1. Title : ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

2. Date : 2010년 06월 18일

3. Purpose : 혈청 단백질인 adiponectin을 ELISA의 방법으로 측정

4. 방법 :

Human Total Adiponectin/Acrp30 Immunoassay

(R&D Systems protocol을 사용)

Quantitative sandwich enzyme immunoassay technique

I. Sample collection & storage

1) Serum

① serum separator tube를 이용

② 30분 동안 놔둔다.

③ 15분 동안 1000☓g에서 원심분리

④ 혈청을 분리하여 즉시 분석실험을 하거나

⑤ 따로 옮겨 담아 -20oC에 저장

2) Plasma

① 항응고방지제로서 heparin 또는 EDTA를 이용하여 혈장 cellect.

② 15분 동안 1000☓g에서 원심분리

③ 바로 분석실험을 하거나 따로 옮겨 담아 -20oC에 저장

Ⅱ. Sample preparation

① 혈청과 혈장 samples를 100배 희석한다.

② 100배 희석하는 방법 : 10ul sample + 990ul Calbrator Diluent RD6-39

③ 100-500 배 희석 샘플 사용

Ⅲ. Reagent preparation & Assay procedure

1) Adiponectin Standard : 2ml Calibrator Diluent RD6-39에 녹인다.

2) Adiponectin Standard 용액 준비

① tube 6개 준비. 각각 6개의 tube에 200ul씩 Calibrator Diluent RD6-39 넣는다.

② 그림과 같이 첫 번째 튜브에 Adiponectin Standard 시약을 넣고 잘 섞어준다.

(Adiponectin Standard: 250ng/ml, Calibrator Diluent RD6-39: 0ng/ml)

③ 200 ul 옮기면서 희석시켜 준다.

3) 각 well에 100ul씩 Assay diluent RD1W를 넣는다.

4) 50ul씩 standard, sample (100배 희석한 sample)를 넣고 adhesive strip을 붙이고 실

온에 2시간 동안 incubation.

5) Wash Buffer 만들기: 48ml DW + 2ml wash buffer => total volume=50ml

* 사용할 만큼만 만들어서 사용

6) 각 well에 200ul씩 wash buffer 넣어서 wash, 4번 반복.

* 마지막 4번째 wash는 aspirating or decanting, paper towel 이용하여 털어냄.

7) 각 well에 200ul씩 Adiponectin Conjugate를 넣는다

8) 새로운 adhesive strip을 붙이고 실온에 2시간 동안 incubation.

9) wash : 6번 과정 반복

10) Substrate Solution 만들기: Color Reagents A와 B를 같은 양으로 섞기

* 사용할 만큼만 만들기,

호일로 싼 tube 사용(protect from light),

사용 직전에 만들기,

만들고 15분 내에 사용하기

11) 각 well에 200ul씩 Substrate Solution을 넣는다.

12) 실온에 30분 동안 incubation. ★★★ protect from light

13) 각 well에 50ul씩 Stop Solution을 넣는다.

* 파랑색에서 노랑색으로 바뀐다.

만약 초록색이라면 부드럽게 plate를 tapping한다. 잘 섞일 것이다.

14) Stop Solution을 넣은 후 30분 이내에 450nm에서 microplate reader set를 이용하여

측정한다.