101 · Ähnliches gilt für die spaltung von laktose mittels laktase, fur die modifizierung von...
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BÜRO EURISOTOP Kommission der Europäischen Gemeinschaften
Rue de la Loi, 200 B- 1049 Brüssel / Belgien
1
101 KOMMISS ION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN
Serie:
Monographien - 40
BESTRAHLUNG ••
INFORMATIONSHEFT DES BÜRO
EURISOTOP .'.J 3
J.F. DIEHL
VON ENZYMPRAPARATEN AUGUST 1975
HINWEIS
Die Kommission der Europi!ischen Gemeinschaften und die in ihrem Namen handelnden Personen übernehmen keine Gewähr fllr die Vollständigkeit der in diesem » Informationsheft« enthaltenen Informationen und haften nicht fllr Schäden, die aus der Verwendung der in diesem »Informationsheft« enthaltenen Informationen oder der in ihm bekanntgegebenen technischen Anordnungen, Methoden oder Verfahren entstehen könnten.
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KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN
INFORMATIONSHEFT DES BÜRO
EURISC>TC>P
Serie: Monographien - 40
BESTRAHLUNG .. VON ENZYMPRAPARATEN
J.F. DIEHL
Bundesforschungsanstalt für Ernährung
Karlsruhe
Studie durchgeführt im Rahmen eines Kontrakte s mit der Kommis sion der Europäischen Gemeins chaften
Herausgegeben von der Gruppe •Information und Dokumentation"
des Büro EURISOTOP 1975
101
Vorwort
Die Strahlungskonservierung und Strahlungshygienisierung
von Lebensmitteln gewinnt mehr und mehr an Boden. Wenn der Prozess
auch langsam vor sich geht, es wird nicht ausbleiben, daß eine
Technik dort, wo ihre wirtschaftlichen und gesundheitlichen Vor
teile nicht mehr zu übersehen sind, auch die bisher noch da und
dort bestehenden Voreingenommenheiten gegen jede Art der Strahlungs
anwendung überwinden wird.
Diese Broschüre enhält eine Untersuchung, inwiefern
es, sinnvoll ist, Enzyme mit Strahlung zu behandeln, um dadurch
ihre bakterielle Kontamination zu vermindern, .ohne die enzymati
sche Wirksamkeit dieser Substanzen zu beeinträchtigen. Der Leser
möge die klaren Uberlegungen von Herrn Professor Diehl prüfen
und entscheiden , ob die Enzymbestrahlung nicht in verschiedenen
praktischen Fällen angebracht und technologische Untersuchungen
im Hinblick auf die Einführtlng des Bestrahlungsprozesses in diesen
Bereich von öffentlichem Interesse ist.
Prof.Dr.G. Pröpstl
Leiter des Büro EURISOTOP
- 1 -
Bestrahlung von Enzympräparaten
von J.F. Diehl
Zusammenfassung
Eine Ubersicht zu den Themen: Verwendung von Enzymen in der Lebens
mittelindustrie und in anderen Industriezweigen, mikrobielle Konta
mination technischer Enzympräparate, Keimzahlverminderung durch Be
strahlung, Strahlenwirkung auf Enzyme, Immobilisierung von Enzymen
durch Strahlenpolymerisation. Die Studie schließt mit Vorschlägen
fUr eine vom Büro EURISOTOP zu tragende Gemeinschaftsaktion.
Irradiation of Enzyme Preparations
by J,F, Diehl
Summary
A review of the topica: use of enzymes in the food indus try and in
other industries, microbial contsmination of industrial enzyme pre
parations, reduction of microbial counts by irradiation, radiation
effecta on enzymea, imnobilization of enzymes by radiopolymerization.
The study is concluded with proposala for a joint action program,
to be sponsored by Bureau EURISOTOP.
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Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung. Aufgabe des Berichts
2. Verwendung von Enzymen in der Lebensmittelindustrie
3. Verwendung von Enzymen in sonstigen Industriezweigen
4 . Mikrobielle Kontamination technischer Enzympräparate
5. Keimarme Enzympräparate durch Bestrahlung
6 . Strahlenwirkung auf Enzyme
7. Immobilisierung von Enzymen durch Strahlenpoly
merisation
8. Vorschläge für eine Gemeinschaftsaktion
9. Bibliographie
s. 3
s. 3
s. 8
s. 10
s. 14
s. 20
s . 27
s. 28
s. 30
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1 • Einleitung
Enzympräparate werden in zunehmendem Umfang in der Lebensmittelin
dustrie, in der Pharmaindustrie und in verschiedenen anderen Indu
striezweigen verwendet. Aus den Vereinigten Staaten liegt für das
Jahr 1971 die Angabe vor, daß allein für die Verwendung in der Le
bensmittelindustrie etwa 5000 t mit einem Wert von 40 Millionen ;
produziert wurden (Anonym 1972) . Der Wert der Weltproduktion von
Enzymen im Jahr 1972 wird auf 600 Millionen rtl geschätzt (Uhlig,
1975). Seither ist die Produktion erheblich gewachsen.
Für vie l e Anwendungszwecke werden keimfreie oder mindestens keim
arme Präparate verlangt. Auf keinen Fall dürfen pathogene Mikro
organismen in den Präparaten vorhanden sein . Wegen der Hitzeempfind
l i chkeit der Enzyme kann dieses Ziel nicht durch Hitzesterilisation
erreicht werden; man bedient sich meist der Sterilfiltration, die
jedoch erhebliche technische Schwierigkeiten bietet ,
Es besteht daher großes Interesse an der Entwicklung sonstiger
Methoden zur Gewinnung von mikrobiologisch einwandfreien Enzymprä
paraten. Als besonders aussichtsreich gilt die Anwendung ionisieren
der Strahlen: es komnen Gamma-, Elektronen- und Röntgenstrahlen
infrage .
Aufgabe Ge• vorliegenden Berichts ist es, eine Übersicht der bisher
auf diesem Gebiet geleis teten Forschungsarbeit zu liefern, die Mög
lichkeiten und Probleme der techni schen Anwendung des Bestrahlungs
verfahrens zu diskutie ren und Vors chläge für eine Gemeinschafts
aktion zu unterbreiten.
2. Verwendung von Enzymen in de r Lebensmittelindustrie
Enzymatische Prozesse sind in de r Lebensmitteltechnologie sei t sehr
langer Zeit genutzt worden - lang ehe es den Begriff "Enzym" (oder
"Ferment") gab, Es sei hie r nur an die wichtige Rolle der Mälzerei
bei der Herste llung von Bier und anderen alkoholischen Getränken auf
Ge~reidebasis erinnert: Abbau von Stärke zu Oligosacchariden durch
die Amylase des keimenden Getreidekorns .
