3 grupos de 8 ratos cada um, sendo
denominados de controle, FOS 5% e FOS 7,5%. Durante os 5 primeiros dias
(período de adaptação), os animais receberam a ração controle na forma de
péletes e, a partir do 3º dia do período de adaptação, todos os animais foram
transferidos para gaiolas metabólicas individuais de aço inoxidável. No 6º dia de
experimento, foi iniciado o período experimental, quando os animais passaram a
receber as rações elaboradas com 5% (p/p) de FOS, como Raftilose (1º ensaio),
e com 5 e 7,5% de FOS (p/p), como farinha de yacón (2º ensaio).
O consumo de ração foi registrado diariamente e o controle de peso, a
cada dois dias. A ração e a água (desmineralizada, Milli-Q Gradient, Millipore
Corporation) foram fornecidas ad libitum. O coeficiente de eficácia alimentar
(CEA) foi determinado através da relação entre o ganho de peso e o consumo
de ração no final de cada ensaio. Durante todo o período de ensaio, os animais
foram mantidos em temperatura média de 22 ± 2°C, umidade relativa de 55 ±
10%, com ciclos alternados de claro/escuro de 12 h (das 7 às 19 h, claro e das
Gf = Gt − (S/1,9) − (Gl + Ga)
Ff = Ft − S/1,9 − Fl
f = k (Gf + Ff)
48
5 d
Ratos Wistar
5 d5 d 5 d
27º d 4º d 16º d1º d 10º d
Ração controle
2º ensaio
1º ensaio 23º d
Rações experimentais
29º d
19 às 7 h, escuro). A coleta das fezes (1º e 2º ensaios) e da urina (2º ensaio) foi
realizada em 3 períodos de balanço, constituídos por 5 dias cada um (4º, 10º e
16º dias do experimento) [Figura 8], sendo as fezes pesadas, acondicionadas
hermeticamente em sacos plásticos e armazenadas em congelador a –20ºC até
o momento das análises. A urina foi acondicionada em tubos eppendorfs e
também armazenada em congelador a –20ºC até o momento das análises.
Figura 8– Delineamento experimental do 1º (Raftilose) e 2º ensaio (farinha de yacón). As rações experimentais foram constituídas de 5% de FOS, para o 1º ensaio, e de 5 e 7,5% de FOS, para o 2º ensaio. Os animais, de ambos os ensaios, consumiram a ração controle por 5 dias antes do início do período experimental. Após o início dos experimentos, foram coletadas fezes (1º e 2º ensaios) e urina (2º ensaio) em 3 períodos de 5 dias (4º, 10º e 16º dias de experimento) para determinação de Ca e Mg. Os animais foram sacrificados após 23 dias (1º ensaio) e entre o 27º e o 29º dias de experimento (2º ensaio).
Cabe ressaltar que todos os animais foram mantidos em restrição
alimentar por 12 h antes do momento do sacrifício. No 1º ensaio, após 23 dias
de período experimental, todos os animais foram sacrificados após inalação de
éter etílico por tempo prolongado. No 2º ensaio, os animais foram anestesiados
com uma solução contendo xilazina (Virbaxil® 2%, Virbac, São Paulo, 25 mg/Kg
de peso corporal), um miorrelaxante, e quetamina (Vetaset, Fort Dodge®,
Campinas, 10 mg/Kg de peso corporal), um agente anestésico, na proporção de
1:2, respectivamente, através de injeção intraperitoneal. Em seguida, após a
laparotomia, os animais foram sacrificados através da secção do diafragma.
Nesse caso, os animais foram sacrificados entre o 27º e o 29º dias do período
49
experimental, sendo utilizados o mesmo número de animais de cada grupo em
um mesmo dia.
Em ambos os ensaios, o fígado, o baço e os rins foram removidos,
limpos com solução salina (NaCl, 0,85%, p/v) e pesados. O intestino foi removido
(5 cm do íleo terminal, o ceco e 5 cm do cólon proximal) e o ceco foi separado
na região adjacente à válvula íleo-cecal e à junção ceco-colônica. Em seguida,
o ceco foi pesado (total, com o conteúdo), imediatamente colocado em uma
placa de petri resfriada com gelo, e seccionado na região do corpo do órgão.
Após a coleta (e posterior congelamento, a -20ºC) de alíquotas, com peso
conhecido, do conteúdo do ceco para posteriores análises de umidade e
minerais, a sua parede foi lavada com solução salina e pesada. Da diferença
entre o ceco total e a sua parede, foi determinado o peso do seu conteúdo. Para
o 2º ensaio, o cólon proximal e uma porção (região do corpo do ceco) da parede
cecal foram cuidadosamente lavados com solução salina e fixados em solução
alcoólica de Bouin. Após um tempo adequado para a fixação (cerca de 12 h), os
tecidos foram transferidos para solução de etanol a 70%, para posteriores
análises histológicas. Para ambos os ensaios, os membros inferiores foram
desarticulados, acondicionados em gaze embebida em solução salina e
armazenados a -20ºC até o momento do descarne.
4.3.4.1. Análise dos parâmetros ósseos
Os membros inferiores foram descongelados em temperatura ambiente
e, após dissecção anatômica dos músculos e remoção completa dos tecidos
moles, as tíbias e os fêmures foram pesados, identificados e acondicionados
(-20ºC), até o momento das análises.
4.3.4.1.1. Densitometria óssea
Inicialmente, os ossos dos animais do 1º ensaio biológico foram
submetidos à análise da densidade mineral óssea (DMO) no Laboratório de
Densitometria Óptica Radiográfica, junto ao Departamento de Cirurgia da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da USP, sendo tal
medida avaliada na região da metáfise e da diáfise da tíbia e do fêmur direitos
de cada animal. Os ossos foram dispostos em um cassete de acrílico
juntamente com uma escala de referência, confeccionada em alumínio, com
50
degraus de 0,5 mm de altura (Figura 9). Para a radiografia, foi utilizado um
aparelho de raios-X regulado para 42 kV, 50 mA e o tempo de exposição dos
ossos para 0,025 s. Em seguida, a imagem radiográfica dos ossos foi
digitalizada utilizando-se um scanner de mesa (Hawlett-Packard, HP, Scanjet
6300C), com um adaptador para transparência (HP). A análise das tonalidades
de cinza foi realizada através de um programa (ImageLab, Softium Sistemas de
Informática) e um computador (Pentium III, Infoway, Itautec), comparando-se a
densidade média das regiões do osso em estudo com a densidade média dos
degraus da escala de alumínio. Assim, foi determinada a equivalência em
milímetros de alumínio (mmAl) da densidade da região dos ossos em estudo.
Figura 9– Imagem radiográfica dos ossos (fêmures e tíbias) dos animais do 1º ensaio. A seta indica a escala de alumínio, que foi utilizada como parâmetro para a obtenção da densidade mineral dos ossos, em função das tonalidades de cinza.
Para uma melhor avaliação dos parâmetros densitométricos, foram
realizadas, posteriormente, análises (nos ossos dos animais de ambos os
ensaios) no Departamento de Anatomia do Instituto de Ciências Biomédicas
(ICB) da USP. Nesta oportunidade, a densidade (DMO) e conteúdo mineral
ósseo (CMO) foram avaliados no osso integral e nas regiões proximal, distal e
média, através do DEXA. Este método baseia-se na análise computadorizada
da atenuação de um feixe puntiforme de raios-X, emitido por uma fonte móvel,
constituído por fótons de duas energias distintas de 38 ou 70 KeV. Durante a
realização do exame, um detector, movendo-se juntamente com a fonte de
51
raios-X, faz a amostragem dos fótons que passam através de qualquer estrutura
colocada entre a fonte e o detector. Os resultados obtidos são comparados com
um padrão de densidade conhecida. As grandezas medidas pelo DEXA são a
área, expressa em cm2, e o CMO, expresso em gramas. A partir destes, é
calculada a DMO (DMO=CMO/área), expressa em g/cm2.
Para as análises, os ossos foram novamente descongelados em
temperatura ambiente e posicionados para o escaneamento na mesa do
aparelho. Para delimitar a área do osso integral, foi considerado o limite lateral
direito e esquerdo mais externo da imagem do osso escaneado. Os limites,
superior e inferior, desta área foram padronizados por 5 pontos para cima e
para baixo, respectivamente, através do recurso de deslocamento de margem
do aparelho. Para delimitar as áreas das regiões avaliadas (proximal, distal e
média), o comprimento de cada osso (dado pelo limite máximo dos lados
esquerdo e direito da imagem escaneada) foi dividido em 3 regiões iguais, no
sentido horizontal, sendo as regiões correspondentes predominantemente a
osso trabecular, representando 25% do comprimento em ambas as
extremidades (proximal e distal), e a correspondente a osso cortical (região
média), representando 50% da região intermediária do osso (Figura 10). Após
as análises, os ossos foram novamente armazenados a -20ºC, até o momento
da realização dos testes biomecânicos. Cabe destacar que alguns estudos têm
demonstrado que o armazenamento a -20ºC não altera as propriedades
biomecânicas dos ossos (ROSSI et al., 1986; MATTILA, 1999).
Figura 10– Representação esquemática das regiões analisadas nos ossos: proximal (P), medial (M) e distal (D).
52
4.3.4.1.2. Análise de cálcio e magnésio
Para a determinação de cálcio e magnésio, foi empregada a metodologia
descrita por JULSHAMN et al. (1998). As análises foram realizadas nos ossos
(fêmur e tíbia) esquerdos de cada animal. Em princípio, os ossos foram
dessecados em estufa regulada a 105°C, por 12 h. As amostras foram
previamente digeridas, em bloco digestor, com HNO3 a 65% e H2O2 a 30%, na
proporção de 5:1, e temperatura variando entre 100 e 150ºC. Posteriormente, o
material digerido foi adequadamente diluído (1:100.000, para Ca e 1:100, para
Mg) com água desmineralizada, na presença de solução de La2O3 a 5% (p/v). A
leitura foi realizada em espectrofotômetro de absorção atômica, seguindo-se os
mesmos parâmetros descritos para a leitura das amostras das rações
experimentais (item 4.3.3.3.).
4.3.4.1.3. Estudo das propriedades mecânicas
Os ensaios mecânicos foram realizados no Laboratório de Tecnologia de
Alimentos, junto ao Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica da
USP. As propriedades mecânicas foram avaliadas na região média da diáfise
dos fêmures direitos, dos animais de ambos os ensaios, através do ensaio
destrutivo de flexão em três pontos (SHIMANO, 2001; SHIMANO et al., 2002;
ZAFAR et al., 2004), utilizando-se um analisador de textura TA-XT2 acoplado ao
programa Texture Expert versão 1.2 (Stable Micro Systems, UK). Para o ensaio,
os ossos foram descongelados em temperatura ambiente e reidratados em
solução salina (NaCl, 0,85%, p/v), até o momento dos testes.
O comprimento (medido da cabeça do fêmur ao côndilo) e o diâmetro
(medido na região média da diáfise) dos ossos foram determinados utilizando-
se um paquímetro. Em seguida, os ossos foram apoiados em sua face anterior,
nas regiões da metáfise, sobre um sistema de dois suportes separados em 16
mm (Figura 11), sendo suportados pela tuberosidade deltóide para permitir uma
máxima estabilidade e prevenir a rotação do osso durante o teste. A aplicação
da carga foi realizada por uma lâmina que comprimiu perpendicularmente os
ossos na sua superfície côncava, e na região média da diáfise a uma
velocidade constante de 0,2 mm/s.
53
B
Uma curva de carga-deformação (Figura 12) foi obtida para cada osso e
foram determinadas a carga máxima (N), a carga máxima no limite elástico (N),
a rigidez (dada pela inclinação da reta gerada pela curva, expressa em N/mm),
a resiliência (energia absorvida na região elástica, dada pela área sob a curva
até o limite elástico, expressa em N.mm) e a energia absorvida até o ponto de
fratura (dada pela área sob a curva até o ponto de fratura, expressa em N.mm).
Figura 11– Fotografia dos fêmures e da região onde ocorreu a fratura, após a compressão do osso (A). Em B, o acessório utilizado para o ensaio de flexão em três pontos.
A
54
Figura 12– Curva de carga X deformação gerada durante o teste de flexão em três pontos. x, região de quebra ou ruptura do osso; y, limite elástico; z, resiliência ou região elástica, onde o osso sofre deformação elástica. N = Newton.
4.3.4.2. Absorção intestinal e balanço de cálcio e magnésio
As determinações de cálcio e magnésio, nas fezes secas e na urina,
foram realizadas seguindo-se a metodologia descrita por JULSHAMN et al.
(1998). As amostras de urina de cada animal foram descongeladas em
temperatura ambiente, agrupadas por período de balanço em um pool, filtradas
(Whatman® nº 41) e, após medição do seu volume, foram acondicionadas em
recipientes plásticos herméticos, sendo armazenadas novamente em
temperatura de -20ºC. Para as análises, alíquotas foram diluídas (1:100, para
Ca, e 1:200, para Mg) com água desmineralizada e acrescidas de solução de
La2O3 a 5% (p/v). As amostras de fezes foram previamente digeridas, em bloco
digestor, com HNO3 a 65% e H2O2 a 30% na proporção de 5:1, e temperatura
variando entre 100 e 150ºC. Posteriormente, o material digerido foi
adequadamente diluído (1:10.000, para Ca, e 1:100, para Mg) com água
desmineralizada, na presença de solução de La2O3 a 5% (p/v). A leitura foi
realizada em espectrofotômetro de absorção atômica, seguindo-se os mesmos
x
y
z
55
parâmetros descritos para a leitura das amostras das rações experimentais
(item 4.3.3.3.).
O cálculo dos parâmetros de absorção aparente e do balanço mineral foi
realizado utilizando-se as seguintes expressões: absorção aparente fracional
(mg/dia) = ingestão – excreção fecal; absorção aparente (%) = (ingestão –
excreção fecal) ingestão-1 x 100; e balanço mineral (mg/dia) = [ingestão –
(excreção fecal + excreção urinária)].
4.3.4.3. Análise dos parâmetros intestinais
O teor de umidade das fezes e de uma alíquota do conteúdo do ceco
(após descongelamento em temperatura ambiente) foi determinado através da
perda de peso das amostras submetidas ao aquecimento em estufa regulada a
105°C. Após secagem, as fezes coletadas de cada animal foram moídas, com o
moinho (IKA® A10, Labortechnik, Alemanha) sendo acionado em intervalos de
40 s, para uma homogeneização mais adequada. Para a moagem, as amostras
de fezes de cada período de balanço foram agrupadas em um pool e, em
seguida, foram armazenadas a -20ºC até o momento das determinações de Ca
e Mg. Uma outra alíquota do conteúdo do ceco, após descongelamento em
temperatura ambiente, foi centrifugada (Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, rotor nº
1412) em dois ciclos de 30 min, a 11000 g. O sobrenadante foi coletado e o pH
determinado com uma fita indicadora (Merck, Neutralit®, pH 5-10). Em seguida,
o resíduo foi armazenado a -20ºC para posterior determinação de Ca e Mg.
