1 principes dimmuno-histo-chimie et dimmunofluorescence : (p. levillain)
TRANSCRIPT
1
Principes d’Immuno-histo-chimie et d’Immunofluorescence :
(P. Levillain)
2
Principes généraux
• Mise en évidence d’un constituant cellulaire ou tissulaire par une réaction antigène anticorps
• On utilise un anticorps connu qui est dirigé contre un antigène que l’on recherche sur la préparation histologique ou cytologique
• Puis on met en évidence la fixation éventuelle de l’anticorps sur la lame par un chromogène (IHC) ou un fluorochrome (IF)
3
1 - LES ANTICORPS
4
Les anticorps primaires(ou spécifiques)
• Ce sont les anticorps utilisés pour mettre en évidence la présence de l’antigène recherché
• Il en existe deux types :– Les AC polyclonaux– Les AC monoclonaux
5
Production d’anticorps par des animaux hyper-immunisés
ANTICORPS POLYCLONAUX
6
Technique des hybridomes
ANTICORPS MONOCLONAUX
7
•Milieu HAT
•Hypoxanthine
•Aminoptérine
•Thymidine
•L’aminoptérine bloque une voie métabolique qui peut être contournée par l’utilisation d’hypoxanthine et de thymidine sauf par les cellules du myélome
8
AnticorpsPolyclonaux :
Inconvénients : spécificité relative et variable selon le lot
Avantages :
1) coût généralement moins élevé
2) plusieurs épitopes reconnus => marquage plus intense
Monoclonaux :
- spécificité définie
- cette spécificité peut entraîner une moindre sensibilité en cas d’altération des épitopes
9
Antigènes masqués par la fixation
• Restauration antigénique– Chauffage des coupes
histologiques (autocuiseur, bain marie, micro-ondes)
– Dans une solution acide ou alcaline selon l’anticorps utilisé
10
2 – LA REVELATION DU COMPLEXE ANTIGENE
- ANTICORPS
Immunofluorescence
11
Immunofluorescence directe
fluorochrome
12
Immunofluorescence à deux étages
fluorochrome
13
Microscope à fluorescence (épi-illumination)
14Différents types de fluororochromes
15
Echantillon
Antigène
ETAPES
Anticorps secondaire
Traceur
2
Anticorps primaire 1
Méthode indirecte: utilisation d'un ligand
Sensibilité++
Fluorochrome
Diff érents types de réactions I CC
Méthode directe: le traceur est fixé sur l'extrémitéC-terminale de la molécule d' immunoglobuline utilisée pour détecter l'antigène
I mmunoréaction simple et rapide
Localisation précise
Sensibilité --Fluorochrome
Immunofluorescence : Résumé
CryocutSérums utilisés Dépôts des sérums sur lames
DIRECTEINDIRECTE
Incubation en chambre humide
16
Immuno-histo-chimie et Immuno-cyto-chimie
17
Anticorps primaire conjugué
péroxydase
18
PAP
19
Autres techniques de révélation
20
Streptavidine biotine
21
Polymères (type Envision)
22
Application (méthode streptavidine-biotine)
• Prélèvements pour histologie standard + IFD en congélation
• Préparation des Coupes
En congélation: 3 à 4 microns, +/- fixation acétone, séchage, rinçage
En paraffine: lames blanches 4 µm puis déparaffinage manuel
bains d’alcool successifs puis démasquage antigénique (auto-cuiseur)
23
Application (méthode streptavidine-biotine)
• Technique de révélation classique « streptavidine-biotine-peroxydase »
ETAPES TEMPS D’INCUBATION
Agent bloquant les enzymes endogènes : H2O2 3%
5 min
Anticorps primaire : 1Variable : de une heure à une
nuit
Réactif secondaire biotinylé (Linker) : 2
15 min
Streptadidine-peroxydaseSubstrat ( DAB) : 3
5min
Hématoxyline 3 min
24
Résumé du protocole
Déparaffinage Démasquage Crayon hydrophobe Anticorps primaire puis AC secondaire biotinylé
Streptavidine-peroxydase
Substrat + DAB Hématoxyline Montage des lames
25
Polymères
• Technique EnVision : amplification par molécule « porteuse »
ETAPES TEMPS D’INCUBATION
Agent bloquant les enzymes endogènes : H2O2
5 min
Anticorps primaire (souris ou lapin)
Variable : jusqu’à une nuit
Polymère marqué à la HRP (peroxydase de raifort)
30 min
Substrat-Chromogène 3,3’-diaminobenzidine (DAB+)
5 min
Contre-coloration à l’Hématoxyline
3 min
26
Résumé polymère (Kit EnVision)
Étape 1 : Blocage des péroxydases endogènes
Étape 2 : Anticorps primaire
Étape 3 : Polymère marqué à la HRP
Étape 4 : Substrat chromogène
Étape 5 : Contre coloration à
l’hématoxyline
Incubation
27
Technique du double marquage
28
Technique de double marquage en microscopie optique
On doit utiliser deux enzymes différentes
29
IM et IHCcomparaison
Difficultés et limites
30
IMMUNO-FLUORESCENCE :
Avantage : faible coût et technique facile et rapide
mais - ne permet pas la conservation des lames
- peu informative sur la morphologie
IMMUNO-HISTOCHIMIE :
- permet d’apprécier la morphologie des lésion
- permet la conservation des lames
IF / IHC
31
Fixation/Congélation
Type d’antigène Tissu fixé Tissu congelé
Ag extra cellulaire
+/- +
Ag membranaire Svt - +
Ag intra cellulaire + +
32
PB = extra cellulaire
33
Vascularite
34
HMB 45Marqueur des mélanosomes (cytoplasmique)
Chromogène : fast red
35
RP et noyaux
36
Difficultés liées à la technique
Fluorescence :
- découplage du fluorochrome (bruit de fond)
(=> diminution bruit de fond par Bleu Evans)
- fluorescence spontanée (f. élastiques, glandes sudorales…)
- fixation sur des protéines d’origine sérique (lupus)
- fixation par des protéines électronégatives (donc tamponner en pH alcalin, bloquer les sites)
- « fading » (conservation au froid et obscurité, lecture rapide, montage en milieu alcalin et glycériné)
37
Difficultés liées à la technique
IHC :
- peroxydases endogènes
- biotines endogènes
- zones de nécrose
- absorption passive (histiocytes)
38
Difficulté non liée à la technique
- un antigène peut posséder un ou plusieurs épitopes en commun avec un autre Ag (réactions croisées)
- CD 10 (cALLA) et cellules du rein
- CD 56 (NCAM) cellules NK et tumeurs neuroendocrines