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Die erfolgreiche Verwendung gereinigter Enzympräparate bei der
Lebensmittelverarbeitung nahm vor etwa 40 Jahren ihren Anfang,
als Pektinasepräparate zur schnellen Klärung von Apfelsäften in
Gebrauch kamen Ulld die Firma Rohm und Haaa in Philadelphia aus
Schimmelpilzen gewonnene Amylase als Backhilfsmittel auf den Markt
brachte (1936), Seither hat die Enzymtechnologie einen stUrmischen
Aufschwung genommen, der auf folgende vorteilhafte Eigenschaften
von Enzympräparaten zurückzuführen ist (Villadsen, 1972):
1) Da Enzyme Naturprodukte sind und als nicht-toxisch gelten,
bestehen keine gesundheitlichen Bedenken gegen ihre Anwendung;
2)
3)
Enzyme sind sehr spezifisch in ihrer Wirkungsweise;
Sie wirken am besten bei mäßigen Temperaturen und mittleren
pH-Werten, d.h. daß Enzymreaktionen keine drastischen Bedin
gungen erfordern, die kostspielige Apparate bedingen und zu
unerwünschten Nebenreaktionen Anlaß geben wurden;
4) Sie wirken schnell Ulld in geringer Konzentration Ulld die
Reaktionsgeschwindigkeit kann durch Steuerung von Temperatur,
pH- Wert und Enzymmenge kontrolliert werden;
5) Sie lassen sich durch Erhitzen leicht inaktivieren, wenn die
Reaktion weit genug abgelaufen ist,
Eine Ubersicht über die für lebensmitteltechnologische Zwecke in
frage kommenden Enzyme, ihre Herkunft, die Anwendungsmöglichkeiten
und die Wirkungsweise gibt Tab. 1. Vollständigkeit wird fUr diese
Aufzählung nicht beansprucht - die Enzymtechnologie befindet sich
noch im Stadium ständiger Weiterentwicklung, Auf Einzelheiten der
Verfahren kann hier nicht eingegangen werden; aus der großen Zahl
von Veröffentlicht.ngen auf diesem Gebiet seien jedoch beispielhaft
einige Ubersichtsreferate erwähnt.
Uber die Verwendung von Enzymen in der Milch- und Käsetechnologie
haben Kiermeier (1972), Puhan (1973) Ulld Cserhlti und Holl5 (1972,
1974) berichtet. Der Einsatz von Enzymen bei der Herstellt.ng von
Stärkehydrolysaten wurde von De !foord (1972) und Woelk (1973) be
schrieben, Uber die vielseitigen Verwendungsmöglichkeiten von
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Tab, 1 Bei der Lebensmittelverarbeitung verwendete Enzyme
Enzym Herkunft Anwendung
A. Enzyme mikrobieller Herkunft
a-Amylase
Amyloglucosidase
Cellulase
Glucoseisomerase
Glucoseoxidase
Invertase
Katalase
Laktase (•ß-Galaktosidase)
Bacillus subtilis
Bacillus amyloliquefaciens
Aspergillus oryzae
Aapergi llus niger
Rhizopus sp.
A. oryzae
A. niger u,a,
Lactobaci llua brevis
Peni ci lli um notatum
Bacillus megaterium
A. niger
P, notatum
s. cerevisiae
A. niger
Micrococcus lysodeicticua
P. notatum
s. fragilia
A, niger
Gewinnung von Glucosesirup, Brauerei, Gärungsgewerbe (Maisehzusatz), Backhilfsmittel
Gärungsgewerbe (Maisehzusatz), Glucosegewinnung
Glucosegewinnung, Produktion von Obst und GemUsesäften, von leichtverdaulichen Diäterzeugnissen
Süßwaren, Fructosegewinnung für Diabetikerdiä t
Trockeneiherstellung (Entfernung von Glucose), Bierbrauerei, Konserven, Fruchtsäfte (Entfemtmg von Sauerstoff)
Süßwaren, Schokoladeerzeugnisse
Sterilisation von Milch mittels H202, Käserei, Trockeneihera te llUDg
Molkereiprodukte, Speiseeis, Diäterzeugnisse (bei Laktasemange l)
Reaktion
Stärke • Dextrine
Dextrine + Glucose
Cellulose • Glucose
Glucose + Fructose
Glucose + o2 • Gluconsäure + H2o
2
Saccharose +
Glucose + Fructose
2 H2o2 + 2 H
2o + o
2
Lactose • Glucose + Galactose
~ Fortsetzung
Enzym
Lipase
Mikrobielles Lab
Herltunft
A. oryzae
Hefen
Mucor m1 chei
Mucor pusi llus
Irpex lacteus
Endothia parasitica
Bacillus cereus
Naringinase A, niger
Pektinasen A. niger (Pektinme-thylesterase Penicillium sp. + Polygalak-turonase)
Penicilli- Actino111Yces nase candidus
Proteasen
B. subtilis
A. oryzae
A. niger
A. parasiticus
S trep tomyces griseus
B. subtilis
Ribonuclease B. subtilis
Hefen
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Anwendung
Aromave rs tä rltung, Käserei
Käserei (Ersatz von Kälberlab)
Beseitigung von Bi ttergeschmack bei Herstellung von Citrussäften
Obstsaftherstellung (Ausbeuteverbesserung, Saftklärung)
Käserei (falls penici llinhaltige Milch verwendet werden soll)
Klärung von Bier, Zartmachen von Fleisch, Gewinnung von Proteinhydrolysaten (Sojasoase}, Backhilfsmittel
Aromengewiaowig
B. Enzyme tierischer Herkunft
Katalase
Lab
Lipase
Rindsleber Käserei
Labmagen (Kalb) Käserei
Vormagen (Kalb, Käserei Lamm}, Pankreas versch. Tiere
Reaktion
Fettabbau
Casein + Paracasein
Naringin + Naringenin
Pektinabbau
Inaktivierung von Penicillin
Proteinabbau
Mucleins!ureabbau
2 H2o2 + 2 H20 + 02
Casein + Paracasein
Triglyceride + Diund Monoglyceride und Fettsäuren
:I
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1.!2.:...1. Fortsetzung
-Enzym Herkunft Anwendung
Pepsin Schweinemagen Käserei (zusammen mit Lab}, Fisch-mehlherstellung
Trypsin Pankreas von Zartmachen von Rind, Schwein Fleisch, Backhilfs-
mittel, Gewinnung von Proteinhydroly-saten
C. Enzyme pflanzlicher Herkunft
Bromelin
Ficin
Hemicellu-lase
Lipoxidase
Malz (a-Amylase + ß-All!Y lase}
Papain
Ananas
Feigen
Weizenkleie
Sojabohnen
keimende Gerate
Papaya
Zartmachen von Fleisch, Klärung von Bier, Herstellung von Cerealien mit kurzer Kochzeit, Herstellung von Proteinhydrolysaten
Backhilfsmittel, Klärung von Bier, Zartmachen von Fleisch
Backhilfsmittel
Aufhellung von WeiBmehl
Brauerei, Gärungsgewerbe (Maisehzusatz}, Backhilfsmittel
Klärung von Bier, Zartmachen von Fleisch, Herstellung von Cerealien mit kurzer Kochzeit, Herstellung von Proteinhydrolysaten
Reaktion
Proteinabbau
Proteinabbau
Proteinabbau
Proteinabbau
Abbau von llemicel lulose
Oxidation von ungesättigten Fettsäuren, Karotin
Stärke + Dextrine + Maltose
Proteinabbau
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Pektinasen und Cellulasen bei der Obst- und Genilseverarbeitung
haben Grampp (1972), Pilnik (1972) und Heimann (1973) informiert.