Para a determinação de Ca e Mg, o resíduo do conteúdo intestinal foi
descongelado em temperatura ambiente e homogeneizado com 1 (grupos
experimentais) ou 0,5 mL (grupos controle) de água desmineralizada. Foram
retiradas alíquotas do material homogeneizado para digestão com HNO3 a 65%
e H2O2 a 30% na proporção de 5:1, em bloco digestor, com temperatura
variando entre 100 e 150ºC. Posteriormente, o material digerido foi
adequadamente diluído (1:500, para Ca e 1:100, para Mg) com água
desmineralizada, na presença de solução de La2O3 a 5% (p/v). A leitura foi
realizada em espectrofotômetro de absorção atômica, seguindo-se os mesmos
parâmetros descritos para a leitura das amostras das rações experimentais
(item 4.3.3.3.).
56
Para o exame histológico dos tecidos, os fragmentos fixados foram
processados no Laboratório de Histopatologia, junto ao Departamento de
Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP, com
inclusão em parafina e obtenção de cortes de aproximadamente 5 µm de
espessura, seguido de coloração por hematoxilina e eosina (H & E). A análise
morfométrica dos cortes histológicos foi realizada no Laboratório de Biologia dos
Epitélios Digestivos, do Departamento de Histologia e Embriologia, Instituto de
Ciências Biomédicas, USP.
Para realizar a medida da profundidade das criptas do ceco, foram
selecionadas apenas aquelas que se apresentavam intactas e dispostas
longitudinalmente no corte histológico. Para cada campo selecionado, foi
contado um número mínimo de 3 criptas, considerando-se os critérios descritos
anteriormente. A profundidade das criptas foi determinada utilizando-se uma
ocular integradora, através da qual foi possível estabelecer o número de
espaços contidos em cada cripta, sendo que cada espaço correspondeu a uma
medida padrão. Para a determinação do índice de bifurcação das criptas no
ceco foram consideradas aquelas que se encontravam em todos os estágios de
bifurcação. O cálculo foi realizado utilizando-se a relação entre as criptas
bifurcadas e o número total de criptas, por campo microscópico, considerando
os mesmos critérios utilizados para a determinação da profundidade das criptas.
Para a estimativa do número total de criptas por campo microscópico, foram
consideradas também aquelas que se apresentavam de maneira oblíqua no
corte histológico.
Com o objetivo de avaliar a produção de muco pelas células caliciformes,
foram selecionados 4 blocos do intestino grosso (incluindo fragmentos do ceco
e do cólon proximal) de cada grupo experimental, do 2º ensaio biológico. Após
desparafinização, os cortes obtidos foram submetidos à reação com ácido
periódico–Schiff (PAS, periodic acid–Schiff), lavados em água destilada por 5 min e
tratados com o ácido periódico por 10 min. Posteriormente, o material foi lavado
com 3 volumes de água destilada e tratado com o reativo de Schiff por 20 min.
Em seguida, o material foi novamente lavado com água por 10 min e corado
com hematoxilina de Harris, por 5 min, lavado e desidratado.
O exame das lâminas foi realizado através de microscopia de luz (Carl
Zeiss, Alemanha), com a objetiva projetando um aumento de 40 vezes o
57
tamanho do material analisado, e uma ocular integradora de nº 2 (Carl Zeiss,
Alemanha). As fotografias foram tiradas utilizando-se um fotomicroscópio Nikon
AFX-II. 4.3.5. Análise estatística
A avaliação estatística dos resultados foi realizada com a assessoria do
Instituto de Matemática e Estatística da USP. Para as análises estudadas, foram
utilizados os seguintes procedimentos de análise inferencial: análise de
regressão clássica, análise de variância com 1 fator fixo (com 2 ou 3 níveis) e
análise de variância com modelos mistos. Em todas as análises realizadas, foi
considerado um nível de significância de 5% e os intervalos foram de 95% de
confiança. O programa computacional utilizado foi o SAS for Windows (versão
8.2).
Com o objetivo de avaliar o efeito das dietas nas variáveis medidas ao
final do experimento, foi utilizado um modelo de regressão linear (NETER et al.,
1996). Para o estudo das variáveis medidas ao longo do experimento, o modelo
utilizado foi o de análise de variância [ANOVA] (NETER et al., 1996), sob um
planejamento completamente cruzado, sendo os tratamentos definidos pela
combinação dos níveis dos fatores grupo (controle e Raftilose, para o 1º ensaio,
e controle, FOS 5% e FOS 7,5%, para o 2º ensaio) e período (1º, 2º e 3º
períodos), com medidas repetidas no fator período. Como os efeitos entre grupo
X período não foram significativos (p>0,05), foram ajustados novos modelos
sem interação. Para estudar as variáveis medidas ao final do experimento,
foram realizadas análises de variância [ANOVA] (NETER et al., 1996) com dois
níveis (1º ensaio) ou três níveis (2º ensaio) do fator grupo (controle e Raftilose,
para o 1º ensaio, e controle, FOS 5% e FOS 7,5%, para o 2º ensaio).
58
5. Resultados e discussão Existem evidências cada vez maiores de que o consumo de FA está
associado a benefícios para o organismo, especialmente para a fisiologia do
trato gastrintestinal. O termo “Fibra Alimentar (FA)” engloba uma variedade de
componentes que resistem, em uma menor ou maior extensão, a digestão e a
absorção no intestino delgado. Por sua vez, estes componentes passam a
contribuir com o pool de substratos disponíveis para o metabolismo bacteriano
no intestino grosso, de onde são produzidos gases (H2, CO2, CH4), ácidos
orgânicos como fumarato, lactato e succinato, e AGCC, como acetato,
propionato e butirato, que produzem variados efeitos para a saúde do
hospedeiro (DELZENNE & ROBERFROID, 1994; ASP, 1995; CUMMINGS &
ENGLYST, 1995).
Uma especial atenção tem sido dada ao resultado que a fermentação
bacteriana destes carboidratos resistentes produz sobre a absorção de minerais
no intestino grosso. Estudos realizados em animais e humanos têm
demonstrado que os frutanos (FOS e inulina) são intensamente fermentados no
intestino grosso proporcionando, desta forma, um ambiente favorável para a
absorção dos minerais (ROBERFROID & DELZENNE, 1998; SCHOLZ-
AHRENS et al., 2001; CUMMINGS & MacFARLANE, 2002). Neste sentido, no
presente estudo, que consistiu de dois ensaios biológicos, foram avaliados os
efeitos dos FOS provenientes de duas fontes distintas, a Raftilose (um produto
industrializado obtido a partir da raiz do almeirão) e a raiz tuberosa do yacón, sobre
a biodisponibilidade do Ca e do Mg em ratos em crescimento.
5.1. Caracterização química da Raftilose e da farinha de yacón
Em princípio, foram caracterizados os teores de Ca, Mg e de frutanos na
Raftilose e a composição química do yacón, para que fosse possível a
formulação das rações experimentais. Os teores de Ca e Mg analisados na
Raftilose foram negligenciáveis, a ponto de não interferirem no cômputo destes
minerais nas rações. Os teores de frutanos determinados na Raftilose (95,26 ±
1,60%) confirmam os valores descritos no certificado de análise do produto
fornecido pelo fabricante (Orafti-Active Food International). Além disso, o GP
médio (n=4), calculado de acordo com HOEBREGS (1997), foi de 4,5,
59
corroborando o valor fornecido pelo fabricante e os valores reportados na
literatura (ROBERFROID & DELZENNE, 1998; CARABIN & FLAMM, 1999,
COUDRAY et al., 2003a).
As amostras de yacón in natura foram submetidas à autoclavagem
(121°C, 20 min) para inativação das enzimas (polifenoloxidase e inulinase)
presentes nas raízes (MODLER et al., 1993). Posteriormente, o material
autoclavado foi submetido à liofilização e, da farinha obtida, foi determinada a
composição química do produto. Na Tabela 2 encontra-se a caracterização
química das raízes de yacón utilizadas no presente estudo. Como já era
esperado, foi verificado um elevado teor em umidade (87,13 ± 0,36%) nas
raízes autoclavadas, valor semelhante ao encontrado por CAPITO (2001) e
YOSINO (2003) em amostras submetidas a diferentes tratamentos térmicos.
Para a análise dos frutanos, a etapa da hidrólise com a amiloglicosidase,
segundo o método de HOEBREGS (HOEBREGS, 1997), foi suprimida em
virtude dos reduzidos teores de amido, verificados na literatura, em raízes
tuberosas de yacón. De acordo com CAPITO (2001), os teores de amido e de
frutanos no yacón podem sofrer variações em função da época de colheita e da
variedade da planta, dentre outros fatores. OHYAMA et al. (1990) observaram
uma flutuação no conteúdo de frutanos em raízes tuberosas de yacón durante o
seu desenvolvimento e armazenamento. De acordo com os autores, o GP
médio dos frutanos aumentou linearmente durante o desenvolvimento do yacón
e diminuiu após a colheita, sendo que neste último período, os teores de
frutose, sacarose e glicose aumentaram. NIETO (1991) relata que as raízes do
yacón apresentam, em média, um período vegetativo de 7 meses. No presente
estudo, as raízes utilizadas foram colhidas após 8 meses de plantio.
Os valores médios obtidos para os açúcares (glicose, frutose e sacarose)
e para os frutanos na farinha de yacón, foram utilizados para o cálculo dos
ingredientes na formulação das rações do 2º ensaio. Como foram verificados
consideráveis teores de açúcares livres na farinha de yacón, estes foram
descontados da sacarose (FOS 5 e 7,5%) e de parte do amido (FOS 7,5%) que
seriam adicionados às rações, na proporção preconizada pela AIN-93G
(REEVES et al., 1993).
O valor médio calculado para o GP dos frutanos da farinha de yacón foi
de 2,65. YOSINO (2003) encontrou um GP médio de 3,02, para amostras
60
também colhidas após 8 meses de cultivo. De acordo com FUKAI et al. (1993),
os frutanos encontrados no yacón são constituídos, em sua maioria, por
moléculas do tipo GF2, GF3 e GF4. Além disso, os frutanos do tipo inulina com
um GP menor que 10 possuem uma elevada solubilidade em água (cerca de
85%) e são considerados bifidogênicos, ou seja, são completamente utilizados
pela microbiota intestinal e favorecem o crescimento de espécies bacterianas
benéficas ao hospedeiro (GIBSON & ROBERFROID, 1995; CAMPBELL et al.,
1997; COUDRAY et al., 2003a). Desta forma, a amostra utilizada no presente
estudo pode ter contribuído para uma rápida e intensa atividade fermentativa na
região proximal do intestino grosso dos animais.
Tabela 2: Caracterização química da raiz tuberosa do yacón1
Amostras Determinações
Autoclavada Liofilizada2 Seca
(%) Umidade 87,13 ± 0,36 3,25 ± 0,09 ---- Cinzas 0,50 ± 0,01 3,73 ± 0,05 3,85 ± 0,06 Proteína (N x 6,25) 0,13 ± 0,04 2,56 ± 0,06 2,64 ± 0,07 Extrato etéreo 0,34 ± 0,01 0,59 ± 0,02 0,61 ± 0,02 Fibra insolúvel3 0,43 ± 0,01 7,59 ± 0,16 7,85 ± 0,17 Fibra solúvel3 1,01 ± 0,02 3,25 ± 0,04 3,36 ± 0,04 Fibra total3 1,44 ± 0,02 10,84 ± 0,13 11,21 ± 0,13 Frutanos4 7,12 ± 0,26 53,53 ± 1,95 55,33 ± 2,01 Glicose4 1,15 ± 0,06 8,68 ± 0,42 8,97 ± 0,43 Frutose4 1,74 ± 0,08 13,07 ± 0,61 13,51 ± 0,63 Sacarose4 1,73 ± 0,09 12,98 ± 0,64 13,42 ± 0,66 (mg/g) Cálcio 0,11 ± 0,01 0,80 ± 0,01 0,83 ± 0,01 Magnésio 0,08 ± 0,01 0,60 ± 0,06 0,62 ± 0,09 1 Resultados expressos como média e desvio-padrão, n = 3; 2 Para fins didáticos, a amostra liofilizada foi denominada como farinha de yacón; 3 Para a análise da fração FA, foi utilizado n = 4. 4 Para a análise dos frutanos e dos açúcares, foi utilizado n = 6.
61
5.2. Caracterização química das rações experimentais
Foram elaboradas rações semipurificadas, para animais em crescimento,
de acordo com o AIN-93 (REEVES et al., 1993), com algumas modificações
quantitativas nos teores de Ca e amido. A Tabela 3 apresenta a caracterização
química das rações experimentais do 1º e do 2º ensaios. Não foi possível, até o
momento, calcular o teor de frutanos, de amido e de açúcares (glicose, frutose e
sacarose) nas rações experimentais. Deste modo, o cálculo do valor energético
baseou-se nos valores teóricos (Tabela 1) dos nutrientes adicionados no
momento da formulação das rações e correspondeu a cerca de 395 kcal/100 g
para as rações controles (1º e 2º ensaios), 380 kcal/100 g para a ração do
grupo Raftilose (5% de FOS), 367 kcal/100 g para a ração do grupo farinha de
yacón (5% de FOS) e 356 kcal/100 g para a ração do grupo farinha de yacón
(7,5% de FOS).
Tabela 3: Caracterização química das rações experimentais do 1º (Raftilose) e do2º ensaios (farinha de yacón)1
Raftilose Farinha de yacón
Determinações Controle FOS 5% Controle FOS 5% FOS 7,5%
(%) Umidade 3,36 ± 0,14 3,20 ± 0,09 4,02 ± 0,06 4,91 ± 0,30 6,36 ± 0,04 Cinzas 3,23 ± 0,10 3,24 ± 0,15 3,24 ± 0,06 3,42 ± 0,04 3,67 ± 0,04 Proteína (N x 6,25) 21,77 ± 0,33 22,96 ± 1,17 23,28 ± 0,23 21,98 ± 1,41 21,26 ± 1,03 Extrato etéreo 6,74 ± 0,38 7,58 ± 0,07 7,66 ± 0,30 7,41 ± 0,05 7,40 ± 0,06 Fibra insolúvel2 5,28 ± 0,12 6,08 ± 0,33 5,93 ± 0,28 5,15 ± 0,49 5,52 ± 0,34 Fibra solúvel2 0,30 ± 0,16 0,37 ± 0,03 0,33 ± 0,03 0,87 ± 0,04 0,99 ± 0,05
Fibra total2 5,59 ± 0,15 6,45 ± 0,32 6,26 ± 0,25 6,02 ± 0,50 6,51 ± 0,38 (mg/g) Cálcio 11,08 ± 0,20 12,40 ± 0,38 12,17 ± 1,17 11,78 ± 0,75 12,70 ± 0,28 Magnésio 0,50 ± 0,002 0,49 ± 0,01 0,48 ± 0,004 0,52 ± 0,004 0,59 ± 0,0041 Resultados em base úmida, expressos como média e desvio-padrão, n=3; 2 Para as análises de FA, n=4. As rações experimentais foram elaboradas de acordo com as especificações do AIN-93G, com algumas modificações [ver item 4.3.2. Rações experimentais] (REEVES, P.G. et al. AIN-93 Purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on reformulation of theAIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition, Philadelphia, v.123, p. 939-1951, 1993).
