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M A N U A L D E P R A C T I C A SD E

B I O Q U I M I C A4a. EDI CI ON

Q. B. P. J UAN ANTONI O RODRI GUEZ ARZAVE

o SCI ENTI Ai KxnntA i runarr

F A C U L T A D D E C I E N C I A S B I O L O G I C A SU N I V E R S ID A D A U T O N O M A D E N U E V O L E O N

MONTERREY, N. L. 1 9 8 7

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1020111502\j\m i - i l . fl /OT- ..- .....L. f!Tq cb c BZ iL iJ u , A v AK 2C1 aOBT"' rL.UK G.. : , '

- - a . Y Asecsj i 853Q 0 = L.A] b1 'xcsluiga-i le ne eup acrcedsa 18 rM : r ^ V r Tr i / i o ; C ' --v 1 .-J sb XI I BI ^ NB-.o;^ae BI r: obTsvxrJ -I ; : / s LO.. CH3- (CH2) CH- (CH2) ^ C( CH2) n-C-0

OIICH3- (CH2) n - CH = CH - ( CH2) n- C- 0- CH2

LI PI DO I NSATURADA

Br iH3- (CH2 ) n- CH- CH- ( CH2 ) n-CCOMPUESTO CE AD CI ONSi a l a mezcl a anteri or se l e aade KI , ste r eacci ona con el Bromuro de yodol i bre que no se adi ci on a l a grasa, l i berndose coro producto yodo, de acuerdo a l a si gui ente r eaccin:I Br + KI -- l ibre - > KBr + I 2

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El yodo l i berado se ti tul a con una soluci n estandar de tiosulfatode sodio atpl eando cono i ndi cador al mdn. La reacci n de titulacin es la -que se muest r a ensegui da:+ 2 Na2S203 - 2 Nal + Na2S406

Se cardaran l uego l os result ados con l os obteni dos de un blanco tratado en l a msma f orma, pero del que se ha omt i do l a grasa. La diferencia"entr e l a l ectura del bl anco y de l a muestr a (A - B) corresponde al nfcnero deml i l i tr os de ti osulf ato 0. 1M necesari o para reacci onar con un volSmen equival ente de yodo. Con este dato podresos cal cular el nnero de granos de yodori f ados a 100 gramos de grasa si segui mos ef ectanos cor rect ament e l os sigui entes cl cul os:# meq S # meq I ,# meq S0 = V ^ ' V i = (A - B) ( N _2 3Entonces:

I ND CE DE YCOO = A - B ) ( N * ) ( P .MJ 2 ) ( 100 )2 3 i OQQ

GRAMOS DE MUESTRASust i t uyendo val ores:

I ND CE DE YCOO ( A - B) (Q l N) ( 127/ 1000) (1QQ)0. 5T

( A - B) (Q l ) (Q 127) ( 100)"075( A - B) ( 1.27)O

I ND CE DE YODO = ( A - B ) (2.54)Sobre el val or del ndi ce de yodo i nfl uyen vari os f actores, entr e -ell os el porcentaj e de aci do i nsaturado en l a mol cula de tr i gli cri do, vr ZJ * * ^ satur aci n de cada ci do graso. En general , un val or alt o de ndi ce de yodo i ndi ca un al to grado de i nsaturaci n en l a molcul a de l pi-

Las grasas- natural es cuyo conteni do de cidos grasos saturados es al t oposeen ndi ces de yodo baj os, aproxi madament e de entr e 10 y 50, y aquel l as-que conti enen ci dos grasos pol i i nsaturados presentan al tos ndi ceTde yodogeneral mente ent r e 120 y 150. y o a o

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I ND CE DE SAJ CTI F ACI C : Cuando un t gfl i cri do se snete a r efl uj o en pre-senci a de hicFX& c d potasio alcohl &c, se hi drol i za generando gl i cerol yt res mol cul as de. ci do gr aso en frmmte? sales de potasi o (J ABONES) , Esta -reacci n de hi drl i si s conoci da caro K&J I FI CACI CN, se muest ra ensegui da:0HCH3- ( C H2) n - 0 - G W ( 0 ' 056)

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>Xl

ml i grarros de KOH . , v 4 _ vgastados en l a hidrl i s is = ( A" B > ( 0" 5N)

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REACTTVOS:1.- YODURO DE POTASI O AL 15% D sol ver 15 granos de KI en 100 m de agua destl ada, guardarl o en f rasco oscuro.2. -CLOROFORMO3.- REACTI VO DE HANUS: D sol ver 13. 2 gramos de yodo pur o en un l i bro de ci doact i co gl aci al . Aada e aproxi madament e 3 m de brot o cui dadosament e, pra dupli car l a canti dad de hal aeno. Guarde el reacti vo en fr asco oscuro4.- TI OSULFATD SOD CO 0. 1N: D sol ver 12. 4 gratos de Na S O 5 H O en agua rci entemente hervi da y fr a, afore a un l i tr o. Estandari zar l a sol uci n.

ESTANDARI ZACI ON DEL TI OSULFATO: Ti t ul e l a sol uci n anteri or con una sol ucpatr n de Yodo, uti l i zando al mdn coro i ndi cador.YCDO 0. 1N: D solver 12 gramos de KI en 10 m de agua dest i l ada, aadi r 6. 5gramos de yodo, di sol ver el yodo y l uego af orar a 500 m .5. -SO LJ C ON ALCOHOLI CA DE KO AL 5.6% D suel va 56 granos de KOH en et anol cagi taci n constante. Afore a un l i tr o con etanol , procurando obtener una l ucin cr i stali na.6.- ACI DO CLORH DRI CO 0. 5N: tr ansf eri r 41. 66 m de HCl concentr ado en un matde af oracin de un l i tr o coteni endo 200 m de agua desti l ada, mezcl e henogeneament e y l uego afore hasta un l i tr o con agua dest i l ada.7.- ALM DON AL 1% a 100 m de agua cali ente aada 2 granos de al m dn sol ublagi te hasta di sol ver conpl etamente. Luego aada 100 m de agua f r a y mecl e bi en.8. -SOLUC ON I ND CADORA DE FENOLFTALEI NA: D sol ver un grano de f enol f t al e n100 m de etanol .

PARTE EXPERIMENTALI ND CE DE YDDQ *

1.- Pesar 0.5 gr amos de grasa en un matr az Erl enmeyer de 250 m envuel t o en pel al umnio.2. -Adi ci onar 10 m de cl orof ormo y agit ar para di solver l a grasa.3.- Agregar 10 m del reacti vo de Hanus, agi tar vi gorosamente y dejar reposarl a oscuri dad durante 30 mnutos, agi tando ocasi onal mente.4.- Enseguida, agregar 10 m de KE al 15% agi tando f uert rente.5.- Luego adici one 100 m de agua reci entemente hervi da y f r a, l avando l a pecant i dad de yodo que hubi era quedado en l as paredes del matr az.6. -Ti tul ar el yodo l i bre, no uti l i zado en l a halogenaci n, con Nf cuS00, 0.1N hque l a sol ucin adqui era un col or amari l l o pl i do. Cuando esto ou ra, agr2 m de alm dn al 1%coro i ndi cador, l a sol uci n se ti e de col or azul.

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p

y

7.- Prosegui r l a val oraci n, AG TANDO VI GOROSAMENTE EL MATRAZ, hasta que desparici n del col or azul . " 8.- Regi str e el vomen de Na2S203 0. 1N uti l i zado en l a t i tulacin.. *CORRA UN BLANCO UTI LI ZANDO 10 m BE CLOROFORMO TRATADO DE IA M SMA*FORMA QUE I A MUESTRA. ANOTE EL VOLUMEN DE Na~S00. , 0. 1M NECESARI OSPARA VAI ORAR EL YODO EN EL BLANCO

INDICE DE SAPONIFICACION*BEBEBA PREPARAR IF BLANCO R EFLUJA*0 50 MI DE DISOLUCION ALC OHOLICA E E ROHLA FORMA C E S O T M A (XOTINUACICN Y TITULANDO EL ALCALI CON HC1 0.5N. Anote VOLUMEN DE HD T GASTADO.1. - En un matraz bol a de 250 m, coloque 2 granos de grasa, y agregue 50 midisol uci n al cohl i ca de KOH. D suelva bi en l a grasa.2. - Adapte al matraz bol a un ref ri gerante de ref l ujo, y refluje la iwszcla poun m ni mo de 30 m nut os. Una saponi f i caci n ccrapl eta ocurre cuando la mc a est bie c l a r a . ~ 3. - Al termnar l a saponif i caci n, reti re el mechero, y dej e circular el aguahast a que se enf ri e l a mezcl a.4. - Cuando l a sol uci n est f r a, adici one 5 gotas de fenolf tal ena cano i ndcador, se desarroll ar un col or r osa.5. - Tit ule el KQH l i bre con HC1 0. 5N, hasta que el col or rosa desaparezca. Anel vol men de ci do clorh dri co gastado en l a ti tul aci n.