Wismer-Pedersen (1972) hat Uber Enzyme in der Fleischwirtschaft
berichtet ind Guilbot (1972) über Enzyme bei der Herstelling von
Backwaren. InfoI111ationen Uber die Verwendung von Enzymen in der
Bierbrauerei findet man bei Holl& et al. (1972). Eine gute Gesamt
übersicht ist unter dem Titel "Food Related Enzymes" in Advances
in Chemistry Series (1974) erschienen. Das Buch "Principles of
Enzymology for the Food Sciences" von Whitacker, 1972, ist eben
falls erwähnenswert.
3. Verwendung von Enz}'!Den in sonstigen Industriezweigen
Bedeutende Mengen von Enzymen werden bei der Waschmittelherstellung
eingesetzt. Obwohl dieser Verwendungszweck bereits seit 1913 bekannt
ist, als das mit Pankreas-Enzym versetzte Waschmittel BURNUS auf den
Markt kam, haben schmutzlösende Enzyme erst in neuerer Zeit auf
breiter Basis in der Waschmittelherstellung Eingang gefunden. Es
handelt sich dabei u.a. um "Subtilisin", eine Gruppe von Proteinasen
von Bacillus subtilus-Stämmen, "Pronase", eine als Nebenprodlkt der
Streptomycinherstellung aus Streptomyces griseus gewonnene Protease,
Kollagenase aus Clostridium-Arten und Keratinase aus Streptomyces
fradiae. Zum Teil werden auch Enzympräparate mit Amylase-Wirkung
eingesetzt. Die Waschmittel enthalten etwa 0,02 - 0,05 % Enzym. Es
wird geschätzt, daß allein in der deutschen Waschmittelindustrie
1974 etwa 1700 t Enzyme verbraucht wurden (Verbeek, 197 5).
Schon 1907 wurden von 0, Röhm, DaI111stadt, Enzympräparate für das
Beizen von Häuten in die Gerberei eingeführt, Durch die enzymatische
Entfernung von Haaren und Haarwurzeln ergibt sich gegenüber älteren
Verfahren eine Qualitätsverbesserung der Häute, bessere Erhaltung
der Wolle (bzw. sonstiger Tierhaare) und eine geringere Belastung
des Abwassers. Verwendet werden Proteasen aus Bakterien (Bacillus
cereus, Bacillus subtilis, Streptanyces griseus) und Schimmelpilzen
<Aspergillus saitoi, Aspergillus oryzae, Aspergillus usamii, Rhizo
pus sp.).
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In der Textilindustrie spielen Enyzme ebenfalls eine Rolle: beim
Weben werden die Kettenfäden mit Stärkelösung getränkt ("Schlich
ten") - nach dem Weben wird mit Bakterienamylase (Bacillus subti
lus u.a.) entschlichtet.
In der chemischen Industrie spielt die Verwendung von Enzymen bei
der Produktion bestin:mter Substanzen eine erhebliche Rolle. Eine
klare Abgrenzung zu den im Kapitel "Lebensmittelindustrie" be
schriebenen Verfahren ist in vielen Fällen nicht möglich. Die Um
wandlung von Stärke in Dextrine und Glucose mit Hilfe von Amylase
und Amyloglucosidase liefert Produkte, die nicht nur in der Lebens
mittelindustrie, sondern für viele technische Zwecke von Interesse
sind. Ähnliches gilt für die Spaltung von Laktose mittels Laktase,
fUr die Modifizierung von Fetten durch Einwirkung von Lipase usw.
Wachsendes Interesse kODIDt der Gewinnung von L-Aminosäuren aus
Racematen zu. Man kann z.B. die racemische Mischung acylieren, die
acylierte L-Aminosäure mit einem geeigneten Enzym selektiv hydro
lysieren und die freie L-Aminosäure von der noch acylierten D-Amino
säure abtrennen (Tosa et al. 1966). Mit Hilfe des Enzyms D-<>xynitri
lase kann man aus Aldehyden \Dld Cyanwasserstoff in hoher Ausbeute
D-o-Hydroxynitrile herstellen, z.B. D-(+)-Mandelonitril aus Benzal
dehyd (Becker und Pfeil 1966). Die Hydroxynitrile dienen als Aus
gangsprodukt für die Synthese von D-o-Hydroxycarbonsäuren, substi
tuierten Äthanolaminen, Acyloinen u.a. Diese wenigen Beispiele mögen
zeigen, das die Enzymtechnologie in der chemischen Industrie ein
großes Potential besitzt.
Auch aus dem Bereich der Pharmaindustrie können nur wenige Beispiele
genannt werden. Das aus Schimmelpilzen gewonnene Benzylpenicillin
wird durch enzymatische Hydrolyse (Penicillinacylase) in 6-Amino
penicillin umgewandelt - ein wichtiges Ausgangsprodukt für die Syn
these modifizierter Penicilline (Heuser et al. 1969). Durch Behand
lung mit Yroteinasen können nichtpeptidische Antibiotica-Präparate
von antigenwirkenden Proteinen befreit werden (Schaltiel et al. 1970).
Eine ganz wichtige Rolle spielt die Enzymtechnologie bei der Steroid
aynthese. Um auch hier nur ein Beispiel zu geben: Mittels
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3-Ketosteroiddehydrogenase aus Arthrobacter simplex können Keto
steroide zu dem medizinisch wichtigen Corticosteroid Triamcinolon
dehydrogeniert werden (Ryu und Lee, 1975) .
Groß ist die Zahl der Arzneimittel, die selbst Enzympräparate
enthalten: Proteinasen, Lipasen, Amylasen , Cellulasen in verdau-
1.mgsfördernden Präparaten, Proteinasen in Mitteln zur Bekämpfung
von Darmparasiten und in Mitteli)'zur Behandlung entzilndlicher
Venenerkrankungen, in kosmetischen Präparaten usw.
Zunehmende Bedeutung haben Enzyme in der klinischen Chemie als
diagnostische Hilfsmittel - sowohl im Schnelltest (z.B. entspre
chend präparierte Papierstreifen zur Bestimmung von Zucker im
Urin) als auch filr die Analyse im Laboratorium (z . B. Bestimmung
von Cholesterin) .
Weiterfilhrende Literatur zum Thema Enzymte chnologi e findet man
in den Ubersichtsartikeln von Wingard (1972} und von Edwards (1972) .
4. Mikrobielle Kontamination technischer Enzympräparate
Bei den aus Mikroorganismen gewonnenen Enzymen ist die Trennung des
Enzyms von diesen Organismen ein wesentlicher Schritt des Verfahrens.
Aber auch bei den aus tierischem Rohmate rial (z.B. Kälbermagen) oder
aus Pflanzenteilen (z.B. Papaya} ex t rahierten Enzymen besteht die
Gefahr, daß aus dem Rohmater ial - einem gilnstigen Nährboden filr das
Wachstum von Mikroorganismen - Keime in das Enzympräparat ge langen.