As rações foram suplementadas em 2,5 g de Ca/kg de ração além do
teor recomendado pelo AIN-93G resultando, desta forma, em um valor teórico
de 7,5 g de Ca/kg de ração. Entretanto, os valores determinados para o mineral
62
variaram entre 11,1 e 12,7 g de Ca/kg nas rações dos dois ensaios biológicos.
Com o objetivo de encontrar o ingrediente que poderia estar contribuindo para
esta diferença entre os valores teóricos de Ca e os analisados, o mineral
também foi determinado na caseína utilizada na formulação das rações, tendo
sido encontrado um valor médio (n=3) de 1,35 mg de Ca/g de caseína.
Considerando que a caseína foi utilizada em uma concentração de 20% nas
rações, sua contribuição para a concentração de Ca total foi de apenas 0,27 g
de Ca/kg de ração. Com relação ao Mg, as análises químicas das rações
oferecidas aos animais confirmam o seu conteúdo esperado nas rações (480-
595 mg/kg), ou seja, a quantidade adicionada para a sua formulação.
5.3. Ensaio biológico 5.3.1. Parâmetros nutricionais dos animais controle e alimentados com Raftilose e farinha de yacón
O peso corporal e o consumo da ração, nos dois ensaios biológicos, são
apresentados na Figura 13 e na Tabela 4. Para o 1º ensaio, foi introduzido um
grupo pareado, com o objetivo de ajustar possíveis diferenças no consumo de
ração entre os grupos experimentais. Neste sentido, o efeito da interação entre
os grupos e o consumo total de ração não mostrou-se significativo a um nível de
5%. Além disso, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas
(p<0,05) para o ganho de peso e para o consumo de ração, refletindo-se, deste
modo, em um coeficiente de eficácia alimentar (CEA) médio semelhante entre
todos os grupos experimentais. Com esses resultados, e já conhecendo a
composição em frutanos e açúcares da farinha de yacón, o grupo pareado não
foi utilizado no 2º ensaio. Como já era esperado, o consumo da farinha de
yacón não afetou o crescimento e o desenvolvimento (p>0,10) dos animais ao
longo do período experimental, o que também foi refletido em um CEA médio
semelhante entre os grupos.
63
50,0
90,0
130,0
170,0
210,0
250,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
tempo (dias)
Peso
(g)
controleFOS 5%Pareado
Figura 13- Evolução do peso, ao longo do período experimental, em animais submetidos a dietas controle e suplementadas com Raftilose (1º ensaio) e com farinha de yacón (2º ensaio). Para o ensaio Raftilose, o tempo de experimento correspondeu a 23 dias e, para o ensaio farinha de yacón, a 27 dias. Valores expressos como média e desvio padrão, n = 8.
50,0
90,0
130,0
170,0
210,0
250,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
tempo (dias)
Peso
(g)
controle
FOS 5%
FOS 7,5%
Raftilose
Farinha de yacón
64
Tabela 4: Parâmetros nutricionais em ratos alimentados com rações controle e suplementadas com Raftilose (1º ensaio) e farinha de yacón (2º ensaio)1
Raftilose Farinha de yacón
Determinações Controle Pareado2 FOS 5% Controle FOS 5% FOS 7,5%
Peso inicial (g) 73,86±7,49a 70,06±6,56 71,24±8,4a 94,02±10,2a 88,92±12,02a 84,56±6,21a
Peso final (g) 216,07±17,02 a 204,75±17,20 222,99±10,7a 231,92±24,40a 234,24±18,92a 225,06±24,27a
Ganho de peso (g) 157,40±17,23 a 139,65±19,32 167,16±10,36a 146,88±19,34a 154,35±18,13a 147,68±22,47a
Consumo da ração (g) 373,69±32,20 a 322,35±22,05 382,28±17,86a 410,18±42,72a 430,75±27,53a 422,98±32,41a
CEA3 0,42±0,02 a 0,43±0,05 0,44±0,01a 0,36±0,02a 0,36±0,03a 0,35±0,03a 1 Resultados expressos como média e desvio padrão, n=8. 2 O grupo pareado recebeu a ração controle por todo o período experimental; 3 CEA (coeficiente de eficácia alimentar), que corresponde à relação entre o ganho de peso e o consumo de ração; Para o ensaio Raftilose, o tempo de experimento correspondeu a 23 dias e, para o ensaio farinha de yacón, a 27 dias; Letras iguais, em uma mesma linha, e em diferentes ensaios, não indicam diferenças significativas (p<0,05).
5.3.2. Peso dos órgãos dos animais controle e alimentados com Raftilose e farinha de yacón
Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas (p<0,05)
no peso relativo médio dos órgãos (baço, rins e fígado), bem como no peso
relativo médio do fêmur e da tíbia entre os grupos experimentais, em ambos os
ensaios (Tabela 5). No 1º ensaio, no momento da necropsia, foi verificado, ao
exame macroscópico, um aumento unilateral no rim de um dos animais do
grupo Raftilose, sendo o órgão, desta forma, desconsiderado no momento do
cálculo do peso médio. Casos isolados e semelhantes foram verificados em
estudos envolvendo o consumo de diferentes fibras, como os FOS e o farelo de
trigo (WALTER et al., 1986; CARABIN & FLAMM, 1999). Por outro lado, segundo
CARABIN & FLAMM (1999), não foram observados sinais de anormalidades, em
nível macroscópico e microscópico, em órgãos como fígado, pâncreas, rins,
baço e coração, em ratos alimentados com rações suplementadas com FOS
(GP médio de 3,5) em doses que variaram de 5 a 10% na dieta. A deposição
patológica de minerais e sais de Ca pode ocorrer em tecidos não-osteóides
devido a uma hipercalcemia. No entanto, CHONAN et al. (1996) vericaram, em
ratos, que o consumo de 5% de galactooligossacarídeos (GOS), um carboidrato
fermentável derivado da hidrólise bacteriana da lactose, preveniu os sintomas
relacionados a calcificação dos rins, em resposta a uma dieta com elevados
teores de Ca.
65
Tabela 5: Peso relativo dos órgãos de ratos alimentados com rações controle e rações suplementadas com Raftilose e farinha de yacón1
Raftilose Farinha de yacón Órgãos (g/100g)
Controle FOS 5% Controle FOS 5% FOS 7,5%
Fígado 3,16 ± 0,06a 3,23 ± 0,15a 3,15 ± 0,63a 3,51 ± 0,56a 3,29 ± 0,18a Baço 0,26 ± 0,03a 0,25 ± 0,03a 0,23 ± 0,05a 0,25 ± 0,04a 0,25 ± 0,04a Rins2 0,90 ± 0,13a 0,83 ± 0,06a 0,88 ± 0,10a 1,02 ± 0,06a 0,82 ± 0,09a Fêmur
Direito Esquerdo
0,28 ± 0,02a 0,27 ± 0,01a
0,28 ± 0,01a 0,27 ± 0,01a
0,29 ± 0,02a
0,30 ± 0,02a
0,30 ± 0,02a 0,30 ± 0,03a
0,30 ± 0,02a 0,30 ± 0,01a
Tíbia Direita Esquerda
0,23 ± 0,02a 0,22 ± 0,02a
0,23 ± 0,01a 0,22 ± 0,01a
0,23 ± 0,02a
0,24 ± 0,01a
0,24 ± 0,02a 0,24 ± 0,02a
0,23 ± 0,01a 0,24 ± 0,01a
1Resultados em base úmida, expressos como média e desvio padrão, n=8; 2Valores médios do peso dos rins esquerdo e direito. Para o ensaio Raftilose, o grupo FOS 5% apresentou n=7; Para o ensaio Raftilose, o tempo de experimento correspondeu a 23 dias e, para o ensaio farinha de yacón, a 27 dias; Letras iguais, em uma mesma linha, e em diferentes ensaios indicam diferenças significativas (p<0,05).
5.3.3. Parâmetros intestinais dos animais controle e alimentados com Raftilose e farinha de yacón
Não foram observados distúrbios gastrintestinais nos animais que
receberam as rações suplementadas com Raftilose e farinha de yacón. Os
carboidratos resistentes à digestão no intestino delgado alcançam o intestino
grosso, onde são metabolizados pela microbiota intestinal, em uma menor ou
maior extensão, resultando na produção de gases e AGCC (CAMPOS et al.,
1998; CHERBUT, 2002; CUMMINGS & MacFARLANE, 2002). Quando a
disponibilidade de substratos é maior do que a capacidade de fermentação da
microbiota, podem ocorrer sintomas de diarréia (STONE-DORSHOW & LEVITT,
1987; BRIET et al., 1995). Desta forma, o consumo destes carboidratos após
um período de adaptação contribui para uma redução nos sinais de intolerância.
Neste sentido, a coleta das fezes foi primeiramente realizada após 4 dias de
consumo dos FOS. Na Tabela 6 e nas Figuras 14 e 15 são apresentados os
resultados para o peso seco médio e o teor de umidade médio das fezes
coletadas ao longo dos 3 períodos experimentais de balanço mineral (4º, 10º e
16º dias de experimento), constituídos de 5 dias, em ambos os ensaios. Os
dados obtidos no 1º ensaio biológico demonstram que a evolução do peso seco
das fezes em relação ao tempo foi similar para os dois grupos experimentais.
66
No entanto, no 2º ensaio, foi verificado um aumento significativo (p<0,01) no
peso seco médio das fezes dos animais que consumiram a farinha de yacón em
relação ao dos animais do grupo controle, embora tais valores tenham sido
similares entre os dois grupos que consumiram FOS.
Por outro lado, tanto o consumo de Raftilose quanto o da farinha de
yacón resultou em um considerável aumento no teor de umidade das fezes
(p<0,05), sendo esse aumento progressivamente maior e de uma maneira dose-
dependente em relação aos animais que consumiram a dieta controle, nos três
períodos pré-determinados ao longo do experimento.
Tabela 6: Peso seco e teor de umidade das fezes, de 3 períodos experimentais1, de ratos alimentados com rações controle e rações suplementadas com Raftilose e farinha de yacón2
Raftilose Farinha de yacón
Fezes Controle FOS 5% Controle FOS 5% FOS 7,5%
Peso seco (g) 1º período 2º período 3º período
4,31 ± 0,75a 6,13 ± 0,60a 6,56 ± 0,78a
4,42 ± 0,59a 6,42 ± 0,64a 7,02 ± 0,92a
4,95 ± 0,61a 5,43 ± 0,81a
5,97 ± 0,56a
5,53 ± 0,66b 6,42 ± 1,21b 7,34 ± 1,12b
5,94 ± 0,47b 7,48 ± 1,00b 7,89 ± 1,07b
Umidade (%) 1º período 2º período 3º período
14,44 ± 1,81a 15,76 ± 1,79a 19,84 ± 2,93a
27,36 ± 7,78b 30,68 ± 8,11b 41,04 ± 4,48b
12,95 ± 2,25a 15,63 ± 2,53a 21,82 ± 6,83a
18,52 ± 3,41b 19,73 ± 1,69b 23,38 ± 3,54b
20,36 ± 3,66c 23,84 ± 4,26c 28,40 ± 6,36c
1Cada período (4º, 10º e 16º dias de experimento) corresponde a 5 dias; 2 Resultados expressos como média e desvio padrão, n=8; Para o ensaio Raftilose, o tempo de experimento correspondeu a 23 dias e, para o ensaio Farinha de yacón, a 27 dias; Letras diferentes em uma mesma linha, e em ensaios diferentes, indicam diferenças significativas (p<0,05).
Os FOS permanecem em solução no quimo e contribuem para o
aumento da pressão osmótica, resultando em um aumento no fluxo de água
para o lúmen intestinal. Após alcançar o intestino grosso, a microbiota utiliza
estes carboidratos para o seu metabolismo e, como resultado, são produzidos
AGCC que, reconhecidamente, afetam a motilidade intestinal (VAN LOO et al.,
1999). Além disso, a fermentação de carboidratos proporciona um incremento
na biomassa que, por sua vez, aumenta o volume fecal (VAN LOO et al., 1999;
CHERBUT, 2002). Estudos em animais e humanos têm demonstrado que a
capacidade de aumentar o volume fecal da inulina e da oligofrutose está entre
67
1,2 e 1,5 g de fezes/g de substrato ingerido (GIBSON et al., 1995; CASTIGLIA-
DELAVAUD et al., 1998; NYMAN, 2002).
Figura 14– Peso seco (g) e teor de umidade (%) das fezes, em 3 períodos experimentais (4º, 10º e 16º dias), de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com Raftilose (5% de FOS). O tempo de experimento correspondeu a 23 dias. Valores expressos como média e desvio padrão, n = 8. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1º período 2º período 3º período
Peso
sec
o (g
)
ControleFOS 5%
a a
a a aa Raftilose
05
101520253035404550
1º período 2º período 3º período
Teor
de
umid
ade
(%)
ControleFOS 5%a a
a
bb
b Raftilose
68
Figura 15– Peso seco (g) e teor de umidade (%) das fezes, em 3 períodos experimentais (4º, 10º e 16º dias), de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com farinha de yacón (5 e 7,5% de FOS). O tempo de experimento correspondeu a 27 dias. Valores expressos como média e desvio padrão, n = 8. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05).
Na Tabela 7 são apresentados alguns parâmetros intestinais, na região
do ceco, indicativos de fermentação bacteriana (também representados na
Figura 16), em ambos os ensaios. A região do ceco foi escolhida para a
avaliação dos parâmetros intestinais pelo fato dos ratos serem animais nos
quais a fermentação bacteriana ocorre predominantemente nesta região do
intestino grosso (CAMPBELL et al., 1997; LE BLAY et al., 1999a, 1999b;
YOUNES et al., 2001). O pH significativamente mais ácido (p<0,01), verificado
no conteúdo do ceco dos animais que consumiram Raftilose (1º ensaio), pode
ser considerado como um resultado indireto da produção de AGCC pelo
0
5
10
15
20
25
30
35
40
1º período 2º período 3º período
Teor
de
umid
ade
(%)
ControleFOS 5%FOS 7,5%a
a
a
b bb
cc
c
0123456789
10
1º período 2º período 3º período
Peso
sec
o (g
)
ControleFOS 5%FOS 7,5%
aa
ab
bb
b
bb
Farinha de yacón
Farinha de yacón
69
metabolismo microbiano (CAMPBELL et al., 1997; KLEESSEN et al., 2001).