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RESULTADOSI . -En l as t abl as si guientes anote l os result ados obtenidos durante l as ti tulci ones ef ectuadas.

A) NUMERO DE MLI LI TROS DE N a ^ ^ 0.1 NGASTADOS EN LA TI TULACI ON DEL BLANCO =B) NUMERO DE M LI LI TROS DE Na2S23 0 , l NGASTADOS EN I A TI TUI ACION DE LA MUESTRA =

D FERENCI A ( A - B ) _

I ND CE DE SAPON FI CACIONA) NUMERO DE M LI LI TROS DE HC1 0. 5 NGASTADOS EN LA TI TUI ACION DEL BLANCOB) NUMERO DE M LI LI TROS DE T I 0. 5 MGASTADOS EN LA TI TULACION DE LA MUESTRA

D FERENCI A ( A - B )

I I . -Con l as di f erenci as ( A- B ), determ ne el I ND CE DE YODO e I ND CE DESAPON FI CACI ON, en el si gui ente espacio:

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I I I . -En l a si gui ente tabla reporte l os valores de I ND CE DE YODO e I ND CE DSAPON FI CACI ON para su muestr a y para l as de sus ccrrpaeros

MUESTRA I ND CE DE YODO I ND CE DE SAPON FI CACI ON!

I V. - I NVESTI GE m LA LI TERATURA I OS I ND CES DE SAPON FI CACI CXJ Y DE YCDO PARl as muestr as t rabajadas, y anotel os en l a si gui ente t abl a:

MJESTRA INDICE DE XOX> , INDICE DE' S A P A ^ I P ^ C N ' .

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B I B L I O G R A F I A1.- Baum S.J . 1981. I ntroducci n a l a Qum ca Orgni ca y

Bi olgi ca. Compaa Edit ori al Conti nental,S.A. Mxi co, l a. Publi caci n en espaol . -pp: 326-328. ~2.- Cantarr ow A y B. Schepart z. 1969. Bi oqum ca. Edi tori alI nter ameri cana, 4a. Edi ci n, pp: 44- 47.3. -Clark, J . M 19 . Bi oqu mca Experi mental . Edi tori alAcr i bi a. l a. Edi c in. pp: 76.4.- Harper, H. A. 1980. Manual de Qum ca Fi si olgi ca. Edi to-r i a l E l Manual Me mo , S. A. 7a. Edi ci n, pp: 135. - Lynch, M J . et al . 1972. Mtodos de Laboratori o. Edi to-ri al I nterameri cana. 2a. Edi ci n, pp: 56,382-39*7.- Plummer, D. T. 1981. I ntroduccin a l a Bi oqum ca: - acti cEdi tor i al McGraw- H l l Lati noameri cana, S.A.Bogot, Col orf oi a. Traduci do de l a 2a. Edici nen ingl s. pp: 197-199.6. -Macarull a, J . M y F.M Goi . 978. Bicmolcul as. Edi tori aRevert. l a. Edi cin. pp:76.7.- Ramsey, B. J . 1980. Bi ol oq a Qum ca. Una i ntroduccin a l aBi oqu mca. Edi tor i al Cont i nental , S. A. l a. Edici n en espaol. pp: 172- 173.8.- Rendi r a, G. 1974, Tcni cas de Bi oqum ca Apli cada. Edi tor iI ntermeri cana, l a. Edi ci n, pro:142-143.9.- Toporek, M 1984. Bi oqum ca. Edi tori al I nterameri cana3a. Edi ci n, pp: 210.214.

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SEPARACI ON DE LI PI DOS MED ANTE CROMATOGRAFI A EN CAPA FI NAI NTRODUCCION

La cr omatograf a en capa f i na (TLC), es un mtodo si mpl e, rpido y costoso; uti l i zado nara s eparar cual i t ati vament e una muest ra en sus componet es. La capa del gada se prepara di spersando una suspensi n de materi al adsobent e sobre una pl aca de vi dri o y dej ando secar para f ormar una capa con ungrosor apr oxi mado de 250 m eras.Esta t cni ca puede adaptarse a l a separacin y caracteri zaci n de lpidos, uti l i zando m crocanti dades de' materi al; es posi ble tambin efectuar t i maciones cuanti tati vas de l as di st i ntas cl ases de l pi dos. Por ell o, estemtodo ha despl azado a otr as t cni cas y es ampl i amente ut i l i zada t ant o en i ndustri a cano en l os l aboratori os cl nicos para l a separaci n de l pidos dl pidos sri cos, cort i costeroides de l a ori na, hormonas sri cas, vi tamnas posol ubl es, etc.

OBJETI VOI ntentaremos l a extr acci n de l pi dos de muest ras bi ol gi cas con unal to conteni do de l i pidos y posteri ormente l os separaremos e i denti f i caremouti l i zando la t cni cas de cromatograf a en capa fi na.

FUNDAMENTOBsicamente a l a cromatograf a en capa f i na se apl i ca el m smo f undmento de l a cromatograf a en papel , Agui l a muestr a se col oca sobre una cubierta de s l i ca gel adsorbi da a una placa de vi dri o; esta pl aca se i ntroduen un el uente conteni do en una camara crcmatograf i ca dej ndol o mgrar a t r avs del materi al adsorbente (f as estacionari a). El eluente (f ase irvil) al i r despl azndose sobre l a s l i ca, arrastra l a muestr a. La adsorci n y l a pati ci n retardan el avance de l a muestr a; y l a resol uci n de l os di f erentes canponentes se debe a que l as sustanci as presentes ti enen di f erent e vel oci ddes en di recci n del f l ujo.General mente se perm te gue l a fase mvil avance de 10 a 15 an, l a t ecci n de l os canponentes separados se hace con vapores de yodo, roci ando con ci do sul f ri co al 50% roci ando con reacti vos especial es como el cif osfcmol bdi co entr e otr os.La i denti f i caci n se hace calcul ando el Rf de cada uno de l os componentes de l a mezcl a y comparndolo con l os Rf de sol uciones l i pdi cas conoci

r a T e ? St ! Va l r S e b t i e a l e a l l a di stanci a recorr i da -por l a mancha entr e l a dist anci a t otal recorr i da por el sol vente.

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4.- Dej e que l as pl acas se seouen al ai re, Dermaneciendo si empre sobre el nivel ador.5. - Acti var l as pl acas l l evndol as a secar en una er-tuta a 110C durante uhora oara el i mnar l a mayor part e del acrua.6. - Guarde el estante con l as pl acas dentro de un desecador hasta el nonentode su usoPARTE EXPERIMENTAL

Segn sea el materi al biol gi co con el que se cuente, el i ntructor idi car el prot ocol o adecuado. ~PROTOCOLO A

1. -PREPARAC ONDE LA MUESTRAa)Si su muest ra es una grasa acei t e, di suel va 1 gramo de el l a en 4 m deter de petr l eo.b)Si tr abaja con suero, entonces adi ci n 1 m de suero a 25 m de una mezcde cl orf ormo-metano1 (50: 50) en un matr az erl enmeyer de 50 m . Cal i ent e brevemente para preci pit ar prote nas, y f i l tr e a tr avs de papel f i l tr o

2. - APLI CACION DE LA MUESTRALa muest ra y l as sol uci ones patr n se apl i caran en f orma de got a peguesobre l a s l i ca, uti l i zando l a pl anti l l a especial para el l o, procurando gl as muest ras queden bien separadas ent re s . Col oque 3 got as de cada sol uci n perm ti endo que l a gota se seque antes de anli car l a si gui ente,3. - DESARROLLO DEL CROMATOGRAMA

a)I ntroduzca l a pi ca en l a cmara, crar atogrf i ca col ocndol a previ amente el disposi ti vo especi al para el l o, y eluya hasta una al tura de 16 cmcon eel uent e I . Saque l a pl aca, y dej e secar al ai re.b)I ntroduzca l a placa en otra cmara crue contenga el el uente I I v eluya huna alt ura de 12 cm dej e secarl a al ai re, y posteri ormente el uya con el te I I I hasta una al tura de 5 cm y seque al air e.

4. -DETECC ONDE I AS MUESTRASRoci l a pl aca con ci do fosfcmol bdi co al 20%en etanol, y cal i ntel a -una vez seca, en el horno a una t emperat ura de 105C - 110C durante 5 mnutos. 5. - I DEOTIFICAC ON

Deli mt e l os contornos de l as manchas con un al f i l er un l piz de puntf i na, coloque un punto en el centr o de cada mancha, y determ ne el Rf .