Soweit es sich um Enzyme für die Herstellung von Lebensmitteln und
Medikamenten handelt, wird selbstverständlich gefordert, daß die
Präparate frei sind von pathogenen Keimen . Aber auch für andere
Zwecke eingesetzte Enzyme müssen hohen hygienischen Anforderungen
genUgen - z.B. verlangen Waschmittelhers teller, daß die von ihnen
eingesetzten Enzyme frei sind von Bacillus anthracis, Salmonellen
und Staphylococcus aureus, und daß sie weniger als 10 Bacillus
cereus-Keime oder Enterobacteriaceae pro g Enzympräparat enthalten
(Wallhäusser 1971). In vielen Fällen spielt nicht nur die Frage des
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Vorhandenseins pathogener Keime eine Rolle, sondern auch die Frage des
Vorhandenseins gesundheitlich harmloser Keime , die jedoch den ra
schen Verderb sowohl des Enzympräparates selbst als auch des mit
dem Enzym versetzten Lebensmittels oder Rohstoffs verursachen kön
nen. Manche technisch angewendete Enzymreaktion verlangt relativ
lange Zeiten (Sttmden oder sogar Tage), während derer das Reaktions
gemisch auf einer Temperatur gehalten wird (35 - 50°), die ideale
Bedingungen filr die Vermehrung der Verderbsflora bietet. Man ist
daher bemliht, möglichst ke imarme Präparate herzustellen. Soweit
dies rechtlich zulässig i st und im Einzelfall sinnvoll, stabili
siert man ferner die Enzympräparate durch chemische Konservierungs
mittel . Aus Abb. 1 geht hervor, daß ein kommerzielles Präparat von
a-Amylase in 8,25 %iger Löstmg innerhalb 3 Tagen 50 % seiner Enzym
aktivitä t verlor. Durch Zusatz von Sorbinsäure/PHB-Ester konnte der
Verlust auf ca. 15 % reduziert werden.
100 t
:0 ~ 90 ~ "{
~ 80 1
70
60
----....... ________ ___ -<>- __ _
----- ........ '""O ········'··'
·•···•··············•·•·····•······················•
so~-------.--------.------=:::::,z; 2, '8 72'
--Lagerzeit-
~ Stabilisierung einer Alpha-Amylase-Lösung (8,25 %ig}
durch -- Sorbinsäure/PHB-Ester 20°, ••••• Sorbin
säure/PHB-Ester 60°, -- ohne Zusatz 20° (Woelk, 1973).
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Da der Stlirlteabbau durch a-Amylase relativ lange Reaktionszeiten
erfordert. spielt der Verlust der a-Amylase durch mikrobiellen
Angriff eine große wirtschaftliche Rolle. Je reiner das eingesetzte
Enzymprilparat ist. desto länger bleibt es wirksam und desto weniger
muß (teueres!) Enz}'lll nachgegeben werden.
Uber mikrobiologische Verunreinigungen von 92 handelsüblichen En
zympräparaten. die teils aus Mikroorganismen • teils aus pflanz
lichen oder tierischen Quellen gewonnen worden waren. haben Lott
und Frank (1973) berichtet. Salmonellen. Pseudomonas und Staphylo
kokken wurden nicht gefunden.
Bei 18 Amylasen schwankte die aerobe Gesamtkeimzahl zwischen 10
und 2.4 x 107; Enterobakte~ceen waren l 2inal nicht nachweisbar und
erreichten in einem Fall einen Maxiinalwert von 9,5 x 103/g; Clo
stridien fehlten gänzlich; 5 Präparate waren frei von Schimmelpil-4 zen. bei den übrigen wurden bis zu s.6 x 10 gefunden.
Von 32 Pektinasen waren 2 keimfrei - ein Flüssigpräparat und eine
pulverförmige Zubereitung - . Die Zahl der aeroben Bakterien erreichte
in 4 Fällen 105; Enterobakteriaceen fehlten. Clostridien konnten 25
mal nicht nachgewiesen werden und überschritten bei den übrigen 30/g
nicht. Schimmelpilze fehlten nur in 3 Präparaten - außer den beiden 4 keimfreien -. bei den restlichen stieg die Zahl bis zu 3 x 10 /g.
Von 27 Proteasen waren 2 keimfrei. 5mal waren mehr als 107 /g aerobe
Bakterien vorhanden und 5 Präparate hatten bis au 21 1 x 103/g l!fttero
bakteriaceen. Clostridien traten in dieser Gruppe gehäuft auf und
zwar llmal mit 2.4 x 103/g als Höchstwert; Schimmelpilze fehlten nur
7mal und wurden in einem Falle bis zu 105/g gefunden.
3 Invertasen. 5 Cellulasen, 2 Lipasen. 3 Lab-Proben und eine Urease
lagen bezüglich der genannten Keimgruppen vollkommen im Rahmen der
Enzyme. die in größerer Zahl geprüft worden waren.
Die Wlufiglteitsverteilung der aeroben Bakterien und der Schimmel
pilze bei allen Proben geht aus den Abb. 2 und 3 he rvor.
20
c:: 15 ... -<:>
~ -- 10 -c:: ~ c:: "' 5
ff
4
- 13 -
19
17
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8 7
01 m ~ ~ ~ ~ m m ~ < 10 10' 102 101 to 4 105 106 101
aerobe Gtsamtktime/g
~ Häufigkeitsverteilung der aeroben Ges amtke imzahl von
92 Enzymproben (Lott und Frank 1973) .
25
~ 20
~ l 15
10
5
16
10
16
17
10
, ol VA V4 1'13 1?,1 VA 1.!!
w' w' w1 wf w' w1 w' Schimmelpllu/g
< 10
~ Häufigkeitsverteilung der Schi mme lpilzzahl von 90
Enzymproben (Lo t t und Frank 1973) .
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Uber den Keimgehalt h1111delsü1>Ucher Enzympräparate. die ausschließ
lich aus Mikroorgmiamen gewonnen wurden. gibt Tab. 2 Auskunft.
Deanach sind keimarme Produkte mehr die Ausnahme als die Regel.
!!l!.!._l Keimgehalt einiger mikrobieller Enzyme (Wallhäusser 1971)
Enzym
Hemicellulasen
Proteasen
Lipasen
Waschmittel-Enzyme (Proteasen. 8 Hera te ller)
Zahl der
Proben <100
42 2
25 2
5 -24 -
Gessmtkeimzahl/g
100-1000 104-105-105.:10° >IOo >!07
4 10 22 4
7 3 13
- 1 1 3
- - 5 10 9
In der Arbeit. aus der diese Zahlen entnOlllllen wurden. hat Wallhäusser
(1971) die Möglichkeit der Bestrahlung erwähnt. Er bezeichnet die Be-6 9 strahlung von Rohenzymen (mit 10 - 10 Keimen/g) als unwirtschaH-
lich, da die erforderliche hohe Strahlendosis von etwa 2.5 Krad Akti
vitätsverluste bei den Enzymen verursacht. Er empfiehlt daher die
mechanische Vorreinigung (Zentrifugieren. Filtrieren). um die Kultur
lösung auf 104 - 105 Keime/ml zu bringen. Bei Bestrahlung dieses Pro
duktes mit Dosen bis zu 1 Krad werden ohne nennenswerte Enzymverluste
Keimzahlen unter 102 Keime/g - also keimarme Präparate - erhalten.
Das folgende Kapitel soll hierzu nähere Auskünfte geben.