Entretanto, os valores de pH, encontrados no presente estudo, foram mais
elevados do que os reportados na literatura em resposta à fermentação
bacteriana dos FOS e de outros carboidratos fermentáveis (LEVRAT et al.,
1991a; CAMPBELL et al., 1997; LU et al., 2000). Esta tendência foi mantida no
2º ensaio, embora não tenham sido observadas diferenças significativas
(p<0,05) nos valores de pH entre os grupos experimentais.
Tabela 7: Parâmetros intestinais no ceco de ratos alimentados com rações controle e rações suplementadas com Raftilose e farinha de yacón1
Raftilose Farinha de yacón
Determinações Controle FOS 5% Controle FOS 5% FOS 7,5%
Peso úmido do ceco (g/100g rato)
Total Parede Conteúdo
1,22 ± 0,35a 0,24 ± 0,06a
0,98 ± 0,30a
2,72 ± 0,38b 0,43 ± 0,07b
2,29 ± 0,83b
0,95 ± 0,29a 0,22 ± 0,02a 0,73 ± 0,29a
1,78 ± 0,30b 0,33 ± 0,03b 1,46 ± 0,30b
2,09 ± 0,39b 0,42 ± 0,06c 1,67 ± 0,34b
Conteúdo do ceco pH Umidade (%) Resíduo (g) Resíduo (g/100 g rato) Sobrenadante (g) Sobrenadante(g/100g rato) Resíduo/Sobrenadante (R/S)
8,33 ± 0,32a 72,65 ± 2,37a 1,57 ± 0,29a
0,73 ± 0,12a
0,66 ± 0,41a 0,31 ± 0,19a
3,07 ± 1,49a
7,20 ± 0,48b 83,46 ± 3,89b
3,86 ± 0,42b
1,73 ± 0,20b
1,25 ± 0,63a 0,56 ± 0,27a 3,19 ± 1,37a
8,5 ± 0,23a 73,43 ± 3,38a
1,19 ± 0,54a 0,54 ± 0,18a
0,47 ± 0,28a
0,19 ± 0,12a 2,74 ± 0,89a
8,4 ± 0,52a 77,93 ± 7,64ab
1,87 ± 0,38b 0,88 ± 0,16b
1,24 ± 0,50b
0,58 ± 0,21b 1,76 ± 0,84a
8,4 ± 0,32a 80,12 ± 3,37b
2,00 ± 0,29b 0,97 ± 0,11b
1,45 ± 0,61b
0,70 ± 0,28b 1,66 ± 0,87a
Minerais no resíduo do conteúdo do ceco Cálcio Conteúdo (mg) Concentração (mg/g) Magnésio Conteúdo (mg) Concentração (mg/g)
55,57 ± 12,52a
25,48 ± 4,23a
0,98 ± 0,29a 0,44 ± 0,10a
109,56 ± 30,76b
21,16 ± 3,96a
1,65 ± 0,42b 0,33 ± 0,11a
25,02 ± 5,75a 15,83 ± 6,00a
0,67 ± 0,50a 0,37 ± 0,13a
27,42 ± 8,20a 8,95 ± 2,10b
0,82 ± 0,40a 0,26 ± 0,11a
30,07 ± 8,36a 8,75 ± 1,72b
1,16 ± 0,46a 0,34 ± 0,10a
1 Resultados expressos como média e desvio-padrão, n=8; Para o ensaio Raftilose, o tempo de experimento correspondeu a 23 dias e, para o ensaio Farinha de yacón, a 27 dias; Letras diferentes em uma mesma linha, e em ensaios diferentes, indicam diferenças significativas (p<0,05).
70
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
total conteúdo parede
Peso
úm
ido
do c
eco
(g/1
00 g
)Controle
FOS 5%
b b
b
aa
a
Figura 16– Peso úmido do ceco, do conteúdo e da parede cecal de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com Raftilose (5% de FOS) e farinha de yacón (5 e 7,5% de FOS). Para o ensaio Raftilose, o tempo de experimento correspondeu a 23 dias e, para o ensaio Farinha de yacón, a 27 dias. Valores expressos, em base úmida, como média e desvio padrão, n = 8. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
total conteúdo parede
Peso
úm
ido
do c
eco
(g/1
00 g
)
ControleFOS 5%FOS 7,5%
a
b
b
a
bc
ab b
Farinha de yacón
Raftilose
71
Os animais, de ambos os ensaios, foram mantidos sob restrição
alimentar (jejum) por um período de 12 h antes do momento do sacrifício. De
acordo com Le BLAY et al. (2003), a concentração dos AGCC pode variar
consideravelmente dependendo do intervalo entre a última refeição e o
momento no qual as amostras são coletadas, podendo explicar, deste modo, os
elevados valores de pH encontrados no presente estudo. Além disso, o pH foi
determinado na fração sobrenadante do conteúdo do ceco após a sua
centrifugação, embora no momento do sacrifício dos animais o material tenha
sido coletado sobre uma placa de petri resfriada com gelo, com a finalidade de
minimizar possíveis perdas ocasionadas pela volatilização dos AGCC presentes
nas amostras (LU et al., 2000). Assim, a centrifugação do conteúdo do ceco
pode ter contribuído para esta volatilização, permitindo que ocorresse uma
elevação nos valores de pH. Ainda, WOLF et al. (1998) atribuíram os valores
elevados de pH encontrados em seu estudo à elevada capacidade tamponante
da ração AIN-93G.
YOUNES et al. (1996) demonstraram que a fermentação do amido
resistente (pH do conteúdo do ceco variando entre 5,05 e 5,72) afetou de uma
maneira positiva a absorção mineral (Ca e Mg), especialmente quando a
concentração de Ca nas rações era baixa (2,5 g/kg). Quando a fermentação
bacteriana de carboidratos ocorre na presença de uma reduzida concentração
luminal de Ca (3g/kg), o pH do meio torna-se demasiadamente ácido, com
predomínio para a produção de ácido láctico em prejuízo da produção de AGCC
(DEMIGNÉ et al., 1995). Por outro lado, quando a ingestão de Ca é elevada
(7,5 g/kg), uma quantidade considerável deste mineral alcança a região do
intestino grosso (encontrando-se, principalmente, em valores fisiológicos de pH)
na forma de um complexo insolúvel com o fósforo (RÉMÉSY et al., 1993;
DEMIGNÉ et al., 1995; YOUNES et al., 1996).
A presença de um sistema tampão no ceco envolvendo este complexo
entre o Ca e o fósforo tem sido descrita em ratos alimentados com rações
suplementadas com inulina e FOS (RÉMÉSY et al., 1993; TEN
BRUGGENCATE et al., 2004) e com amido resistente (YOUNES et al., 1996).
Uma elevada concentração de Ca no conteúdo do ceco pode prevenir os efeitos
negativos proporcionados por uma excessiva diminuição do pH luminal. No
presente estudo, o aumento significativo (p<0,05) do teor de Ca (expresso em
72
mg) no conteúdo do ceco (em especial, no 1º ensaio) e os valores de pH
elevados associados ao consumo dos FOS, observados no presente estudo
(Tabela 7), podem ter contribuído para contrabalançar tais efeitos, resultantes
da rápida fermentação destes carboidratos. No 2º ensaio, embora tenham sido
verificados valores mais altos para o conteúdo de Ca no ceco dos animais que
consumiram a farinha de yacón em relação aos animais do grupo controle, tais
valores não foram estatisticamente diferentes. Assim, os efeitos da fermentação
bacteriana sobre o pH do conteúdo do ceco poderiam ser, de alguma forma,
sobrepujados em virtude da elevada concentração de Ca oferecida nas rações
experimentais do presente estudo (Tabela 3), em ambos os ensaios realizados.
O consumo de FOS (Tabela 7) provocou uma considerável elevação no
peso relativo do conteúdo do ceco (g/100 g de rato), em ambos os ensaios
(p<0,01), em relação aos grupos controle, embora não tenham sido observadas
diferenças significativas nos pesos entre os grupos que consumiram a farinha
do yacón [5 e 7,5% de FOS] (Figura 16). O aumento no peso úmido do
conteúdo do ceco foi acompanhado por uma considerável elevação no peso do
resíduo (p<0,05), obtido após a centrifugação do conteúdo cecal, em ambos os
ensaios.
As médias dos valores do peso úmido do ceco total, do conteúdo e da
sua parede mostraram-se significativamente maiores (p<0,01) nos grupos que
consumiram FOS em comparação às dos grupos controle, em ambos os
ensaios (Tabela 7 e Figura 16). O aumento no peso do ceco (parede e
conteúdo) em resposta ao consumo de carboidratos fermentáveis tem sido
freqüentemente demonstrado por diferentes grupos de pesquisa (LEVRAT et al.,
1991; RÉMÉSY et al., 1993; LE BLAY et al., 1999a; YOUNES et al., 1993, 1996,
2001; LOBO & FILISETTI, 2002). Segundo YOUNES et al. (1996), tal efeito
tende a ser proporcional à fermentabilidade destes carboidratos no ceco. Desta
forma, o perfil de produtos da fermentação bacteriana (AGCC) pode estar
estreitamente envolvido com o efeito trófico dos FOS no ceco dos animais. No
presente estudo, ocorreu um aumento pronunciado (p<0,01) no peso do
conteúdo e na parede do ceco em resposta ao consumo de FOS, sugerindo um
provável aumento da biomassa (ou da ‘massa’ bacteriana). Este efeito pode ter
proporcionado um subseqüente aumento na atividade metabólica bacteriana
73
resultando, desta maneira, em uma alteração na estrutura da parede do ceco,
evidenciada através das análises histológicas realizadas no 2º ensaio.
5.3.3.1. Análises histológicas: produção de muco no ceco e no cólon proximal de animais controle e alimentados com farinha de yacón
A análise histológica das regiões do ceco e do cólon proximal dos
animais do 2º ensaio demonstrou uma coloração pelo PAS mais acentuada, no
grupo que recebeu a farinha de yacón (FOS 5 e 7,5%) em relação ao grupo
controle, demonstrando um maior estímulo para produção de muco pelas
células caliciformes (Figura 17 e 18).
Figura 17– Cortes histológicos do ceco de ratos alimentados com rações controle (A) e suplementadas com farinha de yacón [5 e 7,5% de FOS] (B e C, respectivamente). Notar o aumento na intensidade da coloração proporcionada pelo ácido periódico – Schiff (PAS), na região basal das criptas (setas), demonstrando o aumento da quantidade de muco produzido pelas células caliciformes, nos cortes B e C. O tempo de experimento correspondeu a 27 dias. PAS, ampliações de 200x.
A camada de muco é um componente estrutural do intestino, atuando na
proteção, na lubrificação e no transporte entre o conteúdo luminal e o epitélio
(DePLANCKE & GASKINS, 2001). As propriedades viscoelásticas do muco são
derivadas de glicoproteínas denominadas mucinas, que consistem de domínios
glicosilados e não-glicosilados. As mucinas são secretadas na superfície apical
de células colunares altamente especializadas, as chamadas células
caliciformes. Estas células podem ser originadas a partir das células-tronco
situadas na região basal das criptas intestinais, ou a partir de células pouco
A B C
74
diferenciadas referidas como células oligomucosas, também situadas na
região basal da cripta (SPECIAN & OLIVER, 1991).
As mucinas são classificadas em neutras e ácidas, sendo estas últimas
divididas em sulfatadas (sulfomucinas) e não-sulfatadas (sialomucinas).
Enquanto as mucinas neutras predominam na mucosa gástrica, as ácidas são
expressas ao longo de todo o epitélio intestinal, com predomínio no intestino
grosso. Segundo DePLANCKE & GASKINS (2001), as mucinas ácidas possuem
uma maior capacidade de proteção contra a translocação bacteriana, uma vez
que este tipo de mucina é mais resistente às glicosidases bacterianas e às
proteases do hospedeiro.
Figura 18– Cortes histológicos do cólon proximal de ratos alimentados com rações suplementadas com farinha de yacón (7,5% de FOS). O aumento na intensidade da coloração também ocorreu no cólon, principalmente na região basal das criptas (setas), demonstrando o aumento da quantidade de muco produzido pelas células caliciformes. O tempo de experimento correspondeu a 27 dias. PAS, ampliações de 400x.
Os efeitos relacionados à fermentação dos frutanos (FOS e inulina) têm
sido amplamente investigados (GIBSON & ROBERFROID, 1995; CAMPBELL et
al., 1997; LE BLAY et al., 1999; KLEESSEN et al., 2003). Sabe-se que estes
substratos são rapidamente metabolizados pelas bactérias intestinais,
resultando na produção de ácidos orgânicos, tais como os AGCC e o lactato
(CHERBUT, 2002; CUMMINGS & MacFARLANE, 2002; Le BLAY et al., 1999a).
Como conseqüência, ocorre uma diminuição no pH luminal que, por sua vez,
pode inibir o crescimento de espécies bacterianas patogênicas. Neste sentido,
75
estes componentes têm sido considerados como prebióticos, devido a sua
capacidade de estimular seletivamente o crescimento e a atividade metabólica
de espécies bacterianas consideradas benéficas para o hospedeiro, tais como
as bifidobactérias e lactobacilos (GIBSON & ROBERFROID, 1995; Le BLAY et
al., 1999a; KLEESSEN et al., 2003). Estas bactérias podem reduzir a
colonização de patógenos intestinais pela produção dos ácidos orgânicos ou,
ainda, através da competição por nutrientes ou por sítios de adesão
(CAMPBELL et al., 1997; ROBERFROID et al., 1998).
Por outro lado, a pronunciada diminuição do pH em resposta a uma
intensa atividade fermentativa pode ser nociva para a integridade da mucosa
intestinal (RÉMÉSY et al., 1993; DEMIGNÉ et al., 1995), possibilitando uma
maior susceptibilidade da barreira mucosa contra agentes patogênicos (TEN-
BRUGGENCATE et al., 2003; BOVEE-OUDENHOVEN et al., 2003). Assim,
como conseqüência a esta condição ácida, as células da mucosa são
estimuladas a produzir muco (BOVEE-OUDENHOVEN et al., 2003).
O muco aderente forma uma fina camada sobre o epitélio que mantém o
pH diferente do reinante na luz intestinal, com uma mínima faixa de variação.
Desta forma, o muco pode apresentar efeito protetor contra a colonização e
liberação de toxinas por bactérias patogênicas (DePLANCKE & GASKINS,
2001). A secreção de muco pode ainda estar sendo estimulada diretamente
pela presença de AGCC (em especial, o butirato), por um mecanismo
envolvendo receptores quimiossensíveis e nervos colinérgicos, responsáveis
pela liberação de muco a partir das células caliciformes presentes na região do
cólon (SHIMOTOYODOME et al., 2000).