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PROTOCOLO B1. - PREPARACI ON DE I A MUESTRA

En vaso de preci pi tados de 250 m , col oque l a yena de un - huevo, yaada 100 m de una mezcl a cl of ormo et anol (50:50). Agi t e vi gorosament ey l uego fi l tr e usando un embudo de f i l tr acin rpi da, bi en dej e reposahast a que se separe bi en el sobrenadant e.Del sobrenadante o" del f i l tr ado, prepare di l uci ones 10~\ l o"f 1 mezcl a cl oformo-metanol (50: 50); l a sol ucin ms di l ui da perm t e l adeterm naci n de f osf ati di l etanol amna (cefali as) y l eci ti na. La sol u

ci n ms concentrada demuestr a l a presenci a de fosf ati di l - seri na y fosf at id i l i no s i t o l . 22.- APLI CACI ON DE 1A MUESTRA

l as muestr as y l as soluci ones patrn uti l i zadas se apl i carn enforma de gota sobre l a s l i ca, uti l i zando para ell o l a planti l l a de ol ti co Deje secar l a gota antes de col ocar l a si gui ente; ya que deber apcar 5 gotas de cada sol ucin. 3. - DESARROLLO DEL CROMATOGRAMA

I ntroduzca l a pl aca de cromatograf a en l a cuba, acorodandol a pviamente en el disposi ti vo especi al para ell o; l a cuba deber contener eeluyente. Perm ta que el el uentem gre una dist anci a de 10 cma 15 cm segui da saque l as pl acas de l a cmara cromatogrf i ca y dj el as secar al 4. - DETECCI ON DE I AS MUESTRAS

Roci l as pl acas con aci do fosfcmol bdi co al 20%en etanol, y cl i ntel as,yna vez secas, a 110C durante 5 m nut ose5. - DEISKTFICACI ON

Del i mt e l os contornos de cada una. de l as manchas uti l i zando pra ell o un alf i l er un l pi z con punta f i na, y l uego col oque un punto enel centr o de l a mancha. M da l a di stanci a desde el cent ro de l a mancha hata el or i gen, y l a di stancia desde el or i gen hasta el fr ente del sol vl entiDeterm ne el Rf de l as manchas, e i denti f i que l os componentes dsu muest ra comparando l os Rf de estos con l os Rf de sol uci ones conoci das.

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RESULTADOSI . - D buj e un esquena del cromatograma cb eni do, i ndi cando l os ncmbres de l as soluci ones uti l i zadas oomo patr n. Asi m smo el -t i orpo de desarr oll

TI . -En l a sigui ente tabl a anote l a di stancia recorr i da por el el uente, l adi stanci a r ecorri da por cada una de l as sol uci ones patr n uti l i zadas-y l a di stanci a m grada por l os ocnponentes presentes en su probl ema.S O L U C I O N D STANCI A M GRADA( cent metr os)

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I I I . -Cal cul e l os Rf ' s de todas l as sol uci ones patrn y de l os componentes presentes en s u muestr a pr obl ema.

l os datos obteni dos en el ndnero anteri or, y antel os en l a tabl a

S O L U C I O N RfO L U C I O N Rf

V. - Cul es f ueron l os l pidos presentes en l a muest ra?

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DISCUSION

CONCLUSIONES

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B I B L I O G R A F I A1. - Conn, E.E. and P. K. Stumpf. 1972, Outl i nes of Bl ochonlst ry.I nternati onal Edi t i on. 3a. Edi t i on. pp:58.2. - Devel, H. J . The Li pids; t hei r bi ochemst ry and chemst ry.I ntersci enci e Pub.3. - Harper, H. A. 1980. Manual de Qum ca Fisi olgica. Edi tori alEl Manual Moderno, S.A. 7a. Edi ci n. pp: 136- 137.4. - Lynch, M J . et al . 1979. Metodos de Laboratori o. Edi tori alI nterameri cana, 2a. Edi ci n pp:1333-13335.5. - Stahl, E. 1966. Thi n l ayer Chromatography. Academc. PressNew York.6. - Gel man Chromatogr aphy System 1974. , GeOr an I nst r umentCorrpany. Techni cal Bul l eti n . 30.7.- I nstant Thi n Layer Chromatography. 1971. Gel man I nstr umentCompany, Techni cal Bul l eti n 17.8.- Separaci n de l pidos por cr omatograf a en capa, f i na, 1974Asesor a Tcnica. Merck, MEXI CO, S. A.

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REACCI CNES DE I DENTTFI GAC CXSI DE AM NOACI DOS Y PROTEI NASI NTRODUCCI ON

Un gran nmero de reacci ones son uti l i zadas para l a detecci n de -prote nas. Debi do a l a conpej i dad de l as molcul as protei cas y a l a di f i -cult ad de obtenerl as en f orma pura y ai sl ada, estas pruebas son usadas s a-bi endo que i denti f i can grupos qu m cos especf i cos de l a mol cul a de protena, ms general t odav a, para l as cadenas l ateral es de l os amnoci dos encontrados en todas l as prote nas. As , el reacti vo de M l l n da una reac-ci n posi ti va cuando reacci ona con l os grupos f en i eos de l os amnoci dospresentes en l as prot e nas.l as reacci ones de amnoci dos l i bres, son en general , l as que podran esperar se para l os compuestos que conti enen grupos am nos y grupos c ar boxi l o, adems cual qui er otr o grupo que pueda estar presente, sufr e sus propias reacciones caracter sti cas. ~

OBJETIVOEsti mar qu mcamente l a presenci a de al gunos amnoci dos, y tr atar-de determ nar si estos m smos estn presentes en l as prote nas uti l i zadas.

FUNDAMENTOPRUEBA DE M LLON; Esta pr ueba nos perm t e detect ar compuestos con r adi cal -hi droxi benceno cano el amnoci do ti rosi na sus deri vados; as cono protenas que l o contengan (al bmna). El reacti vo de M l l n es una mezcl a de nitr i tos y ni tr atos mercri cos l os cuales ocasi onan l a mercuraci n y ni tr aci S ni tr osaci n del grupo fenli co de los amnoci dos l i bres presentes en prote nas, generando un preci pi t ado bl anco que por l a acci n del cal or, temun col or rosado roj o l adri l l o.PRUEBA XANTOPROTEI CA: Medi ante est a prueba cual i t ati va podaros i denti f i car amnocidos que conti enen ani l l os aromti cos heteroci cl i cos en su nol cul prote nas que l os contengan; aunque el ani l l o bencni co de l a f enil alani nno ti ene sufi ci ente capaci dad para t ornar posi ti va l a prueba.Cuando l os amnoci dos con l a caracter sti ca estr ucturalya menci onada, se cal i entan en presenci a de ci do n tr i co concentr ado, prodcen compuestos ni tr ados de color amari l l o, a l os cual es el lcal i caro elNaOH NH4OH, convi ert en en sus sal es r especti vas de col or naranj a.PRUEBA DE BIURET: Est e ensayo nos perm t e detect ar compuest os que poseen do mas enl aces pept di cos.- Cuando estas sustanci as se t rat an con soluci onesde sul f ato de cobre di suelt o en sol uci n alcal i na (Reacti vo de Bi uret) , danun col or viol eta caracter st i co.

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E1 col or desarr ol l ado es debi do aparentement e al corplej o de -coordi naci n f ormado ent re el teme de cobre del Reacti vo de Bi uret, y -cuatr o tanos de ni tr ogeno pept di cos presentes en l as cadenas pol i peptdi cas cono se ej empl i f i ca ensegui da: -

0 = C

l a i ntensi dad del col or generado es una medi da cuanti tat i va delnumero de enl aces pept di cos presentes en l a mol cul a. Esta prueba no esespeci f i ca excl usi vamente para detectar enl aces pept di cos, ya que cual -qui er conpuesto que contenga dos grupos carboni l os uni dos por un tono -de ni tr ogeno o de carbono, da tambin un resul tado posi ti vo, Asi . el compuesto conoci do ccmo bi uret ( H2NeO- NH-OQNH2) da una reacci n posi ti -vaRE CI ON DE HOPMNS- COLE: Esta prueba es espec f i ca para l a i dent i f i ca-ci n de tr i ptof no l i bre presente en prote nas. El reacti vo de Hopki nsCol es una di sol uci n de ci do gl i xi l i co en agua, aunoue el ci do ac-ti co glaci al expuesto a l a l uz conti ene tambin ci do gli ox l i co y se -puede empl ear en l a prueba._ Cuando una sol uci n de t ri ptofano de prote na se tr ata con -el Reacti vo anteri or, y l uego se permt e l a estr ati f i caci n de cido sulfuri co? en l a zona de nter ase se genera un ani l l o pt rpura rojo vi ol ita r esult ante de l a condensaci n del grupo carbonil o del ci do gli ox l i -co y al ani l l o i ndol del tr i ptofno:

HC = OICOOHAci doG i ox l i c oC f c r H2S0 4NMj

Tri ptof anoCcupl ej o deCol or prpura r oj o vi ol eta

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REACCI ON DE XA NI MDRi m Esta prueba per m e i denti f i car ccnpuestos queAl aadi r nl nhi dri na a una sol ucion que cont ema amnocidos -S T ^ f ^ r / f C C 6 n d S OX d a c i 6 n V r educci n con l ^ q r ^ S iS a ^ g W 5 S b c n o y amoni aco por desti naci n oxi ^dati va. Esta r eacci n, ocurr e a pH entre 4 y 8, es mostr ada ensegui da:

N nhi dr na

azul a v i r dS L ^Sf SE J na l producido por l os amnocidos var a de col orr t SS^ I l o l e t a ' Pi t i dos 6 protei nas dan una reacci n posi t i va dbil -debi do a que pr esent an menos grupos amno l i bres que l os am noci dos Las= pr i mar i as y el amon aco dan s i t i va l a pru^a, p e ^ S dSr e^S-^ S * 1 ^ s . a c l d o s l a proli na y l a Mdroxi prol i na tanfaireaccionan con l a mnhi dr ma, pero el col or desarr oll ado es Car i l l o y Pg EC PmCI ON PON SAUS DE METALES PESADOS ( PRECI PI TOTUS OmCHi mBl , LasP a ste se encuentran en t or m ani ni ca es dci r cargados negati vamente, por l o que al adi ci onar i ones de metal es pes ados cargados Dosi ti vamente se neutr ali za l a carqa de l a prote na y S Tpreci pit a de l a sol uci n dbil mente alcal i na. Un e ceso de l cSi ocTst ona S f f f t a C 5 n f Md r 6 x i c t o s i t l i cos . Y cuando t S^n LceSnt e^e S L

P f " 0 1 1 1 3 3 ^ga s posi t i vas establ es, por estos i rotivos, elensayo se debe e ectuar cui dadosament e. 'Protei na' ' + Aq+ < Hg"^ > Protei natode Ag Hg

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MATERIAL POR EQUIPO DE CUATRO PERSOGAS20 tubos de ensaye de 18 x 1506 pi petas de 5 m2 pi pet as de 10 m1 mecher o2 gradi l l as1 pi nzas para t ubos de ensayemaski ng- t ape eti quetasREACTI VOS1.- SOLUCI ONES DE AMNOACI DOS AL 0. 1 % D sol ver 0. 1 gramo de amr oaci do e100 m de agua dest i l ada. Aadi r unas gotas de HC1 concentr ado en casode que no ocurra l a di soluci n total del amnoci do.2. - ACI DO NITRI CO CONCENTRADO3.- f l DROXI DODE SOD O 10M : En 80 m de agua desti l ada f r a di sol ver l entmente 40 gramos de hi drxi do de sodi o, manteni endo el vaso de preci pi tdos en un bao de hi el o. Cuando l a soluci n est fr a, af ore con agua desti l ada hast a un vol dmen f i nal de 100 m .4. - CLORURO MERCURI CO 0. 2M : D sol ver 54. 428 gr anos de HgCl 2 en agua destida y l uego aforar hasta un l i tr o con agua desti l ada. 5. - ACI DO SULFURICO ( XNCENTRADO6.- ACETATO DE PLOMO 0.2M D sol ver 75. 842 granos de PbOAc.3 H20 en agua dt i l ada, y l uego aforar a un l i t ro . 7. - N NH DRI NA AL 0. 1% D sol ver 0. 100 gramos de ni nhi dri na en n-butanol ,l uego compl etar a un l i tr o con n-butanol .8.- REACTI VO DE BI URET: D sol ver 1.50 granos de CuS045 H20 y 6 gr amos de Tart rat o de sodi o y pot asi o ( NaKC^Og 4H2O) en 500 m de agua destl ada, enseguida, adi ci onar 300 m de NaOH al 10% y aforar a un l i tr o con agua dest i l ada.9. - REACTI VO DE HOPKENS- CO : Col ocar 10 gr anos de pol vo de magnesi o en unmatr az Erl ermeyer de 1 l i t ro, y aadi r agua dest i l ada hasta que cubra compl etament e al magnesi o. Ensegui da, agregar l ent ament e 250 m de unsol ucin saturada en fr o de ci do oxl i co y agi tar bi en el conj unto,enfr i ando si es necesari o. Luego fi l tre y acidi fi que el f i l trado con do acti co gl aci al y di l uyendo a un l i tr o con agua desti l ada.10. - REACTIVO DE M LLON: D sol ver 10 granos de mercuri o en 20 m de Aci do Ntr i co f r o. Cuando l a di sol uci n sea compl eta y haya cesado de despr ederse humos pardos, adi ci one 60 m de agua. Despus de vari as horas, decante el sobrenadant e y gurdel o en f rasco oscuro.PREPARACI ON ALTERNATI VA: Prepare una s ol uci n de sul f ato mercr i co al en H2SO4 al 15%v/ v.

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PARTE EXPERIMENTAL1. - PRUEBA PE MI L ES En una seri e de tubos de ensaye, tr ansfi era 2 m de -caoa una de las sof i ones proporci onadas. Aad 5 g o S d 5 P eaS i ^ -^ Y C al i e n t e ^dos ament e l a mezcl a dur anSI S -m nutos en un bao de agua hi rvi endo. Observe y anote s us cbser vSi ones2. - ^CI ON XA PROI EI CA: E^si t e 1 m de cada una de las sol uciones a -

de d r X ^ e d S d G ^ ^ y cui dadosament eTnS -de ci do n tr i co concentr ado, mezcl e bi en, y cal i ente l i geramente a l aUama del mecher o Dej e enf r i ar y obser ve' el col or s S S i o s ubos pueden ser enf ri ados al chorr o del agua. -c e nt r a ^f L ^0 1 0 1 1 6 M 0 t a Y 0 01 1 ^t ac i n NaOH 10 M (6 NH4OH conb ^ e t i ^ ^ 6 1 l q u i d o s ea G n e n t e al cal i no. Observe4el cam.g " ^ * 1 ^ d ? S Ol u c i ne s cayadas , adici one 2 m delReacti vo de Bi uret y mezcl e bi en. Observe el col or desarr ol l ado y ante

4.- RACI ON DE HOPKI NS-COLF): Adi ci one 2 m del Reacti vo de Hopki ns-Col e a2 m ae l as sol uci ones en estudi o, mezcl e bi en.1 e L Ub y v i e r t a c emen t e por l as paredes del t ubo -6 0 f ^ f r i C O encentr ado, de modo que l l egue al f ondo y se -estrat i f i que, NO MEZCLE. Dej e reposar. ^ y S ei * ser ve el color producido en l a zona de cont acto entr e l os dos-l qui d os , y s ol o en c as o neces ar i o AGI TE MUY S t W ^ E T ^ ^ f lconseguir que se produzca l a r eacci n generadora de col or.

5. - PRECI PI TACION CON SALES METALI CAS;A ) ^ a y e ' d f I s V S o ^ * ^ ^ - t ubosB) Al cal i ni ce con NaOH di l ui do hasta un pH de 7 - 8.C ) a di c ne 5 gotas de Acetato- de Pl ano 0.2M . Descri ba l os r e-

sui taaos obteni dosD) En otra seri e de t ubos de ensaye de 18 x 150 col oque 3 m de l as so-l uci ones protei cas, alcal i nice l i geramente cono en el ensayo anteri ord l Ul d 0 - ^ a d C O ne 5 d e c l o r u ^me S Sy anot e sus observaci ones.6. - PWEff i DE IA NI MHI DRI NR: En ura seri e de t ubos de ensaye t ransfi era 3 m^O X UC1 f S e n s a ^d a s ' y 0. 5 nd de Ni i J d r i m a l T l %, -^ y di en t e a ebull i ci n dir ectamente a l a l l ama de mechero. Anote el col or desarr oll ado por l a sol uci n -

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av.

neo

OV OB

3UD

/ICS.

.

RESULTADQS:1.-PRUEBA DE M LLON: Anote -SOLUC ON REACC ON( + 6 ( - ) OBSERVAC ONES

2. -REACC ON XANTOPROTEICA. : Anote sus resul tados enseguida:

REACC ONSOLUC ON,

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3.- PRUEBA DE BI UgCT: Regi st re sus observaci ones

4.- PRUEBA DE HOPKI NS- CO : Descr i sus observaci ones ensegui da:

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-98-5. - PRECI PI TACI ON CON SALES METALI CAS

a)Anote sus observaciones cuando uti l i z el Acet ato de Pl anoSOLUCION REACCION(+) 6 (-) OBSERVACIONES

b)Anote l o observado cuando adi ci on Cl oruro Mercri coREACCION( + 6 ( - )OLUTI ON REACCION( + 6 ( - ) OBSERVACI ONES

r

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f i ' - P f t T TF r aA PiF. TA N TNH DRI NADescri ba sus observaci ones

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r

\

D SCUSION

CONCLUSIONES

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vu.