5. Keimarme Enzympräparate durch Bestrahlung
Die Anforderungen der Verwender von Enzympräparaten hinsichtlich der
mikrobiologischen Qualität dieser Präparate werden i11111er höher. zu
gleich stellen nationale und internationale Geaundheitsbehörden i11111er
strengere Anforderungen an die hygienische Beschaffenheit aller Le
bensmittel-Zueatzetoffe. Wegen der Hitzeempfindlichkeit der Enzyme
und den begrenzten Möglichkeiten zur Anwendung der chemischen Ent
keimung bleibt für die Sterilisierung von Enzympräparaten praktisch
nur die Möglichkeit der Sterilfiltration. Diese bereitet bei den
:!:
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viskosen Flüasigkeiten. um die es sich bei den Kulturlösungen han
delt. erhebliche Schwierigkeiten. Außerdem besteht die Gefahr der
Reinfektion bei der Abfüllung von flüssigen oder beim Abpacken von
getrockneten Präparaten.
Auf dem medizinischen Sektor hat sich die Bestrahlung als Sterili
sationsmethode außerordentlich gut bewährt. Chirurgisches Nahtma
terial und eine Vielzahl von medizinischen Artikeln. wie Injektions
spritzen aus Plastik. Kanülen. Schläuche usw. werden seit Jahren
bevorzugt durch Bestrahlung sterilisiert. Gegenüber anderen Methoden
hat die Bestrahlung vor allem den Vorteil• daß in der verschlossenen
Packung sterilisiert und so eine Reinfektion vermieden werden kann.
Vom produktionstechnischen Standpunkt aus ist es vorteilhaft. daß
dieses Verfahren nicht chargenweise. sondern kontinuierlich arbeitet.
In die Herstellung technischer Enzyme hingegen hat die Bestrahlung
bisher nur in begrenztem Umfang Eingang gefunden. In den Vereinigten
Staaten werden seit Jahren Waschmittel-Enzyme durch Bestrahlung
hygienisiert. Im Jahre 1968 wurden in den USA ca. 1000 t Enzyme für
die Waschmittelherstellung gebraucht und mindestens die Hälfte da
von durch Bestrahlung s terilisert (Anonym. 1969). Der Anwendung des
Verfahrens bei denjenigen Enzymen. die in der Lebensmittel- und
Pharmaindustrie zum Einsatz kommen sollen, stehen jedoch die in den
Lebensmittel- und Arzneigesetzen verankerten Bestrahlungsverbote
entgegen. Theoretisch könnten zwar von den Gesundheitsbehörden ent
sprechende Ausnahmegenehmigungen erteilt werden. Die Industrie scheut
jedoch vermutlich den Aufwand. der erforderlich wäre. um solche Ge
nehmigungen zu erhalten. tlber wissenschaftliche Untersuchungen. in
denen die Möglichkeiten der Hygienisierung von Enzymen durch Bestrah
lung geprüft wurden. soll im folgenden berichtet werden.
Vas hat anläßlich des Internationalen Kongresses Uber Lebensmittel
wissenschaft und Technologie in London 1962 erstmalig über die mikro
biologische Stabilisierung von Pektinenzyqiräparaten referiert. Die
Versuche wurden mit pektinolytischen Konzentraten aus Aapergillus
und Penicillium-Stämmen und mit dem Handelspräparat "Polizim" durch
geführt. Mit einer Strahlendosis von 1 Mrad wurden sowohl bei flUs
aigen wie bei trockenen Präparaten Keimzahlreduktionen auf 10-4 bis
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10-6 des Ausgangswertes erzielt. Die Aktivitätsverluste lagen bei
2 - 18 %. Bestrahlte Proben waren noch nach !-jähriger Aufbewah
rung unverändert, unbestrahlte waren nach 6 Tagen verdorben. Bei
der Bestrahlung hochgereinigter Enzymlösungen ergeben sich höhere
Aktivitätsverluste als bei der Bestrahlung des Handelspräparats
(Vas und Proszt, 1965),
Die Bestrahlung von Cellulasepräparaten ergab eine sehr hohe Strah
lenresistenz bei Bestrahlung des trockenen Enzymes. Um eine 63 %ige
Inaktivierung zu erzielen (D37), war eine Dosis von 25,3 Mrad er
forderlich. Bei Bestrahlung einer 14 mg Enzym/ml enthaltenden Lösung
war die D37 2,7 Mrad (Vas, 1969) , Angeben über die mikrobiologische
Kontamination der Cellulasepräparate tmd über die antimikrobielle
Wirksamkeit der Bestrahlung enthält diese Arbeit nicht.
Die Untersuchung von Amylasepräparaten (aus Aspergillus-, Rhizopus
und Bacillus-Arten und aus Malz), die mit Strahlendosen von etwa
J,O Mrad bestrahlt worden waren, ergab eine Keimzahlreduktion um
etwa 4 Zehnerpotenzen (vgl. Abb, 4). Von 10 Präparaten bilßten 7
durch die Bestrahlung mit dieser Dosis weniger als 10 % der Aktivi
tät ein, 2 etwa 20 % und eine etwa 30 % (Kawashima et al., 1973).
Die Abnahme der mikrobiellen Kontamination von Proteasen (aus Asper
gillus-, Rhizopus-, Bacillus-Arten und aus Schweinepankreas) mit
zunehmender Strahlendosis geht aus Abb , 5 hervor. Von 9 untersuchten
Proben verloren 7 bei Anwendung einer Dosis von 0,75 - 1 Mrad weniger
als 5 % ihrer Aktivität, bei den beiden anderen lag der Verlust bei
5 - 20 % (Kawashima et al., 1974).
Tschechische Autoren beobachteten nach Bestrahlung von Labpräparaten,
die teils aus Bacillus subtilis-Kulturen, teils aus Kälber-, Ziegen
oder Schweinemagen gewonnen worden waren, Aktivitäts verluste zwischen
0 und 60 % bei Anwendung einer Dosis von 4 Mrad, Wurde mit der Dosis
1 Mrad bestrahlt, so lagen die Verluste maximal bei 15 %. Bei einem
Präparat wurde durch die Bestrahlung eine erheb liehe Zunahme der En
zymaktivität verursacht (Masek et al., 1971),
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- 17 -
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~ Abnahme des Keimgehalts verschiedener Amylasepräparate
durch Bestrahlung. Bestrahlungstemperatur o° C,
(Kawashima et al., 1973)
10°
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Dosis [ Mrad 1
Abb. 5 Abnahme des Keimgehalts verschiedener Proteasepräparate
durch Bestrahlung. Bestrahlungstemperatur o° C.
(Kawashima et al., 1974)
- 18 -
Ein Labpräparat polnischer Produktion enthielt vor der Bestrahlung
20000 Keime/g wd wurde durch Bestrahlwg mit der Dosis 1 Mrad keim
frei. Ein Aktivitätsverlust trat dabei nicht auf (Bachman et al.,
1969). Wurde das Enzym vor der Bestrahlung mittels Sephadex Gel G-75
gereinigt, so verursachte die Dosis von 1 Mrad einen Aktivi tätsver
lust von 30 % (Bachman wd Borkowska, 1972).