A quantidade e a composição da camada de muco refletem um equilíbrio
entre a sua secreção e a erosão e degradação pelas bactérias intestinais
(DePLANCKE & GASKINS, 2001). De acordo com SHARMA et al. (1995), a
dieta e a microbiota também podem alterar a distribuição e a composição das
mucinas no intestino. Estudos têm evidenciado um aumento na secreção de
mucina e no número relativo de células caliciformes em resposta a dietas com
elevados teores de FA (SUBRAMANIAM et al., 1990; SCHMIDT-WITTIG et al.,
1996; KLEESSEN et al., 2003). KIM (2002) observou um maior número de
células caliciformes nas regiões do jejuno e do íleo em animais que consumiram
rações suplementadas com pectina (10%) e inulina (5%) em comparação aos
76
animais do grupo controle. KLEESSEN et al. (2003) observaram um aumento
significativo na espessura da camada de muco, além de uma maior quantidade
de células caliciformes e de mucinas ácidas, com predomínio para as
sulfomucinas, nas regiões do jejuno e do cólon distal em resposta ao consumo
de oligofrutose e inulina.
5.3.3.2. Análises histológicas: morfometria da mucosa intestinal de animais controle e alimentados com farinha de yacón
A Figura 19 demonstra que o consumo de 7,5% de FOS estimulou, de
uma maneira significativa (p<0,05), o aumento no número de criptas no ceco.
Além disso, a suplementação de 7,5% de FOS resultou em um comprimento
das criptas significativamente maior (p<0,05) em comparação ao grupo controle
(Figura 20). HOWARD et al. (1995) demonstraram, em ratos, que fibras inertes
ou pobremente fermentáveis contribuíram para a manutenção do peso normal
do cólon através da prevenção da atrofia da camada muscular, considerando
que para a manutenção da integridade da camada mucosa foi requerida a
presença de um substrato fermentável.
A manutenção da integridade da mucosa necessita da presença do
alimento no intestino (GOODLAD & WRIGHT, 1983; SCHEPPACH et al., 1995).
De acordo com WONG & WRIGHT (1999), quando o controle do crescimento da
mucosa é avaliado, os conceitos de nutrição luminal e demanda funcional da mucosa devem ser distinguidos. A redução na produção de células na cripta
está associada a uma ausência de nutrição luminal ou a uma alterada demanda
funcional. Assim, estudos têm demonstrado que existe uma profunda atrofia da
mucosa em situações de nutrição parenteral total ou de ingestão de dietas
isentas de fibra (GOODLAD & WRIGHT, 1983; SCHEPPACH et al., 1995;
WONG & WRIGHT, 1999). Por outro lado, evidências indicam uma redução na
atrofia da mucosa e um estímulo na síntese de DNA no intestino grosso após a
suplementação, com FA, com dietas isentas de fibras (GOODLAD & WRIGHT,
1983).
77
Figura 19– Número de criptas do ceco por campo microscópico de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com farinha de yacón (5 e 7,5% de FOS). O tempo de experimento correspondeu a 27 dias. Valores expressos como média e desvio padrão. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05).
Figura 20- Profundidade das criptas no ceco de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com farinha de yacón (5 e 7,5% de FOS). O tempo de experimento correspondeu a 27 dias. Valores expressos como média e desvio padrão. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05).
No intestino grosso, o efeito trófico das FA tem sido atribuído aos AGCC
produzidos a partir da fermentação bacteriana destes carboidratos (LIVESEY &
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
controle FOS 5% FOS 7,5%
nº d
e cr
ipta
s/ca
mpo
aa
b
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
controle FOS 5% FOS 7,5%
Prof
undi
dade
das
crip
tas
(nº d
e es
paço
s co
ntad
os)
aab
b
78
ELIA, 1995; SAKATA, 1995; GEE et al., 1996). Sob tais circunstâncias,
RÉMÉSY et al. (1993) reportaram um aumento na profundidade e no número de
células por cripta em ratos alimentados com rações suplementadas com 15% de
inulina. Outros estudos têm evidenciado uma alteração no comprimento e na
densidade das criptas após o consumo de outros carboidratos fermentáveis
(JOHNSON & GEE, 1986; HOWARD et al., 1995; SCHMIDT-WITTIG et al.,
1996; CAVAGLIERI-FELIPPE et al., 1997). Dentre os AGGC produzidos, o
butirato tem sido reconhecido como a principal fonte de energia para a mucosa
colônica, apresentando um papel importante no estímulo da divisão celular na
mucosa do intestino (SAKATA, 1995; CAMPBELL et al., 1997; LE BLAY et al.,
1999). Além disso, tem sido sugerido que os efeitos tróficos dos AGCC podem
estar sendo mediados por hormônios e fatores de crescimento (LEVRAT et al.,
1991b; KLURFELD, 1992; FRANKEL et al., 1994; GEE et al., 1996;
MASSIMINO et al., 1998; KLEESSEN et al., 2001).
O aumento no número de criptas no ceco (Figura 21) em resposta à
ingestão dos FOS, verificado no presente estudo, foi substanciado por um
número de criptas em bifurcação significativamente maior (p<0,05) observado
no ceco dos animais que consumiram a farinha de yacón (5 e 7,5% de FOS) em
relação ao grupo controle (Figuras 21, 22, 23 e 24). Além disso, esta tendência
também foi intensamente verificada na região do cólon proximal, conforme
ilustram as Figuras 25 e 26. Segundo McCULLOUGH et al. (1998), embora tal
processo ainda seja pouco conhecido, a produção de novas criptas através do
mecanismo de bifurcação (ou fissão) pode ser considerada como uma maneira
alternativa ou complementar para o controle do aumento da massa tecidual no
intestino.
79
Figura 21– Cortes histológicos da região do ceco de ratos alimentados com rações controle (A) e suplementadas com farinha de yacón [5 e 7,5% de FOS] (B e C, respectivamente), demonstrando o aumento no número de criptas por campo, estimulado pelo consumo dos FOS. Em B, as setas indicam criptas em processo de bifurcação. O tempo de experimento correspondeu a 27 dias. H.E., ampliações de 200x.
B
C
A
80
Figura 22– Corte histológico do ceco de um animal alimentado com ração suplementada com farinha de yacón (7,5% de FOS). A seta indica uma cripta em bifurcação. H.E., ampliação de 200x.
Figura 23– Número de criptas bifurcadas no ceco, por campo microscópico, de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com farinha de yacón (5 e 7,5% de FOS). O tempo de experimento correspondeu a 27 dias. Valores expressos como média e desvio padrão.
0,000,200,400,600,801,001,201,401,601,802,00
controle FOS 5% FOS 7,5%
nº d
e cr
ipta
s bi
furc
adas
/cam
po
a
b
b
81
Figura 24– Número total de criptas bifurcadas pelo total de criptas no ceco de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com farinha de yacón (5 e 7,5% de FOS). O tempo de experimento correspondeu a 27 dias. Valores expressos como média e desvio padrão. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05).
Figura 25– Corte histológico do cólon proximal de um animal alimentado com ração suplementada com farinha de yacón (5% de FOS). As setas indicam criptas em processo de bifurcação. H.E., ampliação de 400x.
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
controle FOS 5% FOS 7,5%
nº c
ripta
s bi
furc
adas
/tota
l de
crip
tas
a
ab
b
82
Figura 26– Corte histológico do cólon proximal de um animal alimentado com ração suplementada com farinha de yacón (7,5% de FOS). As setas indicam criptas em processo de bifurcação. H.E., ampliação de 400x.
5.3.4. Absorção intestinal e balanço de cálcio e magnésio
Nas Tabelas 8 e 9 são apresentados os valores obtidos para os
parâmetros relacionados à absorção intestinal de Ca e Mg, respectivamente,
para o 1º ensaio. Foi verificada uma forte tendência para um maior conteúdo
fecal de Ca nos animais do grupo controle. Além disso, os dados demonstram
que os animais que consumiram FOS apresentaram, em média, maior absorção
aparente de Ca em comparação aos animais que consumiram a ração controle,
em todos os períodos experimentais, sendo esta diferença aumentada em cerca
de 35% no 1º período para estáveis 43-44% no 2º e 3º períodos (Figura 27).
Com relação ao Mg, o conteúdo fecal médio (Tabela 9) foi levemente
menor no grupo que consumiu os FOS em comparação ao grupo que consumiu
a ração controle. Para os animais do grupo controle, a quantidade excretada
variou entre 1,59 mg/dia, no 1º período, e 2,59 mg/dia, no último período
experimental, enquanto que no grupo que consumiu os FOS, os valores
variaram entre 0,9 mg/dia, no 1º período, e 1,45 mg/dia, no 3º período. Sendo
assim, o consumo dos FOS provocou um aumento na absorção intestinal
aparente que variou entre 13%, no 1º período, e 17%, no último período
experimental (Figura 27).
83
Tabela 8: Absorção de cálcio, em 3 períodos experimentais1, em ratos alimentados com dietas controle e dietas suplementadas com Raftilose (FOS 5%)2 Determinações Controle FOS 5% Ingestão, mg/dia
1º período 2º período 3º período
154,19 ± 15,93 189,98 ± 25,51 207,23 ± 20,91
179,77 ± 11,47 221,40 ± 8,18 243,12 ± 5,79
Excreção fecal, mg/dia 1º período 2º período 3º período
70,21 ± 15,53
108,22 ± 18,07 119,06 ± 20,25
47,80 ± 7,71 82,53 ± 10,12 93,60 ± 11,10
Conteúdo fecal, mg/g 1º período 2º período 3º período
80,96 ± 4,98 87,85 ± 8,40 90,47 ± 7,51
54,00 ± 4,15 64,20 ± 2,16 67,05 ± 5,63
Absorção aparente fracional, mg/dia 1º período 2º período 3º período
83,98 ± 18,49a 82,35 ± 16,61a 87,77 ± 19,15a
131,97 ± 14,57b 135,77 ± 7,49b 144,47 ± 7,76b
Absorção aparente, % 1º período 2º período 3º período
54,34 ± 10,03a 43,17 ± 6,31a 42,41 ± 8,23a
73,29 ± 4,95b 62,27 ± 3,31b 60,84 ± 2,99b
1 Cada período (4º, 10º e 16º dias de experimento) correspondeu a 5 dias; 2 Resultados expressos como média e desvio padrão, n=8; O tempo de experimento correspondeu a 23 dias; Letras diferentes em uma mesma linha indicam diferenças significativas (p<0,05).
84
Tabela 9: Absorção de magnésio, em 3 períodos experimentais1, em ratos alimentados com dietas controle e dietas suplementadas com Raftilose (FOS 5%)2
Determinações Controle FOS 5% Ingestão, mg/dia
1º período 2º período 3º período
6,89 ± 0,71 8,51 ± 1,06 9,24 ± 0,87
7,16 ± 0,46 8,70 ± 0,46 9,50 ± 0,57
Excreção fecal, mg/dia 1º período 2º período 3º período
1,59 ± 0,40 2,28 ± 0,54 2,59 ± 0,70
0,90 ± 0,18 1,40 ± 0,25 1,45 ± 0,32
Conteúdo fecal, mg/g 1º período 2º período 3º período
1,83 ± 0,24 1,85 ± 0,32 1,95 ± 0,35
1,01 ± 0,11 1,10 ± 0,19 1,03 ± 0,16
Absorção aparente fracional, mg/dia 1º período 2º período 3º período
5,31 ± 0,56a 6,23 ± 0,76a 6,65 ± 0,58a
6,26 ± 0,55b 7,29 ± 0,40b 8,06 ± 0,45b
Absorção aparente, % 1º período 2º período 3º período
77,13 ± 4,66a 73,36 ± 4,13a 72,23 ± 5,48a
87,34 ± 2,79b 83,39 ± 2,50b 84,91 ± 3,00b
1 Cada período (4º, 10º e 16º dias de experimento) correspondeu a 5 dias; 2 Resultados expressos como média e desvio padrão, n=8; O tempo de experimento correspondeu a 23 dias; Letras diferentes em uma mesma linha indicam diferenças significativas (p<0,05).
85
Figura 27– Absorção aparente de Ca e Mg de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com Raftilose (5% de FOS). Cada período (4º, 10º e 16º dias de experimento) correspondeu a 5 dias. O tempo de experimento correspondeu a 23 dias. Valores expressos como média e desvio padrão. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05).
Nas Tabelas 10 e 11 são apresentados os dados referentes à absorção
intestinal e ao balanço mineral de Ca e Mg, para o 2º ensaio. Conforme foi
observado no 1º ensaio, ocorreu uma diminuição estatisticamente significativa
(p<0,05) no conteúdo de Ca e Mg nas fezes, ao longo dos 3 períodos
experimentais, sendo que não foram verificadas evidências demonstrando que
esta diminuição ocorreu de uma maneira dose-dependente nos animais que
consumiram os FOS. Tanto os valores de absorção intestinal aparente (Figura 28) quanto os de balanço de Ca (Figura 29) foram estatisticamente diferentes
entre os 3 grupos experimentais (p<0,05), sendo que os valores médios foram
maiores para o grupo que consumiu 7,5% de FOS e os menores para o grupo
0102030405060708090
100
1º período 2º período 3º período
Abs
orçã
o ap
aren
te (%
)..
ControleFOS 5%
a a a
bb b
0
10
20
30
4050
60
70
80
90
1º período 2º período 3º período
Abs
orçã
o ap
aren
te (%
)..ControleFOS 5%
a
b
a a
b b
Ca
Mg
86
controle. Por outro lado, a absorção aparente do Mg (Figura 28) não foi afetada
pelo consumo dos FOS, embora o grupo que consumiu 7,5% de FOS tenha
apresentado um balanço de Mg significativamente maior (p<0,05) em relação ao
grupo controle (Figura 29).