SECCION DE PREGUNTAS:

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

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B I B L I O G R A F I A1. - Baum S. J . 1981. I ntroducci n a l a Qum ca Orgnica y

Bi olgi ca. Edi tor i al Conti nental, S. A l aEdi ci n. Pag: 381- 386.2. - Bhagavan, V. N. 1978. Bi oqu mca. Nupva Edi tori al I nterameri cana, S.A. l a. Edi ci n. pp: 52- 54. ~3. - Bohi nski , R. c. 1982. Bi oqum ca. Fondo Educati vo Interameri cano, S.A. l a. Edici n. pp: 93-964. - Bronk, R.J. 1980. Bi ologa Qum ca . Una i ntroducci n al a Bioqu mca. Edi tor i al Conti nental , S. A. -l a. Edi ci n. Pg:102, 142-143.5. - Harper, H . A. 1980. Manual de Qum ca Fi si olgica. ElManual Moderno, S. A. 7a. Edi ci n Pag;26- 32.6.- Macarull a, M J . y Goi , F.M 1978. Bi crool cul as, l ecci o-nes de Bi oqu mca Estructural . Edi tor i al =Revert, S.A. l a. Edi ci n. Pp: 88- 92, 107-108.7. - Pl urrmr, T. D. 1981. I ntroducci n .a l a Bi oou mca Prcti caEdi tori al McGrawrr- H l l Lati noameri cana, S.Al a. Edi ci n, pp 128- 137.8. - Toporek, M 1984. Bi oqum ca. Edi tori al i nterameri cana.3a. Edi ci n. pp : 229- 232.

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PROPI EDADES DE LAS PROTEI NAS( DESNATURALI ZACI ON, D ALI SI S Y EQUI LI BRI O DE DONNAN)I NTRODUCCI ON

, , . ^ caracteri zaci n de una proteina en cuanto a su estr uctura y f unci r a f ^a r a ' e S T ^ Y P - i f i c ^i n a par ti r de l a f u i t f Srai Para ell o es apl i cable tcni cas que perm ten la el i mnaci n de materi alS ^ r ^ l ^ ^ SO n 1 l r t ^o s s u a v e s que pr eci s an de un t r a S " ^ oso siendo ti l es para el aisl amento de prot enas gl obulares nati vas pero noanpl eadas para otr os corrpuestos de carbono bi o logiLnente i ^ S S . ^Si n embarrr o nara t rabajar con estas bi orol cul as - es necesari o una atencxn estr i c ta a los detal l es , puesto ^e son ex t r er ada mSt e^SS^ni -

S a ^ d es t i l a ^aC 1 n e S / S l v e n t e s o r C T n i c o s ' t c ' X en al arnos casos hastaOBJETIVO

- ! T r a t a r a T I s d e demostrar experimentatoente el efecto de los factores ambientales coro el calor y el pH sobre la integridad de las protems,obse rvar as la propiedad que tienen estas moloilas de no L*v ez ar m S S S Ssanipermeables, as cono la capacidad de un in no difusible ( p r o t e i n ^ ^s^nar una distribucin desleal de iones a ambos lados de L S T s ^ i p

FUNDAMENTODESNMTOALI ZACI CM Est e f enmeno, es el cambi o que experi mentan l as mol cul as -S r a t o f ^ a di f er ent e cor r i i Son ccno s S ^ S s ^ S i .perat ura, pH somcaci n, exposici n a l a radiaci n ult ravi olet a, agit acin -1COS ' de compues t os p o l a S S i S i n .^Sr e ? ^ O C a S 1 n a d a ! * * e 3 t O S f a c t o r e s fisicoqumicos sn directamented f a ? t e r c a r * Y cuaternari a de l as nrote ras debdo al arpi m entode los enl aces no coval entes i ranti enai dichas estructural a de l a desnaturali zaci n se mani f i estan cato prdi da de-fe S c r i m S ^ 1 ^ ' S 1 U b l l d a d . d S n m d a 6 11 e l P ^ iselctr^, prdida, oristabilidad, as cono aumento en la levorrotacin, asimetra deU t i Z s ^ T ^ * 1 3 hi drl i s i s efectuda pOT^ zi raas rot e?ut i cas. l os agentes que ocasi onan la desnaturali zaci n de lks nrote na* e nocen como AGENTES DESNATURALI ZANTES. " - i on ae xas prot e nas se cosufr en e! S e c l o c a n a teroeraturas superi ores a l os 35CS 6 / 8 f f natural i zac in y l a al terac in- es tot a l a l l l egar a -i os 80 C. Entr e estos l mt es l a sol ubi l i dad di smnuye observndose la f or maciS felf^tfisoS^' ^ ^ **** ^ 13 Pr te ra Se ^ E

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TO qJd

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ncricJV

DESNATORALI ZACI CN TOR SOLVENTES ORGANI COS: Sustanci as orgni cas cot o el al cohol , l a acetona, ter con una baja constante diel ctri ca, al ser adi ci onadaa sol uci ones acuosas de prot e na, reducen l a const ante di elctr i ca de esassoluciones, abati endo la afi nidad de l a prot e na por el solvente, por l o queestas bi onolecul as se disuelven menos y preci pit an de l a soluci n.PRECI PI TACI ON POR ANI ONES: l os i ones negat i vos se combi nan con l as pr ote nascargadas posi ti vamente (a pH ci do con respecto al punto i soel ctr i co), precpi t ando en fo- ma de sal es de prot e na; al gunas de est as sal es son insol ubl eSEntr e estos agentes preci pi tantes f i guran el aci do- tr i c loracti co, aci do pcnco , aci do tni co, aci do fosfcmol bdi co, tngsti co, y ani ones cano el metafosfato.EQUI LI BRI O DE DQNNAN Dor mn en 1911, demost r oue cuando una sol uci n de prot e na cargada se separ a de una sol uci n sal i na medi ante una mentorana sempermeabl e, l a macromol cul a no at ravi eza l a merrbrana, pero su contr ai n s , obteni ndose una di st r i buci n desi gual de i ones a ambos l ados de l a membranaen el equi l i bri o, l o cual genera una dif erencia de potencial elctr i co a travs de el l a. Este t i po de di stri bucin de i ones en el equi l i bri o, debi do a lpresenci a de un i n no-di f usi bl e en un compart i m ent o, se ha l l amado EOUI LI BDE DCNNAN; el cual se r i ge por l as si gui entes reglas:l a. Ley: La suma de cati ones es i gual a l a suma de ani ones en cada uno de loccmpart i m ent os.2a. Ley: El producto de l os dos i ones (ani n y cati n) de cual qui er sal dif usi ble es i gual en l os dos ccmpart i mentos.3a. Ley: l a suma de cat i ones di f usi bles es mayor en el compart i m ento que coti ene el ani n col oidal no di fusibl e. ~4a. Ley: La suma tot al de i ones es mayor en el corparti mento del coloi de i oni co.

COMPARTI M ENTO I | COMPARTI M ENTO I I I I Ia Na+ ! Na+ b a + x Na+ i Na+ b - xPr

\ P 3 f O: c l \ b X Cl " ! Cl ~ b - xco\cr\tvac o contrae, n co*cntroxWn | concntracWSI TUACI ON - I N CIAL EQUI LI BRI O DE DONNAN

Este equi l i bri o de Donnan se puede poner de mani f i esto di al i zando unsol uci n de pr ote na cargada negati vament e cont r a un m smo vol dmen de agua deti l ada. Como sabemos, | a prote na no puede atr avezar l a bol sa de dil i si s pesi contrai n s (el Na ) ; esto ocasiona un excso de cati ones en el l qui do eteri or, por l o que para mantener l a neutr ali dad el ctr i ca ah , el agua de disc a generando i ones H+ y OH"; l os i ones H+ m gran al i nteri or de l a bol sa dedil i si s ocasi onando una dism nuci n del pH, m ent ras que el l qui do exteri oral conser var l os OH" i ncrement a su pH.

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aeb Birg& eb0130 3E 3.Ixs c&xrpT I

- 105-

i r S t oi r 33 d i a l ? t i c as 1 s o n Permeabl es al agua y sol utos verdade-i Z r ' J ^ ^ ^ } 5 ) 33 0 a l o s s o l u t o s col oi dal es debi do a su gran tamaol u t o f ^ o S f ? 1* D AL ISIS , t xxter os separ ar sol utos t o i s t aSi L ^l utos coloi dal es (prote nas), en vir tud a oue l os col oides por sus orandesdi mensi ones quedan r eteni dos dentr o de l a membrana ^ ^seoarar 1 1 S S 3 6 " T ^ d u r a n t e l a puri f i caci n de prote nas para -ag e t es Preci pit antes de prote nas uti l i zados en" el pri mer pasode su ai sl ament o como son l as sales neutr as ( NH4S04) etanol .MATERI AL POR EQUI PO DE CUATRO PERSONAS3 vasos de preci pi tados de 250 m ( fr ascos Gerber)2 pi petas de 10 m '2 pi petas de 1 m10 tubos de ensaye de 18 x 1505 t ubos de ensaye de 13 x 1001 gradi l l a1 pi nzas par a t ubos de ensayeMecher oTri pi y tel a de asbesto