Im hiesigen Institut wurden Untersuchwgen an Handelspräparaten von
Pektinase, Bakterienprotease, Pilzprotease und Pilz-a-Amylase durch
gefUhrt (MUnzner und Delincee, 1975). Einige Ergebnisse der mikro
biologischen Prüfwg gehen aus Tab. 3 hervor. Die Bestiamung der
Enzymaktivitäten ergab nach Bestrahlung mit der Dosis 1 Mrad Ver
luste, die bei 0 bis 10 % lagen.
6. Strahlenwirkung auf Enzyme
Aus den in voi:hergehenden Kapiteln geschilderten Untersuchungen geht
hervor, daß die Gewinnung keimarmer oder "praktisch steriler" Enzym
präparate ohne nennenswerte Beeinträchtigung der Enzym-Aktivität mög
lich ist. Unter ungUnstigen Bedingungen kann jedoch durch die Be
strahlung ein nicht unerheblicher Aktivitätsverlust eintreten. Es
gilt also, die Bedingungen festzulegen, bei denen ein minimaler Akti
vitätsverlust eintritt. Es interessiert femer die Frage, ob durch
die Bestrahlung die Enzymspezifität verändert wird UDd ob sich son
stige Eigenschaften der Enzyme (Hitzeempfindlichkeit, pH-<>ptimwn usw,)
verändern. Hierauf soll im folgenden näher eingegangen werden.
Die durch den G-Wert (Zahl der pro 100 eV absorbierter Strahlenener
gie zerstörten MolekUle) ausgedrückte Strahlenwirkwg ist recht un
terschiedlich, je nachdem, ob das Enzym in trockenem Zustand oder in
wässriger Lösung bestrahlt wird. Für trockene Enzyme liegt der G-Wert
bei 1 - 3, falls in sauerstoffreier Atmosphäre bei Raumtemperatur be
strahlt wird. Die in Tab, 4 wiedergegebene Zusmmnenstellung von G
Werten, die an verdünnten Lösungen besti111Dt wurden, zeigt bei den
meisten Enzymen sehr •viel niedrigere G-Werte (Sanner et al., 1974).
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- 20 - - 21 -
..., = o 0 o o .!!!?.:....i Strahlenempfindlichkeit von in verdünnter Löaung in ... - - - -S! 1 1 1 ' Gegenwart von Luft beatrahlten Enzymen (Sanner et al., 1974) ~ V V V V
..., Enzyme -G-Wert
= 8 g .w ' - 1 - • • • • Papain 1,2 0 V V
~ DNase I o,7
..., "' "' "' ~ Chymotrypsin o,5 u1• oo oo oo oo 0 .:: IC IC w IC - - - - RNaae 0,5 ,.... i.n ,.... N i.n
"" 8 .,; ""• ..; .: v v v v Milchsäuredehydrogenaae 0,5 "' Isoci tratdehydrogenase 0,5 ..., ... "" ... "' = 0 2 2 2 8 8 8 8 DNase II 0,4 .W ctf 1C IC 1C - - - -
8 • '°.. -. -. v v v v Pectylmethylesterase 0,4 ,..._ M -.:t ,.._
"" ~ pusillus Protease 0,4 . - - - - -"' l "'o ~o "'o ,...o "'o "'o "'o "'o R.ennin o, 4
~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ Enolase o, 3 0
..; .; ~ .; .,; .,; ..; - Glutamatdehydrogena.se o, 3
~ DNA-abhängige RNA Polymerase 0,2
!j Trypsin 0, 14 1 1 1 1 1 1 1 g Aldolaae 0, 14
Phosphorylaae b 0, 19
~ o o Amylase 0,08 M - -
,.. 1 1 1 1 1 1
Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase 0,07 0 V V
u 1 ~ Phoaphofructokinase o,06 ~ ~ g 8 2 ~ 2 2 2 Alcoboldehydrogena.se o,06
.w - - " 1 Aapartokinase-Homoserindebydrogenase 0,02 8 V V V ~· V V V (Kinaae Aktivität)
"' Fructoae-1,6-diphosphatase 0,02 ..., "' "' ~ ~ o o g 2 g 8 8 2 Lysozym 0,02 ,>ol IC IC - IC - - -
": o. V "".. V V V V Urease 0,015 52 "' "' "' <1i Aspartattranscarbamylaae 0,010
..., ~o ~0 ~0 "'0 "'o "'o "'o ~0 Aapartokinase-Homoserindehydrogenaae 0,006 = 'H 'M 'M 'H " )C ~ "H C:O (Dehydrogenase Aktivität)
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- 22 -
Die höhere Strahlenresiatenz des trockenen Enzyms Ulld die geringere
Strahlenresistenz, je verdUnnter die bestrahlte Enzymlösung ist,
zeigen die Abbild11Dgen 6 UDd 7 am Beispiel von Pektinase und Cellu
lue (Vas, 1969). Man muß sich jedoch darüber im klaren sein, daß
zwar der Anteil der Enzymmoleküle, die durch eine bestimmte Dosis
zerstört wurden, in Lösung höher ist als im trockenen Enzym und in
verdUnnter Lös11Dg höher als in konzentrierter, daß jedoch die abso
lute Zahl der zerstörten Moleküle mit zunehmender Konzentration der
Lösung bzw. bei Bestrahlung von Festsubstanz statt von Lösung zu
nimmt. Sanner und Mitarbeiter (1974) haben dies mit folgendem Bei
spiel erläutert: Angenommen ein Enzym mit Molekulargewicht 25000
werde in Lösung mit G • 0,2 und im trockenen Zustand mit G • 2,0
inaktiviert. Wenn 1 ml einer 2 x I0-5 M-Lösung bestrahlt wird, ist
die D37 60 krad. Diese Dosis zerstört 7,5 x 1015 Moleküle. Falls
1 g des Enzyms der gleichen Dosis in trockenem Zustand ausgesetzt
wird, werden IOmal soviel Enzymmoleküle zerstört. Da jedoch 1 g
trockenes Enzym 2,4 x 1019 Moleküle enthält, stellen die zerstörten
7,5 x 1016 Moleküle nur 0,3 % der vorhandenen dar - ein Anteil, der
110 gertng ist, daß man ihn analytisch kaum wird nachweisen können.
Die Tatsache, daß unterschiedliche Enzyme bei Bestrahlung in glei
cher Konzentration eine sehr unterschiedliche Strahlenresistenz
zeigen können, ist auf die Verschiedenartigkeit der Molekülstruktur
zurückzuführen. Enthält das aktive Zentrum eines Moleküls besonders
strahlene~findliche (z.B. schwefelhaltige) Aminosäuren, so wird es
durch Bestrahlung besonders leicht inaktiviert. Die Ursache für die
hohe Strahlenempfindlichkeit des Papains z.B. (G • 1,2, siehe Tab . 4)
ist darin zu sehen, daß es eine für die Enzymaktivität wesentliche
SR-Gruppe enthält, während z.B. im Molekül der Glyceraldehyd-3-phos
phatdehydrogenase (G • 0,07) 3 - 4 SH-Gruppen zerstört werden müssen,
ehe die Enzymaktivität verloren geht (Lange, Pihl, Eldjarn, 1959;
Pihl 11Dd Sanner, 1963).
llber die Strahlenempfindlichkeit der einzelnen Aminosäuren im Mole
kUlverband der Enzyme, über daa Ausmaß der strahleninduzierten Pep
tidapaltung und Aggregatbildung (Quervernetzung zwischen Enzymmole
kUlen) liegt eine sehr umfangreiche Literatur vor, die hier nicht
im einzelnen zitiert werden kann.