Tabela 10: Absorção intestinal aparente e balanço de cálcio, em 3 períodosexperimentais1, em ratos alimentados com dietas controle e dietas suplementadascom farinha de yacón2 Determinações Controle FOS 5% FOS 7,5% Ingestão, mg/dia
1º período 2º período 3º período
175,20 ± 23,05 200,70 ± 27,62 213,70 ± 26,86
177,27 ± 15,73 200,09 ± 22,46 219,72 ± 13,46
214,95 ± 15,01 256,89 ± 29,35 269,73 ± 31,58
Excreção urinária, mg/dia 1º período 2º período 3º período
8,77 ± 2,06 8,60 ± 2,16
11,45 ± 4,30
11,73 ± 2,17 9,92 ± 3,52 3,29 ± 1,13
8,25 ± 2,31 8,58 ± 3,32 5,44 ± 1,15
Conteúdo urinário, mg/L 1º período 2º período 3º período
270,98 ± 120,11 245,67 ± 107,08 253,41 ± 107,56
269,97 ± 81,13 243,70 ± 83,13
292,55 ± 166,16
260,77 ± 143,55 293,0 ± 206,35 122,99 ± 30,52
Excreção fecal, mg/dia 1º período 2º período 3º período
87,76 ± 15,42a
108,88 ± 17,55a 113,91 ± 15,53a
54,03 ± 9,76b 76,42 ± 20,20b 80,86 ± 9,24b
52,12 ± 8,25b 68,57 ± 9,64b 76,25 ± 7,71b
Conteúdo fecal, mg/g 1º período 2º período 3º período
88,59 ± 9,50a 97,87 ± 6,08a 95,85 ± 9,68a
54,49 ± 6,33b 68,42 ± 8,68b 67,74 ± 5,24b
52,56 ± 4,05b 62,28 ± 5,52b 63,92 ± 4,15b
Absorção aparente fracional, mg/dia1º período 2º período 3º período
87,44 ± 12,93a 91,24 ± 27,10a 97,31 ± 22,97a
123,23 ± 19,76b 123,67 ± 26,24b 138,86 ± 15,08b
162,83 ± 15,40c 188,32 ± 28,65c 193,47 ± 31,63c
Absorção aparente, % 1º período 2º período 3º período
49,99 ± 4,56a 45,07 ± 9,66a 45,72 ± 6,94a
69,26 ± 6,38b 61,69 ± 9,77b 63,12 ± 4,52b
75,70 ± 3,72c 73,08 ± 4,43c 71,39 ± 4,53c
Balanço mineral, mg/dia 1º período 2º período 3º período
78,67 ± 13,91a 82,64 ± 27,97a 85,86 ± 22,61a
111,50 ± 18,10b 113,76 ± 25,31b 135,58 ± 15,23b
154,58 ± 13,46c 179,75 ± 30,37c 188,37 ± 31,39c
1Cada período (4º, 10º e 16º dias de experimento) correspondeu a 5 dias; 2 Resultados expressos como média e desvio-padrão, n=8; O tempo total de experimento correspondeu a 27 dias; Letras diferentes em uma mesma linha indicam diferenças significativas (p<0,05).
87
Tabela 11: Absorção intestinal aparente e balanço de magnésio, em 3 períodos experimentais1, em ratos alimentados com dietas controle e dietassuplementadas com farinha de yacón2
Determinações Controle FOS 5% FOS 7,5% Ingestão, mg/dia
1º período 2º período 3º período
6,91 ± 0,91 7,89 ± 1,01 8,33 ± 1,02
7,49 ± 0,98 8,55 ± 1,09 9,02 ± 1,10
8,49 ± 1,12 9,70 ± 1,24 10,24 ± 1,25
Excreção urinária, mg/dia 1º período 2º período 3º período
1,55 ± 0,33 1,64 ± 0,35 1,68 ± 0,44
1,72 ± 0,51 1,66 ± 0,94 1,24 ± 0,59
1,31 ± 0,29 1,60 ± 0,67 1,32 ± 0,88
Conteúdo urinário, mg/L 1º período 2º período 3º período
47,78 ± 20,54 46,54 ± 19,30 37,53 ± 13,95
39,04 ± 12,76 41,15 ± 24,39 33,10 ± 9,73
49,28 ± 34,48 56,96 ± 48,05 31,97 ± 24,42
Excreção fecal, mg/dia
1º período 2º período 3º período
1,86 ± 0,46 2,30 ± 0,51 2,33 ± 0,42
1,70 ± 0,36 2,11 ± 0,40 2,28 ± 0,30
1,98 ± 0,35 2,62 ± 0,60 2,62 ± 0,44
Conteúdo fecal, mg/g 1º período 2º período 3º período
1,87 ± 0,29a 2,11 ± 0,37a 1,95 ± 0,21a
1,52 ± 0,20b 1,62 ± 0,12b 1,57 ± 0,18b
1,66 ± 0,18b 1,74 ± 0,23b 1,66 ± 0,15b
Absorção aparente fracional, mg/dia 1º período 2º período 3º período
5,05 ± 0,56a 5,77 ± 0,79a 6,00 ± 0,86a
5,79 ± 1,11a 6,44 ± 1,24a 6,74 ± 1,22a
6,51 ± 0,90a 7,08 ± 1,25a 7,69 ± 1,08a
Absorção aparente, % 1º período 2º período 3º período
73,29 ± 3,67a 71,50 ± 5,17a 71,88 ± 3,99a
76,87 ± 6,53a 74,90 ± 6,06a 74,25 ± 5,31a
76,63 ± 2,88a 72,77 ± 6,26a 74,50 ± 4,35a
Balanço mineral, mg/dia 1º período 2º período 3º período
3,50 ± 0,64a 4,11 ± 1,07a 4,32 ± 1,01a
4,07 ± 1,39ab 4,78 ± 1,70ab 5,51 ± 1,41ab
5,20 ± 1,02b 5,48 ± 1,20b 6,36 ± 1,00b
1 Cada período (4º, 10º e 16º dias de experimento) correspondeu a 5 dias; 2 Resultados expressos como média e desvio-padrão, n=8; O tempo total de experimento correspondeu a 27 dias; Letras diferentes em uma mesma linha indicam diferenças significativas (p<0,05).
88
Figura 28– Absorção aparente de Ca e Mg de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com farinha de yacón. Cada período (4º, 10º e 16º dias de experimento) correspondeu a 5 dias. O tempo de experimento correspondeu a 27 dias. Valores expressos como média e desvio padrão. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05).
Outros estudos têm demonstrado os efeitos positivos dos frutanos (FOS
e inulina) na absorção mineral, embora os resultados apresentados dependam
da relação entre a concentração do mineral e a do carboidrato oferecido na
dieta. LEVRAT et al. (1991c) avaliaram, em ratos, os efeitos de diferentes
concentrações de inulina (5, 10 e 20% na ração) na absorção aparente de Ca e
Mg. Os autores observaram que o aumento na absorção de Ca ocorreu em uma
maneira dose-dependente, fato que não foi verificado para o Mg. Por outro lado,
WOLF et al. (1998) estudaram o efeito dos FOS (1, 3 e 5% na ração) na
absorção aparente e no balanço de diversos minerais, incluindo Ca, P, Mg, Fe e
0102030405060708090
1º período 2º período 3º período
Abs
orçã
o ap
aren
te (%
).
ControleFOS 5%FOS 7,5%
aa a a
a a a a a
010
20
30
4050
60
70
8090
1º período 2º período 3º período
Abs
orçã
o ap
aren
te (%
).
ControleFOS 5%FOS 7,5%
a
bc
a
bc
a
bc Ca
Mg
89
Zn, e verificaram que somente a absorção de Mg, no grupo que recebeu 5% de
FOS na ração, foi significativamente maior do que a do grupo controle.
Figura 29– Balanço de Ca e Mg em ratos alimentados com rações controle e suplementadas com farinha de yacón. Cada período (4º, 10º e 16º dias de experimento) correspondeu a 5 dias. O tempo de experimento correspondeu a 27 dias. Valores expressos como média e desvio padrão. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
1º período 2º período 3º período
Bal
anço
min
eral
(mg/
dia)
.
ControleFOS 5%FOS 7,5%
a
a aab
abab
b bb
0
50
100
150
200
250
1ºperíodo
2ºperíodo
3ºperíodo
Bal
anço
min
eral
(mg/
dia)
.ControleFOS 5%FOS 7,5%
aa a
b bbc
c c Ca
Mg
90
Utilizando 5% de FOS nas rações experimentais, o grupo de OHTA
verificou efeitos positivos na absorção de Ca e Mg no intestino grosso,
utilizando animais sadios, deficientes em Mg ou submetidos à cirurgia para
retirada do ceco (OHTA et al., 1994a; OHTA et al., 1994b, OHTA et al., 1995;
BABA et al., 1996). Em outro estudo, o consumo de amido resistente, associado
a diferentes concentrações de Ca na ração (3 e 6 g/kg), resultou em um
aumento considerável na absorção do Ca, sendo que este aumento foi 77%
maior nas dietas com 6 g/kg de Ca (YOUNES et al., 1993). KRUGER et al.
(2003) verificaram um conteúdo (mg/g) de Ca nas fezes, coletadas em um
período de 3 dias, significativamente maior em animais que consumiram rações
suplementadas com 5% de inulina, em relação aos do grupo controle.
Os mecanimos e locais de absorção intestinal de Ca e Mg apresentam
algumas diferenças podendo, em parte, explicar os diferentes efeitos na
absorção destes dois minerais no presente estudo. O mecanismo de transporte
intestinal de Ca envolve dois processos, um paracelular e outro transcelular. O
mecanismo transcelular ocorre principalmente no duodeno e é regulado pela
1,25(OH)2D3. O transporte paracelular envolve o movimento do Ca entre as
junções intercelulares e ocorre ao longo de todo o intestino (BRONNER, 1998;
BRONNER & PANSU, 1999; SARIS et al., 2000; COUDRAY et al., 2003). Os
mecanismos de absorção intestinal de Mg envolvem um processo saturável
(difusão facilitada ou absorção ativa) e uma difusão passiva, dependente de um
arraste pelo solvente (movimento paracelular), o qual ocorre principalmente no
íleo (COUDRAY et al., 2003).
CHONAN et al. (1995) verificaram que a suplementação da ração com
5% de galactooligossacarídeos (GOS) aumentou inicialmente (9 dias) a
absorção de Ca em ratos ovariectomizados sendo que, após 28 dias de
experimento, tal efeito não foi observado. OHTA et al. (1998c) verificaram uma
menor absorção de Ca no 24º dia de experimento em comparação ao 10º dia
sendo que, para o Mg, o efeito foi similar em ambos os períodos. Estes efeitos
foram justificados pela presença de uma regulação negativa (down-regulation)
da absorção transcelular de Ca no intestino delgado após algumas semanas de
ingestão de FOS (COUDRAY et al., 2003a; TAHIRI et al., 2003a). Embora, no
presente estudo, os valores percentuais para a absorção aparente de Ca
91
tenham diminuído ao longo dos períodos experimentais, principalmente para o
grupo que recebeu 7,5% de FOS, este mecanismo parece não ter ocorrido de
uma maneira significativa.
Em relação ao Mg, estudos em animais e humanos têm evidenciado um
efeito positivo considerável na sua absorção, após a ingestão de carboidratos
fermentáveis (BABA et al., 1996; WOLF et al., 1998; COUDRAY et al., 2003a).
Entretanto, no presente estudo, esta tendência não foi observada. De acordo
com COUZY et al. (1993) uma elevada ingestão de Ca pode afetar de uma
maneira negativa a absorção de Mg. MIURA et al. (1999) observaram uma
significativa (p<0,05) redução na absorção aparente de Mg e nas suas
concentrações séricas e no fêmur, após o consumo de 1,5% de Ca, em ratos
em crescimento. O efeito inibitório de elevadas concentrações de Ca na ração,
sobre a absorção de Mg, foi documentado por BRINK et al. (1992), que
verificaram a ocorrência da formação de um complexo insolúvel entre o Ca, o
Mg e o fósforo no intestino de ratos. No presente estudo, a elevada
concentração de Ca presente nas rações pode ter influenciado ligeiramente na
absorção de Mg, especialmente no 2º ensaio.
Alguns mecanismos têm sido sugeridos para explicar o aumento na
absorção dos minerais no intestino grosso em decorrência da fermentação de
carboidratos. Tal processo é acompanhado por uma intensa produção de
AGCC, que resulta em uma diminuição no pH luminal e em um conseqüente
aumento na solubilização dos minerais favorecendo, deste modo, a sua
absorção intestinal (DEMIGNÉ et al., 1995). Além disso, no presente estudo, a
hipertrofia no ceco (Figura 16), evidenciada pelo pronunciado aumento na
quantidade e no comprimento de suas criptas no ceco (Figuras 19 e 20,
respectivamente), bem como no maior número de criptas em bifurcação
(Figuras 23 e 24) verificado nos animais que consumiram os FOS, poderia, em
princípio, explicar a maior absorção intestinal dos minerais, devido ao aumento
na superfície de absorção no intestino dos animais.
5.3.5. Efeito dos frutooligossacarídeos nos parâmetros ósseos
Na Tabela 12 são apresentados os valores correspondentes aos
parâmetros estudados (peso, conteúdo e concentração de Ca e Mg) no fêmur e
92
na tíbia dos animais de ambos os ensaios. Não foram observadas diferenças
significativas no peso dos ossos (fêmur e tíbia) entre os grupos experimentais,
em ambos os ensaios. Por outro lado, o consumo de Raftilose (5% de FOS)
proporcionou um aumento estatisticamente significativo (p<0,05) na
concentração de Ca, tanto no fêmur quanto na tíbia, quando comparado com os
ossos dos animais do grupo controle. Além disso, no 2º ensaio, somente o
grupo que recebeu 7,5% dos FOS, provenientes da farinha de yacón,
apresentou um significativo aumento na concentração deste mineral nos ossos
(fêmur e tíbia) em relação ao grupo controle (Figura 30).
Alguns estudos envolvendo os efeitos de carboidratos fermentáveis na
absorção intestinal de minerais têm sido conduzidos com a finalidade de avaliar
a extensão da sua contribuição para a mineralização óssea. Em ratos
gastrectomizados, OHTA et al. (1998c) verificaram uma concentração de Ca
significativamente maior no fêmur dos animais que consumiram rações
suplementadas com 7,5% de oligofrutose, em relação aos que consumiram a
ração controle. Uma similar tendência foi observada no fêmur de animais
ovariectomizados que consumiram oligofrutose em rações suplementadas com
1% de Ca após 8 semanas de experimento sendo que, após 16 semanas, tal
efeito perdeu significância estatística (SCHOLZ-AHRENS et al., 2002).