REACTI VOS1.-f 'WNUi t'i 'ALENA AL 0.5%D solver 0.5 gramos de f enolf tal eina en 100 m etano^ G ^ ^ 2% D sol ver 2 gramos de gel ati na en 80 m de agua desti l ada-3 1 ' ' , * suavemente para di sol ver y ensegui da aforaa 100 m y conservar en el ref ri gerador.3.- ALBUM NA DE HUEVO: Tener l a cl ara de 2 huevos y di sol verl a suavenente en -500 m de agua desti l ada a 37C. guardar en refr i geraci n.4- SOUTI ON AL 1%DE GELATI NA: D sol ver 1 gtJ amo de gel ati na en 80 m de -agua desti l ada a 37C, l uego af ore a 100 m con agua desti

l ada a 37C. 5.- SOLUCI ON DE CASEI NA AL 0.1%D sol ver 0.1 gr ano de case na en 80 m de agua-. desti l ada a 37C y l uego af ore a 100 m con agua a 37C6 - SOLUCI ON DE PEPTONA AL 1% D suel va suavemente 1 gran*) de peptona en 100 mde agua desti l ada t i bia a 37 C.P H M e Z C l a r 1 5- 5 ** d e s o l u c i ( 5 n A y 24. 5 m desol ucin B y aforar a 100 m con agua desti l adaSOLUCI ON A: HQAc 0.2M D l ui r 11. 5 m "de aci do acti co concentrado a 1 l i trcon agua desti l adaSOLUCI ON B: NaQAc 0. 2M D sol ver 16. 31 gramos de acetat o de sodi o anhi dro 27. 22 gramos de acetato de sodi o t ri hi dratado en 800 m deagua desti l ada y l uego aforar a un l i tr o8. - REACTI VO DE BI URET.

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- 1 0 6 -

PARTE EXPERIMENTALI . - DESNATURALI ZACI ON POR CALOR (COAGULAC ON) .Prepare tres tubos de ensaye de 18 x 150 como s e i ndi ca ensegui da:

TUBO Al bm na 1% Reg .AcetatospH 4. 6 K21 0.1M NaOH 0. 1M1239 m9 m9 m 1 m

i' m 1 mCol oque l os t res tubos en un bao de agua hi rvi endo durante 10 mnutos, enf r elos al chorr o de agua corri ente. Anote en cual es tubos ocurr i coagulaci n. En l os t ubos donde no se haya presentado este f enmeno, adi ci nel es 2 de Regul ador de acetat os pH 4. 6, y anot e sus observaci ones.

I I . - DESNATURALI ZACI ON POR SOLVENTES ORGANI COSa) En 4 tubos de 18 x 150, col oque 2 m de l as sol uci ones de prote na propoci onadas . Ensegui da, agregel es 2 m de acet ona y anote sus observaci oneEn un 5o. t ubo adi ci one 2 m de agua desti l ada y 2 m de acetona.b)En 4 t ubos de ensaye de 18 x 150, coloque 2 m de l as sol uci ones prot ei cbaj o estudi o, y en un 5o. tubo adici one 2 m de agua desti l ada. A todos l os tubos adal es 2 m de etanol , y observe. Anote l os cai rbi os ocurri do

I I I . - PRECI PI TACION POR ANI ONESa) En una seri e de 4 t ubos de ensaye deposi te 2 m de l as sol uciones baj o etudi o, en tanto que en el tubo 5 agregue 2 m de agua . Agregue l uego a tdos l os tubos 1 m de Aci do Tri el oroacti co saturado, mezcl e y anote susobservaci ones.b)En una seri e de 4 tubos de ensaye de 18 x 150 tr ansf i era 2 m de l as sol uci ones protei cas y en un t ubo numero 5 col oque 2 m de agua, A t odos l otubos adi ci neles 1 m de Aci do Sulf osali c l i co saturado, mezcle, y anotel o ocurr i do.

IV. - D AL ISISa)Corte un tubo de cel ofn de 25 cmde l ongit udb)Humedzcal o con agua dest i l ada y tel o cui dadosamente por un ext r emo,c) Transfi era dentro de l a bolsa de cel ofn 20 m de Al bmna al 1%y ci errl a bol sa atando el otr o extrao.d)I ntroduzca l a bol sa de di li si s en un vaso de preci pit ados de 400 m con-teni endo 300 m de agua desti l ada, y dj el a ah por' 90 m nut os.e)Corra un bl anco colocando 20 m de NaCl 0.85%dentr o de l a bol sa de di l if )Una vez tr anscurri do el ti empo i ndi cado, efecte l a Prueba de Bi uret t antai l qui do exteri or cano a la sol ucin del i nter i or de l a bol sa de di l i sg)Regi str e sus resul tados.

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V. - EQUI LI BRI O DE DQNNANa)Ht medezca un tubo de cel of n de 25 an de l ongi t ud con agua desti l ada, y por un ext remo. Jpi peta deposi te en el i nteri or 20 m de gelati na al 2%de pB= 9,4 gotas de f enol f tal ena. Anote el col or gue tana l a sol uci n,c Ate el otr o extr emo de l a bol sa y cerci rese de que est bi en cerr ada.

m/ a f 0 1 d f Pal pi t ados de 250 m en un frasco Gerber, col oque 20 m agua desti l ada pH= 7 y adici nel e 4 gotas de fenol f tal e na. Regi st re el cque t ona l a sol uci n.e)I ntr oduzca l a bolsa de dil i si s conteni endo l a prote na dentr o del f rascoGerber con el agua desti l ada pH=&. f ^ 90 mnutos. Transcurr i do ese ti empo r egi str e l os cocr) Con P T ^ - f x t e r i o r de i i nter ior de l a bol sa de di l i s isg)Con el pot enci metr o det erm ne el pH de ambas s ol uci ones. Reg st rel o.RESULTADOSI . - DESNATURALI ZACI ON POR CALOR ( COAGULACION)un l a si guiente t abl a anote l as observaci ones t eni das en este experi mento

TUBO Despus deCal ent ar Despues de adi ci onar regul ador de acetatos pn - 4. 6

I I . -DESNATURALI ZAC ONPOR SOLVENTES ORGAN COSI ntorme en l a si gui ente tabla l os result ados que obtuvo con l os dos sol vetes uti l i zados,SOLUCI ON PROTEI CA ACETONA ETANOL

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Da3

- 1 0 8 -1 1 1 .-PRECIPITACION POR ANIONESAnote en l a t abl a sus observaci ones.

SOLUCION PROTEICA ACIDOTRICLORQACETICO ACIDOSULFOSALICILICO

I V. - D I A L I S I Suti l i ce l os dibujos para presentar l o ocurri do en este experi mento.SOLUCIONPROTEICA PRUEBA DE BIURET

ii ;u

BLAKOD( NaCl ) PRUEBA DE CLORUROS

H

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V.- EQUI LI BRI O DE D O N N A NEn l os si gui entes esquemas, represente l as observaci ones que usted t uvotanto al i nici o cono al f i nal del experi mento.

SI TUACI ON I NI CIAL

Color de l a sol uci n i nternapH de l a sol uci n i nternaColor del l qui do exteri orpH del l qui do exteri orSI TUACI ON AL EQUI LI BRI O

Color de l a sol uci n i nternapH de l a soluci n i nternaCol or de l a soluci n externapH del l i qui do exteri or

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suSECCI ON DE PREGUNTAS

BI BLI OGRAFI A CONSULTADA

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B I B L I O G R A F I A1.- Bhagavan, N. V. 1978. Bi oqum ca. Edi tor i al I nterameri -cana, S.A. 3a. Edi ci n, pp 227- 231.2.- Bohi nski, R. C. 1982. Bi oqum ca. Fondo Educati vo Intercano. 2a. Edi ci n, pp: 227- 231.3. -Macarull a, J . N. y Goi , F.M 1978. Bi onolcul as. Edi tori al Rever t, S.A. l a. Edi ci n pp: 113-114.4.- Mazur, A y B. Harrow 1973. Bi oqum ca Bsi ca. Edi tori alI nterameri cana, 10a.edi ci n. pp:87.5.- Plunmer, D. T. 1981. I ntroduccin a l a Bi oqum ca Prcti ca.Edi tor i al McGraw- H l l Lati noameri cana S. A.l a. edi ci n, pp: 47- 49 , 134- 136.6.- Ramsey, J . B. 1980. Bi olog a Qu m ca, una i ntroducci n a l aBi oqu mca. Edi tori al Conti nental , S. A .l a. edi ci n, pp: 559- 564.7. - Rendina,G 1974. Tcni cas de Bi oqum cq Apli cada. Edi tori alI nterameri cana, l a edici n, pp: 55- 60.8. -Str yer, L. 1979. Bi oqu mca. Edi tori al Revert,S.A. l a. edici n. pp 19- 20, 36. ~9. - Tbporek, M 1984, Bi oqu mca. Edi tori al I nterameri cana, S.A.3a. edi ci n, pp: 227-231.