- 23 -
2,0 A
1,5
1,0
o.s~\ \z4.oo 8.20
1 1 0 5 10 15 20
Dosis [MradJ
~ Strahlenwirkung auf trockene Pektinase und auf Pektinase
lösungen der Konzentration 24,80 und 8,20 mg/ml (Vas, 1969).
A • Aktivität
A
2.0
0,5 L 0 10 20 30 40 50
Dosis [Mr ad]
~ Strahlenwirkllllg auf feste Cellulase und auf Cellulase
lös11Dgen der Konzentration 14,00 und 3,61 mg/ml (Vas, 1969),
A • Aktivität
- 24 -
Eine für die Praxis der Enzymbestrahlmg aehr wichtige Festatell1111g
ist die Zunahn der Strahleneq>findlichkeit mit zunehmender Rein
heit der Enzympräparate. Die in der Literatur zu findenden G-Werte
wurden an hochgereinigten Präparaten ermittelt, während es sich bei
den z.B. in der Lebensmittelindustrie verwendeten Präparaten um Ex
trakte von mikrobiellen Kulturen, Tierorganen oder Pflanzenmaterial
handelt, die meist aus einer Mischung mehrerer Enzyme bestehen und
einen erheblichen Anteil enzymatisch nicht aktiven Materials ent
halten. In Fällen, in denen hochgereinigte Enzympräparate mit einem
Minimum an Aktivitätsverlust bestrahlt werden sollen, wäre an den
Zusatz von Schutzsubstanzen zu denken, deren Gegenwart bei der Ver
wendung des Enzyms nicht stört.
Infrage kommt z.B. das Dipeptid Glycylglycin . Seine mit zunehmender
Konzentration zunehmende Schutzwirkung auf Trypsin geht aus Abb. 8
hervor( Sann er, Pihl ),Die Strahlenschutzwirkung von Leucylglycin und
von verschiedenen Kohlenhydraten auf D-Aminosäureoxidase hat Dale
{1942) beschrieben. Katalase wird durch Fumarsäure, Cystein, Cystin
300
--;:; 250 2! ~ c:
iLi 200
"' .::: :§ ~ 150
s;; 0
100.
00 1 2 3 4 Protektor !10-1MJ
5
M?.!!.:._! Schutzeffekt zunehmender Konzentrationen von Glycylglycin
auf die Strahleneq>findlichkeit vonTrypsin (Sanner u.Pihl, 1969)
- 25 -
1111d Glutathion geschlitzt (Dale und Russell, 1956). Bei Untersuchun
gen Uber die Schutzwirkung der D- Isoascorbinsäure auf Pepsin fanden
Procter und Goldblith (1952), daß die Dosis 500 krad in reiner Pep
sinlösung 80 % Inaktivierung verursachte . Waren O,I mg Ascorbin
säure/ml zugegen, so gingen 63 % der Pepsinaktivität verloren, bei
o, 25 mg/ml noch 42 %, bei 1 mg/ml nur noch 18 %.
Besaiders im Hinblick auf die im nächsten Kapitel zu beschreibende
Verwendung inmobilisierter Enzyme ist die Feststellung wichtig, daß
auch durch Adsorption an unlöslichem Trägermaterial eine Schutzwir
kung erreicht werden kann. So fanden Fletcher und Okada (1955), daß
eine Strahlendosis, die bei reiner Lösung von Desoxyribonuclease zu
vollständiger Inaktivierung fUhrt, wirkungslos bleibt, wenn das En
zym an einer ausreichenden Menge Cellulose absorbiert ist.
Wichtig ist femer der Einfluß der Temperatur bei der Bestrahlung
auf die Erhaltung der Enzymaktivität. Da die Anwendung tiefer Tem
peraturen eine geringere Schutzwirkung auf Mikroorganismen ausUbt
als auf die Enzyme (Sanner et al., 1974), ist in denjenigen Fällen,
in denen die Bestrahlung eines Enzympräparates bei Raumtemperatur
einen nennenswerten Anteil der Aktivität zerstört, an die Bestrah
lung bei Temperaturen unter dem Gefrierpunkt zu denken .
Neben Verlusten an Enzymaktivität interessiert auch die Frage, ob
durch die Bestrahlung Veränderungen ausgelöst werden, die sich z.B.
auf die EnzymspezUität auswirken. Bei Papain (Pihl und Sanner, 1963)
und bei Protease aus Mucor pusillus (Kov5cs-Proszt und Sanner, 1973)
wi rd die Enzymspezifität durch Bestrahlung nicht ve rändert .
Die Angaben in Tab. 1 zeigen, daß die Kinaseaktivität der Aaparto
kinase- Homoserindehydrogenase (-G • 0,02) mit etwa 3mal höherem G
·wert inaktiviert wird als die Dehydrogenaseaktivität (-G • 0,006).
Die Calciumabhängigkeit der Pektinmethylesterase wird durch Bestrah
l ung verändert: Sanner et al. (1972) fanden im unbestrahlten Enzym
maximale Aktivität bei e iner CaC12-Konzentration von ca. 25 m Mol/l,
in dem mit 100 k rad bestrahlten Enzym dagegen bei ca. 6 m Mol/l.
Sanner e t al. (1974) haben darauf hingewiesen, daß derartige Wirkun
ge n der Bestrahlung praktisch genutzt we rden könnten. Da Rohextrakte
~ 60
Ii :~ 40 .:g E >. N
~ 20
10
50
- 26 -
20 40 60 so 100 Erhitzungszeit [min l
~ Inaktivierung von Mucor pusillus-Proteaae durch Erhitzen
auf s2.s° C, Du Enzym war entweder unbestrshlt ("Kontrolle"}
oder mit einer Dosis bestrahlt. bei der noch 62 % bzw, 32 %
der Enzymaktivität vor dem Erhitzen erhalten blieben,
(Kovlcs-Proszt und Sanner. 1973}
aus mikrobiellen Kulturen i11111er ein Gemisch verschiedener Enzyme ent
halten. könnten z,B, unerwUnschte Enzyme gezielt inaktiviert werden;
oder wenn Pektinmetbylesteraae bei beaondera niedriger Ca-Konzentra
tion wi:dtsam sein soll. könnte dies durch Bestrahlung erreicht werden ,
Wichtig ist in diesem Zusammenhang auch. daß in Gegenwart von Substrat
die Strahlenresis tenz eines Enzyms selektiv erhöht werden k ann. z , B,
Fructose-1.6-dipboapbataae in Gegenwart von Fructoae-1.6-dipbospbat
{Little et al, • 1969} oder Aapartat Transcarbamylase in Gegenwart von
Ca rbamylphoapbat {Kleppe und Spaeren. 1967},
Wiederholt sind Nacheffekte ("after effects"} in bestuhlten -Enzymen
beachrieben worden• d,h, Veränderungen, die erst nach längerer Lage
rung auftraten oder sich beim Erhitzen des Enzyms beme:dtbar machen ,
Eine weitere AbnaluPe der Aktivität bei der Aufbewahrung ht z.B.