93
Tabela 12: Parâmetros ósseos em ratos alimentados com rações controle e rações suplementadas com Raftilose e farinha de yacón1
Raftilose Farinha de yacón
Determinações Controle FOS 5% Controle FOS 5% FOS 7,5% Peso Peso úmido(g)
Fêmur direito Fêmur esquerdo
Tíbia Direita Tíbia esquerda
Peso seco (g)
Fêmur direito Fêmur esquerdo
Tíbia Direita Tíbia esquerda
Conteúdo mineral2 Ca (mg) osso úmido
Fêmur Tíbia
Mg (mg) osso úmido
Fêmur Tíbia
Concentração mineral2 Ca (mg/g peso seco)
Fêmur Tíbia
Mg (mg/g peso seco)
Fêmur Tíbia
0,61 ± 0,03a 0,58 ± 0,04a
0,50 ± 0,03a 0,47 ± 0,04a
0,33 ± 0,02a 0,31 ± 0,02a
0,31 ± 0,03a 0,29 ± 0,02a
191,54 ± 14,70203,47 ± 24,08
1,64 ± 0,18 1,78 ± 0,10
367,1 ± 25,7a 364,0 ± 39,9a
3,38 ± 0,32a 3,02 ± 0,32a
0,63 ± 0,03a 0,61 ± 0,04a
0,52 ± 0,02a 0,50 ± 0,02a
0,35 ± 0,03a 0,33 ± 0,02a
0,30 ± 0,02a 0,28 ± 0,01a
228,45 ± 20,51 231,13 ± 22,13
1,66 ± 0,13 1,66 ± 0,11
437,7 ± 30,6b 427,2 ± 38,8b
3,18 ± 0,23a 3,06 ± 0,21a
0,62 ± 0,07a 0,63 ± 0,07a
0,49 ± 0,06a 0,50 ± 0,05a
0,37 ± 0,02a 0,38 ± 0,03a
0,30 ± 0,03a 0,31 ± 0,03a
226,57 ± 33,59220,74 ± 21,46
1,66 ± 0,35 1,77 ± 0,29
388,5 ± 41,9a 366,0 ± 27,5a
2,85 ± 0,57a 2,94 ± 0,41a
0,64 ± 0,04a 0,64 ± 0,04a
0,51 ± 0,02a 0,51 ± 0,03a
0,40 ± 0,03a 0,40 ± 0,02a
0,32 ± 0,02a 0,32 ± 0,01a
336,17 ± 26,91 220,72 ± 29,99
2,03 ± 0,17 1,59 ± 0,20
431,0 ± 43,0ab 364,3 ± 42,3ab
2,60 ± 0,18a 2,62 ± 0,27a
0,60 ± 0,06a 0,61 ± 0,06a
0,50 ± 0,04a 0,49 ± 0,05a
0,38 ± 0,03a 0,39 ± 0,04a
0,31 ± 0,02a 0,31 ± 0,03a
293,62 ± 31,56290,53 ± 21,67
1,65 ± 0,14 1,68 ± 0,14
475,1 ± 45,7b 466,3 ± 31,7b
2,70 ± 0,20a 2,66 ± 0,21a
1 Resultados expressos como média e desvio-padrão, n=8; 2 As análises de Ca e Mg foram realizadas nos ossos (fêmur e tíbia) esquerdos; Para o ensaio Raftilose, o tempo de experimento correspondeu a 23 dias e, para o ensaio farinha de yacón, a 27 dias; Letras diferentes em uma mesma linha, e em ensaios diferentes, indicam diferenças significativas (p<0,05).
94
Figura 30 – Concentração de cálcio no fêmur e na tíbia de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com Raftilose (5% de FOS) e farinha de yacón (5 e 7,5% de FOS). Para o ensaio Raftilose, o tempo de experimento correspondeu a 23 dias e, para o ensaio Farinha de yacón, a 27 dias. Valores expressos como média e desvio padrão. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05).
Em 1998, OHTA e colaboradores (OHTA et al., 1998c) verificaram, em
ratos submetidos à gastrectomia total, uma densidade e um conteúdo mineral
ósseo, no fêmur e na tíbia, significativamente maiores nos animais que
consumiram uma dieta suplementada com 7,5% de FOS, em relação ao grupo
controle. Este efeito foi corroborado em estudos posteriores (MOROHASHI et
al., 2000; HIRAMA et al., 2003), nos quais a massa óssea e a estrutura do
fêmur de ratos gastrectomizados, submetidos a dietas suplementadas com
0
100
200
300
400
500
600
Fêmur Tíbia
mg
Ca/
g pe
so s
eco.
.
ControleFOS 5%FOS 7,5%
aab
a
b
ab
b
0
100
200
300
400
500
600
Fêmur Tíbia
mg
Ca/
g pe
so s
eco
ControleFOS 5%
a a
b bRaftilose
Farinha de yacón
95
7,5% de FOS, foram avaliadas utilizando-se a densitometria por tomografia
computadorizada e análises histomorfométricas, demonstrando a contribuição
dos FOS na prevenção dos sintomas relacionados à gastrectomia.
CHONAN & WATANUKI (1995) demonstraram que o consumo de 5% de
GOS resultou em um significativo aumento no conteúdo de Ca no fêmur e na
tíbia de ratos sadios alimentados com rações suplementadas com 0,5% de Ca.
Em animais ovariectomizados, o mesmo grupo (CHONAN et al., 1995) verificou
que o conteúdo de Ca na tíbia e o peso das cinzas do fêmur foram
significativamente maiores nos animais que consumiram os GOS em relação ao
animais controle, prevenindo, desta forma, a perda óssea ocasionada pela
ovariectomia.
5.3.5.1. Propriedades mecânicas
No presente estudo, foram avaliadas algumas propriedades mecânicas
(carga máxima, carga máxima no limite elástico, rigidez, resiliência e
tenacidade) no fêmur dos animais de ambos os ensaios. A resistência de um
material composto como o osso pode ser estimada através da determinação da
curva carga X deformação, sendo que a maior parte da carga aplicada ao osso
é suportada pela fase mineral (HOLANDA, 1999; SHIMANO, 2001; SHIMANO et
al., 2002). Por outro lado, mudanças na orientação das fibras de colágeno
presentes na matriz óssea podem reduzir a quantidade de energia absorvida
necessária para causar a fratura no osso (HOLANDA, 1999; BURR, 2002).
Assim, conforme apresentado na Tabela 13, o consumo dos FOS proporcionou
um aumento numérico nos valores de todas as propriedades estudadas,
indicando que tanto o componente orgânico quanto o mineral podem ter sido
afetados (BURR, 2002), ainda que diferenças estatisticamente significativas
(p<0,05) tenham sido visualizadas somente nas variáveis carga máxima e carga
no limite elástico, no 1º ensaio, e carga máxima e rigidez, no 2º ensaio. O
ensaio destrutivo de flexão em três pontos avaliou a resistência na região média
da diáfise do osso, uma região constituída essencialmente por osso cortical.
Assim, estes resultados, associados a uma maior concentração mineral (Tabela 12), indicam que a resistência do fêmur, na região de osso cortical, foi
positivamente afetada pelo consumo dos FOS.
96
Outros trabalhos têm demonstrado resultados similares nos ossos de
ratos, em resposta ao consumo de carboidratos fermentáveis. A absorção
intestinal de Ca, o conteúdo de Ca e a resistência óssea foram avaliadas no
fêmur de ratos alimentados com rações suplementadas com maltitol (GODA et
al., 1998). Os autores observaram que a carga máxima necessária para a
fratura do fêmur, medida através do ensaio de flexão em três pontos, foi 13%
maior nos animais que consumiram o poliol do que a dos animais do grupo
controle. As propriedades mecânicas também foram avaliadas no fêmur de
ratos idosos alimentados com rações suplementadas com 10% de xilitol
(MATTILA et al., 2002). Outro estudo avaliou, em ratos, o efeito do consumo de
difrutose anidrido III, um dissacarídeo obtido a partir da hidrólise da inulina,
associado a exercícios voluntários de corrida, na densidade e na resistência do
fêmur e da tíbia (SHIGA et al., 2003). Os autores observaram que a combinação
do exercício físico com o consumo dos carboidratos fermentáveis aumentou
aditivamente todos os parâmetros estudados.
Tabela 13: Propriedades mecânicas no fêmur de ratos alimentados com rações controle e rações suplementadas com Raftilose e farinha de yacón1
Raftilose Farinha de yacón Determinações2
Controle FOS 5% Controle FOS 5% FOS 7,5%
Comprimento (mm)
Diâmetro (mm)
Carga máxima (N)
Carga no limite elástico (N)
Rigidez (N/mm)
Resiliência (Nmm)
Energia absorvida (Nmm)
30,31 ± 0,67a
2,96 ± 0,17a
64,22 ± 6,02a
51,70 ± 8,43a
79,19 ± 8,14a
16,66 ± 4,98a
45,62 ± 12,66a
30,56 ± 0,57a
2,88 ± 0,21a
72,73 ± 8,94b
62,80 ± 9,98b
83,06 ± 7,54a
20,30 ± 8,26a
51,69 ± 14,89a
31,45 ± 1,24a
3,79 ± 0,43a
67,22 ± 8,34a
56,86 ± 6,35a
95,63 ± 3,24a
15,51 ± 2,92a
57,13 ± 22,42a
31,56 ± 0,39a
3,80 ± 0,20a
76,62 ± 8,84ab
59,85 ± 9,46a
109,73 ± 7,99b
15,97 ± 6,12a
58,88 ± 24,00a
31,26 ± 0,69a
3,58 ± 0,21a
83,36 ± 8,66b
68,40 ± 10,97a
112,76 ± 9,03b
18,08 ± 8,95a
59,04 ± 9,47a 1 As propriedades mecânicas foram avaliadas no fêmur direito; 2 Resultados expressos como média e desvio-padrão, n=8; Para o ensaio Raftilose, o tempo de experimento correspondeu a 23 dias e, para o ensaio Farinha de yacón, a 27 dias; Letras diferentes em uma mesma linha, e em ensaios diferentes, indicam diferenças significativas (p<0,05).
97
5.3.5.2. Densitometria óssea
Para o 1º ensaio, a densidade mineral óssea (DMO) foi avaliada, ex vivo,
através da comparação da densidade do osso (fêmur e tíbia) com a densidade
de uma escala de alumínio, permitindo que a equivalência dos ossos, avaliada
em milímetros de alumínio (mmAl), fosse estabelecida. Além deste método, os
ossos dos animais de ambos os ensaios também foram submetidos à análise da
DMO, através da absorção de dupla energia por raios X (DEXA). De acordo
com as Tabelas 14 e 15, os animais que consumiram FOS, em ambos os
ensaios, apresentaram uma maior DMO em comparação aos que consumiram a
ração controle embora, em nenhuma situação avaliada (tipo de osso, região do
osso analisada ou metodologia utilizada), tenham sido observadas diferenças
estatisticamente significativas (p<0,05).
Tabela 14: Densidade mineral óssea (DMO) nas regiões da metáfise ediáfise no fêmur e na tíbia de ratos alimentados com rações controle esuplementadas com Raftilose1
Determinações Controle FOS 5%
DMO (mmAl) Metáfise
Fêmur Tíbia
1,36 ± 0,06a 1,35 ± 0,07a
1,41 ± 0,07a 1,40 ± 0,08a
Diáfise Fêmur Tíbia
1,11 ± 0,09a 1,07 ± 0,08a
1,17 ± 0,05a 1,12 ± 0,04a
1 Resultados expressos como média e desvio-padrão, n=8; 2 As análises foram realizadas utilizando-se a densitometria óssea radiográfica, de acordo com o item4.3.4.1.1.; O tempo de experimento correspondeu a 23 dias; Letras diferentes em uma mesma linha indicam diferenças significativas (p<0,05).
Os efeitos dos frutanos na densidade e no conteúdo mineral ósseo
também têm sido observados em outros estudos, através da utilização de
diferentes protocolos experimentais (OHTA et al., 2002; SCHOLZ-AHRENS et
al., 2002; ROBERFROID et al., 2002; KRUGER et al., 2003; ZAFAR et al.,
2004). OHTA et al. (1996) verificaram um aumento significativo na DMO nas
regiões proximal e distal do fêmur de animais ovariectomizados, suplementados
com rações contendo 5% de FOS. Utilizando ratos sadios e em crescimento,
KRUGER et al. (2003) observaram um aumento significativo (p<0,05) na DMO
98
no fêmur, por um período de 4 semanas, após a ingestão de inulina (GP>23),
embora tal efeito não tenha sido observado após o consumo de oligofrutose
(GP entre 2 e 8). Em outro estudo, a suplementação da dieta com 5% de FOS e
0,5% de Ca não alterou a estrutura do osso trabecular de ratos
ovariectomizados (SCHOLZ-AHRENS & SCHREZENMEIR, 2002) sendo que,
em ratos sadios e em crescimento alimentados com dietas suplementadas com
5 e 10% de inulina e 0,2; 0,5 ou 1% de Ca, a DMO do corpo total foi alterada
somente após 22 semanas de experimento (ROBERFROID et al., 2002).
Tabela 15: Densidade mineral óssea (DMO) no fêmur e na tíbia de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com Raftilose (A) e farinha de yacón (B)1
Raftilose Farinha de yacón
Determinações2 Controle FOS 5% Controle FOS 5% FOS 7,5% DMO (g/cm2)
Osso total Fêmur Tíbia
0,0810 ± 0,003a 0,0674 ± 0,003a
0,0854 ± 0,005a
0,0685 ± 0,004a
0,0946 ± 0,006a 0,0761 ± 0,002a
0,0994 ± 0,008a 0,0795 ± 0,002a
0,0971 ± 0,008a 0,0767 ± 0,004a
Região proximal Fêmur Tíbia
0,0833 ± 0,005a 0,0738 ± 0,003a
0,0877 ± 0,008a
0,0763 ± 0,005a
0,0984 ± 0,008a 0,0841 ± 0,004a
0,1023 ± 0,009a 0,0894 ± 0,003a
0,1002 ± 0,008a 0,0862 ± 0,006a
Região distal Fêmur Tíbia
0,0897 ± 0,004a 0,0646 ± 0,003a
0,0931 ± 0,004a
0,0661 ± 0,005a
0,1053 ± 0,007a 0,0747 ± 0,005a
0,1122 ± 0,006a 0,0776 ± 0,003a
0,1096 ±0,009a 0,0747 ± 0,003a
Região média Fêmur Tíbia
0,0618 ± 0,004a 0,0691 ± 0,005a
0,0819 ± 0,013a
0,0606 ± 0,004a
0,0777 ± 0,008a 0,0691 ± 0,005a
0,0819 ± 0,013a 0,0690 ± 0,005a
0,0792 ± 0,008a 0,0667 ± 0,006a
1 Resultados expressos como média e desvio-padrão, n=8; 2 As análises foram realizadas utilizando-se o DEXA; A DMO corresponde à relação entre o conteúdo mineral ósseo e a área óssea; Para o ensaio Raftilose, o tempo de experimento correspondeu a 23 dias e, para o ensaio Farinha de yacón, a 27 dias; Letras diferentes em uma mesma linha, e em ensaios diferentes, indicam diferenças significativas (p<0,05).
Os mecanismos envolvidos no aumento da absorção de Ca e o seu
metabolismo no osso, após a suplementação com carboidratos fermentáveis
(em especial, os frutanos) têm sido amplamente discutidos. ZAFAR et al. (2004)
verificaram, em ratos, que o significativo aumento na absorção intestinal de Ca,
nos animais que consumiram os frutanos, diminuiu o turnover ósseo através da
supressão da reabsorção osteoclástica. KRUGER et al. (2003) observaram, em
ratos em crescimento, uma diminuição significativa na excreção urinária de
fragmentos do colágeno tipo I, um marcador bioquímico de reabsorção óssea,
com o consumo de inulina, após 4 semanas de experimento.
99
Desta forma, os efeitos positivos na absorção intestinal, na retenção
mineral e no comportamento mecânico do osso, observados no presente
estudo, devem ser avaliados em um tempo de experimento maior com a
utilização de outros protocolos experimentais (diferentes estágios do
desenvolvimento do animal, diferentes teores de Ca, FOS e outros tipos de FA
na ração, métodos de avaliação da retenção mineral e da arquitetura do osso,
tipo de osso estudado), com a finalidade de verificar a real extensão do efeito
dos FOS e da contribuição de outros componentes da dieta neste efeito.