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- 113-OBTE CI ON DE LA CASEI NA A PARTI R CE LA LECHE

I NTRODUCCI ONrecurso ^ ^ t ^ dieta huraa. Es el t ni cocidos? * * d ^ n d e S l Y crecim ento de l os ni os recirTra

L f < eShe de va c a e s 11113 f uent e f undamental de prote nas car bohi S S T ^ n ^ n^* 1 3 l as cual es se cus -t U1 ^ m Y un 0. 5%r espect i vament e.sri ca v ^ I f ^ S ? 3 6 8rUna P r ? t e n a soluble, pareci da a l a albmna -cSve a S e n a 63 Prote na conj ugada c e se i n-f l , * 6 1 ^ ^ d e l a s f osf cprotei nas, ya que al gn de los resi- ~un aci ao tost oneo caro se i l ustra enseguida:

ch 2 - CH+ I +H3N - C - H H, NI _cooSERI NA FOSFOSERI NA

Aunque el conteni do de prot e nas de l a l eche de vaca es relat- va-S ^ V L & r f d S ^ l e C h e *prote nas de ori gen ani mal ccmo l a m osi na y l a al bdmna de huevo mnt- ^n - t odos l os amnoc idos escenc ial es par a el c r e S S f eTECBJ ETIVO

I ntentronos en este experi mento separar l a cas na de l a l eche -pr ot e r a v t S t S J S ^ T 4' 8' * * 6 3 6 1 P Un t ~* * e s t ^i 6 n cuanti tati va presente en esFUNDAMENTOi ^ prote nas muest ran machas de l as propi edades anf otri cas de -^ 1 3 3 P r 0 t G n a S c c ^o r t a n ^ s i ^ Lamnoci dos, y s e i oni zan de l a msma manera, ya que l os grupos R de l os -

CH 9 - O- -CHI ce- C- HCOO

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resi duos pueden cargarse posi t i vament e negati vament e. La carqa net a deuna mol cul a de prot na depende del pH de l a sol uci n y de l a canti dad yti po de grupos "R" presentes.Cuando l a carga net a de l a prote na es cero, es deci r, el n-mero de cargas posi ti vas es i gual al numero de carqas negati vas, ent on-ces l a prot ei na no emgrar haci a ni nquno de l os pol os en un campo el ectr ico, y el pH en el que ocurr e est a si t uaci n se dencmna PUNTO I SOELECTRI COCuando una prote na, se encuent ra en una s ol uci n al cal i na con-respecto a su ount o i soel ctr i co, tendr una carga neta negati va, mentr as

que en una sol uci n ci da, con respecto a su punto i soel ctr i co, poseer -una caraa posi ti va. "Si a una soluci n de nrote na se l e a-j usta el pH al DH i soel ctr i co, l a orote na oreci oit a ce l a sol ucin, y cuede ser separada f ci l meHte. Este proceso se conoce como PRECI PI TACI ON I SOELECTRI CA, y perm t e l aseparaci n de prote nas y su posteri or puri f i caci n.La forna zw tt eri ni ca, ani ni ca y protonada de una orote nase i l ustr an enseoui da:

p HE-- COGE H* P - HH3-cocr CE ~ eoo"FORMA CATI ON CA FORMA . ZWTTERION CA FORMA AN ON CA

MATERI AL POR EQUI PO DE CUATRO PERSONAS2 vasos de preci pi t ados de 400 m2 pi petas qraduadas de 10 m1 t ermmet ro1 parri l l a elctri ca con agi taci n1 barr a magnti ca1 api tador de vi dri o1 embudo de f i l tr aci n rpi da1 mort ero2 tubos de 18 x 150i oradi l l aGasa, y dos bol sas de papel cel ofn

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REACTTVOS1.- Aci do Acti co 2M Tomar 117.6 m de HOAc concent rado y af orar a un vol mede un l i tr o con agua desti l ada.2.- HC1 2% Transf eri r 54 m de aci do clorh dri co concentrado a un matr az volmtr i co de 1 l i tr o conteni endo 300 m de acrua desti l ada, mezcl ar, y af ora3. - ETANOL4.- ETER ETI LI CO5. -NaOH 0. 1% D sol ver 0.1 gramo de hi drxi do de sodi o en 50 m de aqua destl ada y afore a 100 m con agua desti l ada. PARTE EXPERIMENTAL

1.- En un vaso de preci pi tados de 400 m, coloque 50 m de agua desti l ada.y cl i ntel a hasta una temperatura de 38C. 2.- Adi ci one 100 m de l eche y deposi t e cui dadosament e una barr a magnti ca.3.- Col oque el vaso de preci pi tados sobre una base magnti ca cercana al potenmetr o e i ntroduzca l os el ectrodos en l a solucin. ~Enci enda l a agi taci ndadosamente . Determne el pH i ni ci al y dej e el botn en l a posi ci n de pH4.- Con una pi pet a, comence a adi ci onar gota a got a Aci do Acti co 2M HC1 21 hast a que el pH de l a sol ucin sea de 4. 8 , donde ocurri r l a mxi ma prectaci n de case na.5. -Una vez obtenido el preci pit ado, detenga l a agi taci n, remueva l os el ectdos, l velos y dej el os dent ro de agua desti l ada l i mpia. La sol ucin mantgal a en reposo durante 10 m nutos

6.- Eli mne por decantaci n una buena parte del sobrenadante. La porci n restte f l tr el a a tr avs de un embudo de vi dri o cubiert o con papel f i l tr o, regiendo el f i l tr ado en un vaso de preci pit ados, el cual se eli mna.7. -El resi duo que qued en el embudo, l velo con 20 ,m de etanol agi tando cuna vari l l a de vi dri o cui dadosamente si n romper el papel .8. - Entr e vari as hoj as de papel secante, col oque el cono de papel que conti enel resi duo y desquel o presi onando con l as hoj as de papel secante.9. -El preci pit ado seco, col quel o en un vaso de preci pit ados y adi ci one 20 meter et l i co, agit e bi en l a suspensi n para desl i pi dizar l a prote na,

10. - Fi l tr e nuevamente esta suspensi n a t ravs de un ei rbudo de fi l tr acin rpcubi erto con papel fi l tro. Descart e el f i l trado. El resi duo de col or blanesl a CASEI NA.11.- Transf eri r l a.case na a un mort ero y pul veri zarl a. PESELA, y guardel a en bol sa de papel celof n.12. - En un t ubo de ensaye de 18 x 150 col oque una pequea por ci n de l a case nobteni da y di sul val a en 5 m de NaOH al 0. 1% y real i ce l a PRUEBA DE BURPRUEBA DE B URET:- A l a sol ucin protei ca, adi ci nel e 1 m del Reacti vode Bi uret, agi te y observe el col or desarr oll ado. -Corra un control posi ti vo uti l i zando al bmna de huevo.

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RESULTADOS1. - PESODE I A CASEINA OBTENI DA:2. - REPORTE EL % DE CASI NA EN GRAMDS/ 100 m DE LECHE:3. - ENTREGUE LA CASEI NA OBTENI DA, GRAPANDOLA EN EL SI GUI ENTE ESPACI O

4.- Muestr e sus r esul tados de l a prueba de Bi uretCASEINA OBTENI DA ALBUMNA DE HUEVO

Col or:Reacci n: Col or:Reacci n:

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B I B L I O G R A F I A

1. -Baum S.J . 1981. I ntroducci n a l a Qum ca Orgnica yBi olgi ca. Ccmpaa Edi tori al Conti nental , -S.A. Mxi co, l a. Publ i caci n. pp: 380.2.- l aboratory Manual . Chems t ry 3403. Pan- Ameri can Uni ver-si ty, Edi nburg Texas.3. -Macarull a, J . M y F. M Goi. 1978. Bi ol cul as. Lecci o=nes de Bi oqum ca Estr uctural . Edi tori al Revert l a. Edi ci n. pp: 115.4. -Mazur, A. y B. Harrow 1973. Bi oqum ca Bsi ca. Edtori alI nterameri cana. 10a edi ci n, pp: 46- 47.5. -Rendi r a, G. 1974. Tcni cas de Bi oqu mca Apl i cada. Edi tori al I nterameri cana, l a. Edi ci n, pp: 52-53.