- 27 -
bei trocken beatrahlten Amylaaepräparaten beobachtet worden (Kawa
shima et ai •• 1973}, Bei bestrahlter Meerrettich-Peroxidase wurden
latente Schäden durch Behandlung mit denaturierenden Reagenzien
O>elincle und Radola. 1974} oder durch Erhitzen festgestellt (De
lincle et al •• 1973), Die erhöhte Hitzeempfindlichkeit von bestrahl
ter Mucor pusillus-Proteaae geht aus Abb, 9 hervor, Ähnliche Fest
stellungen wurden bei Invertase (Bra81D8. 1963; Pauly und Eggert.
1968} und Pektinmetbylesteraae (Delincle. 1970} gemacht,
Zusa111111mfaasend ist zu bemerken. daß es bei einer praktischen An
wendung der Bestrahlung zur Entkeimung von Enzyqiräparaten in den
meisten Fällen nicht genUgen wird festzustellen. dall das Enzym in
seiner Aktivität nicht (oder um soundsoviel %} beeinträchtigt wurde,
Man wird auch klären mUsaen, ob Nacheffekte auftreten und ob die
Enzymspezifi tll.t und sonstige Eigenschaften verändert wurden,
7, Immobilisierung von Enzymen durch Strahlenpolymeriaation
Die Möglichkeiten der in den Kapite ln 2 und 3 beschriebenen techni
schen Nutzung von Enzympräparaten haben sich durch die Entwicklung
von ttägergebundenen (immobilisierten} Enzympräparaten enorm gestei
gert, Die Enzyme können in dieser Form in kontinuierlichen Prozessen.
z,B, in Säulen. eingesetzt und mehrmals wiederverwendet werden. In
vielen Fällen ist die industrielle Nutzung der Enzyme dadurch erst
wirtschaftlich interessant geworden, Enzyme können auf folgende Weise
immobilisiert werden {Manecke. 1974}:
durch Adsorption auf Oberflächen.
durch Einschluß in vernetzte Gele,
durch Einkapselung in Mikrokapseln.
durch kovalente Bindung an polymere Träger,
Die Methode des Einachluaaes in vernetzte Gele bat den Vortei l • dall
aie keine speziellen funktionellen Gruppen am EnzymmolekUl erfordert
und: •uch mit ungereinigtem Enzym. ja sogar mit dem Kulturmedium
durchgeführt werden kann, Nschteilig war bhher die Notwendigkeit
des Zusatzes von die Vernetzungsreaktionen katalysierenden Subatan
zen. die unter Umständen zur Inaktivierung des Enzymes führen.
-28 -
Einer kürzlich erschienenen Arbeit japanischer Autoren. in der vou
der erfolgreichen Herstellung strahlenpolymeriaierter Enzymgele
berichtet wird. kommt daher besonderes lntere1Se zu (Kawashima und
Umeda. 1974). Glucoseoxidaae. Invertase. D-Aminosäureoxidase,
Aminoacylase. a- und 8-Amylase. Glucoamylaae. alkalische und neu
trale Protease wurden durch aerobische Strahlenpolymerisatiou von
Acrylamid immobilisiert. Die verwendete Strahlendosis lag meist
bei 50 krad. Die Autoren nennen folgende Vorteile des Verfahrens:
Keine Enzyminaktivierung durch chemische Katalysatoren;
Gefrorene Lösungen können polymerisiert werden - keine
Inaktivierung durch Polymerisationswärme;
Schwammige und texturierte immobilisierte Enzympräparate
mit groBer Oberfläche können ohne Zusätze von Trägermaterial
in Form von Filmen, Membranen. Beuteln oder Schläuchen ber
aeeC.l lt: werden;
Die Immobilisierung erfolgt leicht und schnell (4 - 5 min.),
In der Diskussion Uber Möglichkeiten der Bestrahlung von Enzymen
sollte das Thema Strahlenpolymerisation auf alle Fälle mitberück
sichtigt werden.
8. Vorschläge fUr eine Gemeinschaftsaktion
Es wird vorgeschlagen, daB durch das Büro EURISOTOP folgende Arbeits
tagungen in Brüssel organisiert werden:
I. Eine Zusammenkunft von Vertretern der Industrie mit Vertretern
der Forschung, in der klargestellt werden soll. wie stark das
Interease der enzymherstellenden und der enzymverwendenden In
dustrie am Bestrahl1111gsverfahren ist und bei welchen Enzymen
besonderes Interesse besteht.
(Erläuterung: es ist anzunehmen, daB hinsichtlich einiger Enzyme ein
sehr viel stärkeres Interesse besteht als hinsichtlich anderer. Bei
den Amylasepräparaten z.B., die bei fUr mikrobielles Wachstum idealen
- 29 -
Temperaturen tagelang in groBen Reaktoren auf Stärke einwirken. ist
Keimfreiheit viel wichtiger als bei Pektinasepräparaten. die z.B.
Fruchtsäften zugegeben werden. Sobald der Zweck des Zusatzes. die
Klärung des Saftes, erreicht ist, wird durch Erhitzen das Enzym
inaktiviert und zugleich der Saft pasteurisiert).
II. Eine Zusmmnenkuuft von Vertretern der Gesundheitsbehörden mit
Vertretern der Forschung. in der klargestellt werden soll.
welche Möglichkeiten bestehen. Genehmigungen fUr die Enzymbe
strahluug zu erhalten,
(Erläuterung: die Verwendung bestrahlter Zusatzstoffe, zu denen auch
die Enzyme zählen. in Lebensmitteln und Pharmaka ist verboten, solange
nicht Ausnahmegenehmigungen erteilt wurden, Im Hinblick auf die sehr
geringen Enzymmengen. die den Lebensmitteln zugesetzt werden, muB ge
prüft werden, ob für die Zulassung bestrahlter Enzyme Tierfütterungs
versuche, wie sie für bestrahlte Lebensmittel verlangt werden, als
notwendig erachtet werden. Bei bestrahlten immobilisierten Enzymen,
die nicht im Lebensmittel verbleiben und infolgedessen den Verbraucher
nicht erreichen. wäre eine solche Forderung erstrecht unbegründet.
Ohne Klärung dieser rechtlichen Fragen erscheint es nicht sinnvoll,
viel in die wissenschaftlich-technische Weiterentwicklung zu inve
stieren).
Die Vertreter der nationalen Forsch1111gseinrichtungen sollten aufgrund
der Ergebnisse der Konferenzen I und II prüfen. welche Möglichkeiten
bei ihnen für Forschungs- und Entwicklungsarbeiten auf diesem Gebiet
bestehen. Falls die beiden Konferenzen ein ausreichendes IntereHe
und eine Notwendigkeit für weitere Untersuchungen ergeben haben, sollte
schlieBlich organisiert werden
III. Eine Zusammenkunft von Vertretern der Forschung mit dem Ziel
der Koordinierung der weiteren Untersuchungen.
(Erläuterung: durch diese Koordinierung soll unnötige Doppelarbeit
vermieden md eine möglichst schnelle Klärung der noch offenen Fragen
_ erreicht werden).
- 30 -
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