Os resultados obtidos também devem ser extendidos em (mais) estudos
envolvendo humanos, com o objetivo de confirmar os efeitos observados nos
animais após o consumo dos FOS. Deste modo, a utilização da farinha de
yacón como ingrediente para o desenvolvimento de alimentos funcionais poderá
ser justificada de forma que o seu consumo passe a contribuir para a redução
do risco de doenças ósseas.
100
6. Conclusões O consumo dos FOS estimulou significativamente a absorção intestinal e o
balanço de cálcio, sendo que tal efeito foi menos pronunciado para o Mg;
O aumento no balanço de cálcio foi refletido em uma maior retenção mineral
nos ossos, confirmado pelas análises por espectrofotometria de absorção
atômica;
Foi observado um efeito positivo nas propriedades mecânicas nos fêmures
dos animais que consumiram FOS, em ambos os ensaios, em relação aos
que consumiram a ração controle;
A ingestão da Raftilose provocou uma ligeira, porém significativa, absorção
intestinal de magnésio, o que não foi observado nos animais que
consumiram a farinha de yacón. Por outro lado, o balanço deste mineral foi
positivamente favorecido nos animais que consumiram a farinha de yacón
(7,5% de FOS);
Não foram observadas diferenças significativas no conteúdo de magnésio
nos ossos, entre os grupos experimentais, em ambos os ensaios;
Não foram observadas diferenças significativas na densidade mineral óssea
entre os grupos, em ambos os ensaios, nas condições experimentais do
presente estudo;
O consumo dos FOS provocou um pronunciado aumento na quantidade e
no comprimento das criptas no ceco, evidenciado pelo maior número de
criptas em bifurcação.
101
7. Referências bibliográficas2
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8. Anexos
Anexo 1: Gráfico de controle de qualidade das determinações de Ca total, em base úmida, nas amostras de padrão de referência secundário [rações à base de caseína AIN-93G (REEVES et al., 1993)].
Anexo 2: Gráfico de controle de qualidade das determinações de Ca total, em base seca, nas amostras de padrão de referência secundário [rações à base de caseína AIN-93G (REEVES et al., 1993)].
2500,00
3000,00
3500,00
4000,00
4500,00
5000,00
5500,00
6000,00
0 2 4 6 8 10 12
ensaios
ugC
a/g
média
+1s+2s+3s
-1s
-2s-3s
300035004000450050005500600065007000
0 2 4 6 8 10 12
ensaios
ugC
a/g
média+1s
+2s+3s
-1s
-2s-3s
128
Anexo 3: Gráfico de controle de qualidade das determinações de Mg total, em base úmida, nas amostras de padrão de referência secundário [rações à base de caseína AIN-93G (REEVES et al., 1993)].
Anexo 4: Gráfico de controle de qualidade das determinações de Mg total, em base seca, nas amostras de padrão de referência secundário [rações à base de caseína AIN-93G (REEVES et al., 1993)].
220,00230,00240,00250,00260,00270,00280,00290,00300,00
0 2 4 6 8 10 12 14
ensaios
ugM
g/g
média
+1s
+2s
+3s
-1s
-2s
-3s
240250260270280290300310320330
0 5 10 15ensaios
ugM
g/g
média
+1s
+2s
+3s
-1s
-2s
-3s
129
Anexo 5: Intervalo de linearidade da curva de calibração de Ca, n=16. A curva de calibração foi preparada a partir da solução padrão de Ca, após diluição com HNO3 a 1%, nas concentrações de 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 e 5,0 µg/mL.
Anexo 6: Intervalo de linearidade da curva de calibração de Mg, n=16. A curva de Mg foi preparada a partir da solução padrão de nitrato de Mg, nas concentrações de 0,5; 1,0; 3,0; 5,0; 7,5 e 10,0 µg/mL.
y = 0,045x + 0,0024R2 = 1
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
0,2000
0,2500
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
ug Ca/mL
abs
y = 0,026x + 0,0022R2 = 0,9999
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
0,2000
0,2500
0,3000
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0
ug Mg/mL
abs
130
Anexo 7: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias das variáveis nos grupos do 1º ensaio.
Limite LimiteInferior Superior
pH Controle - Raftilose 1,13 0,69 1,56peso da parede do ceco Raftilose - Controle 0,19 0,12 0,27
peso do conteúdo do ceco Raftilose - Controle 1,31 0,96 1,67
EstimativaDiferençaVariável
Anexo 8: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do teor de umidade nas fezes, por período experimental, no 1º ensaio.
Limite LimiteInferior Superior
1 Raftilose - Controle 12,92 7,29 18,552 Raftilose - Controle 14,92 9,06 20,773 Raftilose - Controle 21,20 17,43 24,98
Diferença EstimativaPeríodo
Anexo 9: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias das variáveis nos grupos do 2º ensaio.
Limite LimiteInferior Superior
5% - Controle 0,11 0,06 0,157,5% - Controle 0,20 0,16 0,25
7,5% - 5% 0,09 0,05 0,145% - Controle 0,73 0,41 1,05
7,5% - Controle 0,95 0,63 1,277,5% - 5% 0,22 -0,10 0,54
Variável Diferença Estimativa
peso da parede do ceco
peso do conteúdo do ceco
131
Anexo 10: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do conteúdo urinário de Ca, por período experimental, no 2º ensaio.
Limite LimiteInferior Superior
Controle - 5% 1,01 -113,15 115,17Controle - 7,5% 10,20 -103,95 124,37
5% - 7,5% 9,20 -104,97 123,36Controle - 5% 1,97 -136,29 140,23
7,5% - Controle 47,33 -90,93 185,607,5% - 5% 49,30 -88,96 187,57
5% - Controle 30,14 -73,02 151,29Controle - 7,5% 130,42 18,26 242,58
5% - 7,5% 169,56 57,40 281,713
EstimativaPeríodo Diferença
2
1
Anexo 11: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do peso seco das fezes, no 2º ensaio.
Limite LimiteInferior Superior
5% - Controle 0,68 0,13 1,237,5% - Controle 1,06 0,51 1,61
7,5% - 5% 0,38 -0,17 0,92
Diferença Estimativa
Anexo 12: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do teor de umidade das fezes, no 2º ensaio.
Limite LimiteInferior Superior
5% - Controle 4,40 2,15 6,657,5% - Controle 7,69 5,44 9,94
7,5% - 5% 3,29 1,04 5,54
Diferença Estimativa
132
Anexo 13: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do teor de Ca e Mg nas fezes, no 2º ensaio.
Limite LimiteInferior Superior
Controle - 5% 30,40 25,42 35,37Controle - 7,5% 34,43 29,46 39,41
7,5% - 5% 4,03 -0,94 9,01Controle - 5% 0,37 0,19 0,54
Controle - 7,5% 0,28 0,10 0,455% - 7,5% 0,08 -0,10 0,26
Cálcio
Magnésio
EstimativaMineral Diferença
Anexo 14: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do balanço de Ca e Mg, no 2º ensaio.
Limite LimiteInferior Superior
5% - Controle 0,19 0,15 0,237,5% - Controle 0,28 0,24 0,32
7,5% - 5% 0,09 0,05 0,135% - Controle 0,06 -0,20 0,13
7,5% - Controle 0,09 0,02 0,177,5% - 5% 0,03 -0,04 0,11
Estimativa
Cálcio
Magnésio
Mineral Diferença
Anexo 15: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da absorção aparente de Ca, no 2º ensaio.
Limite LimiteInferior Superior
5% - Controle 0,18 0,14 0,227,5% - Controle 0,26 0,22 0,30
7,5% - 5% 0,08 0,04 0,12
Diferença Estimativa
133
Anexo 16: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias dos grupos controle e Raftilose.
Variável Diferença Estimativa L. I.* L. S.* Absorção aparente fracional de Mg Controle - Raftilose -1,14* -1,67 -0,61 Absorção aparente absoluta de Mg Controle - Raftilose -11,14* -14,85 -7,43 Absorção aparente fracional de Ca Controle - Raftilose -52,84* -65,44 -40,23Absorção aparente absoluta de Ca Controle - Raftilose -18,82* -24,21 -13,44L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.
Anexo 17: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias dos grupos controle e Raftilose.
Variável Diferença Estimativa L. I.* L. S.* Conteúdo cecal de Mg Controle - Raftilose -0,63* -1,02 -0,24 Concentração cecal de Mg Controle - Raftilose 0,10 -0,01 0,21 Conteúdo cecal de Ca Controle - Raftilose -50,39* -76,49 -24,30 Concentração cecal de Ca Controle - Raftilose 4,03 -0,24 8,30 R/S Controle - Raftilose -0,10 -1,53 1,32 Resíduo (g/cit) Controle - Raftilose -2,1376* -2,6400 -1,6353Resíduo (g/ 100 g) Controle - Raftilose -0,9387* -1,1621 -0,7152Sobrenadante (g/cit) Controle - Raftilose -0,5467 -1,1087 0,0153 Sobrenadante (g/ 100 g) Controle - Raftilose -0,2343 -0,4832 0,0146 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.
Anexo 18: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias das propriedades mecânicas no fêmur dos animais do 1º ensaio.
Variável Diferença Estimativa L. I.* L. S.* Carga máxima Controle - Raftilose -8,51* -16,69 -0,34 Carga máxima elástica Controle - Raftilose -11,10* -21,01 -1,19 Rigidez Controle - Raftilose -3,87 -12,28 4,54 Resiliência Controle - Raftilose -3,64 -10,96 3,67 Energia absorvida Controle - Raftilose -6,07 -20,89 8,75 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.
134
Anexo 19: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do conteúdo cecal de Mg, do 2º ensaio.
Diferença Estimativa L. I.* L. S.* Controle - 5% -0,14 -0,72 0,43
Controle – 7,5% -0,49 -1,07 0,09 5% - 7,5% -0,35 -0,92 0,23
L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.
Anexo 20: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da concentração cecal de Mg, do 2º ensaio.
Diferença Estimativa L. I.* L. S.*
Controle - 5% 0,11 -0,04 0,25 Controle – 7,5% 0,03 -0,12 0,17
5% - 7,5% -0,08 -0,22 0,07 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.
Anexo 21: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do conteúdo cecal de Ca, do 2º ensaio.
Diferença Estimativa L. I.* L. S.*
Controle - 5% -2,41 -16,91 12,10 Controle – 7,5% -5,05 -19,55 9,46
5% - 7,5% -2,64 -17,15 11,87 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.
Anexo 22: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da concentração cecal de Ca, do 2º ensaio.
Diferença Estimativa L. I.* L. S.* Controle - 5% 6,88* 2,08 11,67
Controle – 7,5% 7,08* 2,28 11,87 5% - 7,5% 0,20 -4,60 4,99
L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.
135
Anexo 23: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da relação R/S, do 2º ensaio.
Diferença Estimativa L. I.* L. S.*
Controle - 5% 0,89 -0,19 1,97 Controle – 7,5% 0,99 -0,09 2,07
5% - 7,5% 0,10 -0,98 1,18 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.
Anexo 24: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do peso do resíduo (g/cit), do 2º ensaio.
Diferença Estimativa L. I.* L. S.*
Controle - 5% -0,6207* -1,0522 -0,1893 Controle – 7,5% -0,7487* -1,1801 -0,3172
5% - 7,5% -0,1279 -0,5594 0,3035 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.
Anexo 25: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do peso do resíduo (g/100 g de animal), do 2º ensaio.
Diferença Estimativa L. I.* L. S.*
Controle - 5% -0,3388* -0,5006 -0,1769 Controle – 7,5% -0,4340* -0,5959 -0,2722
5% - 7,5% -0,0953 -0,2571 0,0666 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.
Anexo 26: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do peso do sobrenadante (g/cit), do 2º ensaio.
Diferença Estimativa L. I.* L. S.*
Controle - 5% -0,6981* -1,2132 -0,1829 Controle – 7,5% -0,9014* -1,4166 -0,3862
5% - 7,5% -0,2034 -0,7185 0,3118 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.
136
Anexo 27: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do peso do sobrenadante (g/100 g de animal), do 2º ensaio.
Diferença Estimativa L. I.* L. S.*
Controle - 5% -0,3852* -0,6093 -0,1612 Controle – 7,5% -0,5065* -0,7305 -0,2824
5% - 7,5% -0,1213 -0,3453 0,1028 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.
Anexo 28: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do índice de bifurcação de criptas.
Diferença Estimativa L. I.* L. S.*
Controle - 5% -0,54* -0,94 -0,14 Controle – 7,5% -0,87* -1,27 -0,47
5% - 7,5% -0,34 -0,73 0,06 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.
Anexo 29: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da porcentagem do índice de bifurcação de criptas.
Diferença Estimativa L. I.* L. S.*
Controle - 5% -14,27 -32,66 4,11 Controle – 7,5% -31,20* -49,58 -12,81
5% - 7,5% -16,92 -35,31 1,46 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.
Anexo 30: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da comprimento das criptas.
Diferença Estimativa L. I.* L. S.*
Controle - 5% -0,44 -1,38 0,51 Controle – 7,5% -1,16* -2,10 -0,21
5% - 7,5% -0,72 -1,66 0,23 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.
137
Anexo 31: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do número total de criptas.
Diferença Estimativa L. I.* L. S.*
Controle - 5% -1,00 -2,49 0,49 Controle – 7,5% -3,25* -4,74 -1,76
5% - 7,5% -2,25* -3,74 -0,76 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.
Anexo 32: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da carga máxima medida no fêmur dos animais do 2º ensaio.
Diferença Estimativa L. I.* L. S.*
Controle - 5% -8,2235 -18,8017 2,3547 Controle – 7,5% -15,0349* -25,6131 -4,4566
5% - 7,5% -6,8114 -17,3896 3,7669 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.
Anexo 33: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da carga máxima elástica medida no fêmur dos animais do 2º ensaio.
Diferença Estimativa L. I.* L. S.*
Controle - 5% -1,9426 -13,0448 9,1596 Controle – 7,5% -10,1919 -21,2941 0,9103
5% - 7,5% -8,2493 -19,3515 2,8530 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.
Anexo 34: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da rigidez medida no fêmur dos animais do 2º ensaio.
Diferença Estimativa L. I.* L. S.*
Controle - 5% -12,3383* -21,5692 -3,1073 Controle – 7,5% -15,7849* -25,0158 -6,5540
5% - 7,5% -3,4466 -12,6775 5,7843 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.
138
Anexo 35: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da resiliência medida no fêmur dos animais do 2º ensaio.
Diferença Estimativa L. I.* L. S.*
Controle - 5% -0,26 -8,19 7,66 Controle – 7,5% -2,29 -10,22 5,63
5% - 7,5% -2,02 -9,95 5,90 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.
Anexo 36: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da energia absorvida medida no fêmur dos animais do 2º ensaio.
Diferença Estimativa L. I.* L. S.*
Controle - 5% -1,53 -24,71 21,65 Controle – 7,5% -1,75 -24,93 21,43
5% - 7,5% -0,22 -23,40 22,96 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.