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OBTEt CI ON DE ACI DOS NUCLEI COS A PARTI R DE LEVADURAS

I NTRODUCCI ONl l n M f l 2 C d OS n u c l e i c o s son pol meros de el evado peso mol ecul ar cuya -S t t T T ^ ' CP n e nt e fundamental es el MSKM OJ CTI DO, el c l -f osfri co^ nit rogenada pri ca o pir i mdi ca, una pentos, y ci do

Exi sten dos t i pos de ci dos nucl ei cos que son: el Aci do Desoxi ri bonucl ei co (DNA) y el Aci do Ri bonucl ei co (RNA). Desoxi ri bccl eo de S s ^ n ? / l o c ^i z a c l 6 n ' el ENA se encuentr a s i er r e en el nfl -n t o f r , eucar i t i c as, y en l a r egi n del nucl e oi de en l os or ga-S ^ e K 1 ^' , * * 10 3 " OT 1 ? 3 ^ mt ocondri as y el cl orosa ?' j ostr ado l a presencia de ci do desoxi ri bonuclei co l l anado ? n f aATELI TE En l as cl ulas procari ti cas, adems de su genforo exist en ne^ S f ^ 3 3 ^ C r C u l a r e s ' cadena y l u t o r e p u S S ? S Der o n r i n ^ L ' e n o on t r a r e l de las cl ulas eucari ti casper o pri ncipal ment e se encuentr a en el ci t opl asma cel ul ar. ^ l 0S ^J 3" 3 1 0 3 ecari otes, l os ci dos nucl eicos suel en asoci ar-se con prot emas bsi cas espec f i cas l l amadas HISTONAS o PROIAMINAS l as cual es neutr ali zan el caracter poli ani Sni co de l as rrol cul as, f ormando carpi d^RA ^ ^ D E ^ R 3 - N U C L W R 0 1 ^ * * ^ T 5 a 20%de ci donucl ei co?' ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ OBJETI VO Consi derando que l as l evadur as conti enen una el evada pr ooor ci n de-S %n U C e C? S ' - n S pr P naTOS Osl arl os parcial mente, fr accionarlos e -f S ^ ^ S r ^ 6 S 1 ^ * S l const i t uyenFUNDAMENTO

Exi sten mtodos especi ales para el aisl amento, puri f i caci n y medici n cuanti tati va de l os cidos nucl eicos. Entr e esto^ se i ncl uyen l ac r ^r ^t E^S ' Prec iui taci n, c ent r i f ugac in ( f i l t raci n) , hi drl i s icromatograf a y tcni cas pti cas para establecer l a canti dad de ci do nucl eco que exist e en una muest r a.

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MATERI AL POR EQUI PO DE CUATRO PERSONASl evadura de papader a (un paquete por qrupo)Bal anza granatari a2 D petas de 10 m1 pi peta de 1 m1 agi tador de vi dri o1 D nzas para tubo de ensaye1 embudo de f i l tr acin rpi da1 vaso de oreci pi t ados de 250 m1 pr obet a graduada5 t ubos de ensaye de 18 x 1501 mecher ogasa manta de ci el oPapel Hydri onPapel F i l t roREACTI VOS1.- NaOH 30% D sol ver 30 gramos de hi drxi do de sodi o en 80 m de agua desti l ada f r a, afore despus con agua hasta 100 m2. - NaOH 1 N: D sol ver 40 gramos de hi drxi do de sodi o en 800 al de agua dti l ada f r a y l uego afore hasta un l i tr o con ese solvente.3. - FeCl 310% D suel va 10 gramos de FeCl 3- 6H20 en 50 m de agua desti l ada,adi ci one 1 m de HC1 conc. Afore a 100 m con agua desti l ada4. - Etanol al 95%5. - Aci do Cl orh dri co concentrado6. - Reacti vo de Bi al7. - Aci do Sulf ri co 3 N: Aadir 8. 3 m de H2S04 concentr ado por l os paredesdel reci pi ente a un vol umen de 50 m de agua desti l ada, mezcl e cui dadosament e a medi da que se aada el ci do. Compl etar con agua hasta un vol umen de 100 m .8. - H2S04 10 N: Repi ta el procedim ento anteri or, pero uti l i ce 27. 7 m de cido sul f ri co concentrado.

PARTE EXPERI MENTALI . - SEPARACION DE LOS ACI DOS NUCLEI COS1.- En un vaso de Dreci pi t ados de 250 m , col oque 20 gramos de l evadura de pnader a, y agregue 15 m de NaOH al 30% Agi t e con una vari l l a de vi dri odurante 20 mnutos hasta f ormar una suspensi n.2.- Luego adi ci one 20 m de agua desti l ada y homogeni ce. Despus aada 10 mde FeCl . al 10%y mezcl e bien.

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L suspensi n a travs de un embudo de f i l tr acin rpi da i i rplone^ n ^ t T ^t f ^ 6 d e C ie l - ^ P l a pas ta usando par a el l o guantes de hul e. Recoga el f i l tr ado en un vaso de preci pi tados d T 250 mS" 8* a d C n f n do l e 15 m d e agua dest i l ada r ecuperando el l avadoel vaso de precipi ta dos donde recuper el f i l tr ado anteri or.^ t r a d o s entonces f i l tr e de nuevo uzando papel f i l tr o adaptado a un embudo de fi l tr acin r pi da.6. -El resi duo que qued en l a gasa eli mnelo.

7 ' t - n w e : L t ado? ac ci onele 50 m de etanol al 95%agi tando ti nuamente durante l a adi ci n.8. -Eespus aadi r con agi taci n suf i ci ente BCl concentr ado hasta aci dif i carsoluci n, uti l i ce papel hydri on para veri fi car- el pH. Con esto se consil a preci pit aci n del ci do nucl eico.

a S ^t e n i d a a ^avs d e Papel f i l t ro y l ave el resiydeschel os 1 recuperando ambos f i l t rados en un vaso de preci pi t ado10. -El resi duo que se r etuvo en el papel f i l tr o son l os ACI DOS NUCLEI COS , ucel o oara real i zar l os si guientes ensayos:

I I . - H DROLI SI S DE L OS ACI DOS NUCLEI COS1.- D suel va una pequea porci n del ci do nucl ei co obteni do, en 5 m de NaOy cal i ente en bao de agua hi rvi ente durante 15 m nutos. Enf ri e.2.- Aci dif i que l a soluci n hasta un pH=3.5 con HC1 0. 1N, manteni endo de tude ensayo en un bao de hi el o. Con este hi drol i zado efecte l a:

PRUEBA DE BIALa) En un t ubo de ensaye de 18 x 150, col oque 3 m del Reacti vo de Bi al , y a1 m del hidrol i zado anteri or. Cali ente al mechero con agi taci n, hasta ql as pri meras burbuj as al cancen l a superfi ci e. Cbserve el col or desarroll apor l a sol uci n. Antel o.I I I . - I DENTI FI CACI ON DE FOSFATOS

Prepare al mement o l as si gui entes sol uciones:i ) M0LI BDAT0 DE AMDNI O AL 2.5% D suelva 2.5 gr anos de nol i bdat o de amoni o ende agua desti l adas. Col oque 30 m de H2SO I ON en un mat r az de af oraci n dagregel e l a sol ucin de mol i bdato y di l uya a 100 m con agua dest i l ada .Mbi en, y guarde l a sol ucin en un f rasco de ambar baj o refr i geraci n.i i ) CIORURO ESTANNOSO: D suel va SnCl 2. 2H20 en HC1 6M Decante y al decantaade granal l as de estao.l . - En un t ubo de ensaye de 18 x 150 col oque una porci n del aci do nucl ei co cni do. Aada 2 m de H2So 4 3N. H erva l entamente durante 5 mn para hidrl i zel acido nuclei co. Enfr i e.

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i xa-,

S i dU i W 3X13

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flLf ChiILIK?nxoul'

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2. -Transfi era 1 m de este sol ucin a un t ubo de ensaye de 18 x 150 y aad0.5 m de H2S04 I ON, 1 m de sol uci n de moli bdato de anoni o al 2. 5% y5 gotas del reacti vo reductor de cl oruro estannoso. Dej e reposar durant10 m nutos. Cbserve el color desarrol l ado. Antel o.Corra un contr ol uti l i zando una sol ucin de KHJ PO 0.1M y ot ro controlnegati vo uti l i zando agua desti l ada cerno muestr a.

RESULTADOS1. -Anota ensegui da l as caracter si cas fi si cas del ci do nucl eico obteni do:

2-En l a si gui ente tabl a anota l os col ores desarr oll ados por l as di f erentesmuestr as al efectuar l as pruebas seal adas.

-PRUEBA BI OQUI M CA

. . .

H DROLI ZADO rnNFTOnT. Anm(AC. NUCLEI CO) POSI TI VOPRJEBA DE BI AL

PRUEBA DE FOSFATOS

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'

sfoen6 v 051 x 81 sb ' Vaans 9b x r7 s aoxau . os nv l e oi rran9b atf i bdi an '.a otxsii j b i saoqsi 9 9(3 .oaofi us BQ exn&f co sJ.oJktri A .. obsl i ansBeb i c \r_Xc tfico occto Y M1. 0 C-L.HN et f d o 'Xof ,nx o.BUzaum a tDD i bk t i t s abS..

res -:3bwn r "39XJBf t BT im r mdti ec un d.ij vio'oesi I sb 86dt3g c- sadD .attufm Q u Xox noo nt/ . sxto'dbn&sxl xx; ccvxfi p.' ;

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J STM ) OG LJn I , J ,:! r mfri jovi Ti aoq '1 mmr xm. Aj 'ja "je Asai H ^

-124-

DISCSION

CONCLUSIONES

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' t e

fmxmt

33MO .

-125-SECCI ON DE PREGUNTAS

BI BLI OGRAFI A CONSULTADA

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