13C anazila metabolnega fluksaPREGLED OSNOVNEGA KONCEPTA

Zakaj 13C? Univerzalnost napovedi?• Izjemna podobnost osnovnih metabolnih procesov med živimi bitji

• Ogljik kot osnova življenja

• Omejenost stehiometrične analize metabolnega fluksa (Metabolic Flux Analysis – MFA)

• 2 GLAVNI PREDPOSTAVKI:

1. Encimi ne zaznajo menjavo izotopa in delujejo enako za vse (obstajajo izjeme)2. Znotraj celičnih kompartmentov ne obstaja difuzijskih omejitev, intermediati pa so dobro

premešani

= Izotop 13C lahko nadomesti običajni izotop 12C! (Kaj je izotop? Posebnosti 13C?)

Stehiometrična MFA• Osnovna predpostavka za večino MFA :

SISTEM JE V STACIONARNEM oz. RAVNOTEŽNEM STANJU (Drži za kontinuirne kulture in delno tudi za fazo eksponentne rasti)

• Možne le meritve celičnega vnosa in iznosa

• Opis fluksov z stehiometričnimi reakcijami. Primer: q + v = u, v = w, w = p, p + q = r + v

= Rešljivo, če lahko merimo dva fluksa

POMANKJIVOSTI:• Nezmožnost napovedi fluksa

v znotrajceličnih metabolnihpoteh.

IzotopomereIZOTOP + IZOMERA = IZOTOPOMERA

Izotopomere so vse 13C označene oblike metabolnega intermediata, ki jih najdemo v vzorcu.

izotopomere

izotopaMolekula:• n ogljikovih atomov• 2n možnih izotopomer

n = 323 = 8 izotopomer

Princip ugotavljanja metabolnega fluksa• Preden pričnemo z MFA poznamo in razumemo encimsko vodene metabolne reakcije

• Vsaka reakcija specifično spremeni 13C označen substrat (Glikoliza vs. Pentoza Fosfatna Pot?) SPECIFIČNA REAKCIJA USTVARI ZNAČILNO ONAČENE INTERMEDIATE = izotopomere

Nastanejo „intermediatni vzorci“

Razmerje izotopomerposameznega intermediatavsebuje informacije o METABOLNEM FLUKSU

Čas je pomemben dejavnik• Različna hitrost sinteze molekul v celici = različna hitrost integracije 13C

metaboliti glikolize < metaboliti TCA cikla < proste aminokisline < proteini

• Vzpostavitev stacionarnega stanja

• „Izpiranje“ molekul, ki še ne vsebujejo 13C izotopa (ni nujno)

• NE POZABI: V kakšni fazi rasti so celice?

Metodi za eksperimentalne meritveNuklearna magnetna resonanca – NMR

• Starejša, manj občutljiva, dolgotrajna, zahtevnejša

Masna spektrometrija – MS

• Novejša, bolj občutljiva, kratkotrajna, popularnejša

• Sklopitev z kromatografijo (običajno plinsko)

Izračunavanje fluksa iz zbranih podatkov• Delo matematikov in informatikov? (prosto dostopni programi na spletu)

• Obstajata dva načina:a) globalni (bolj celosten, a zelo občutljiv na napake)b) lokalni (manj celosten, manj občutljiv na napake)

združuje metabolne poti, izoencime,…

• Preverjanje izračunanega modela fluksa s pomočjo laboratorijskih raziskav.npr. knock-out gena za metabolni encim Model MORA zmanjšati fluks prek tega encima.

• Sledijo ponovitve izračunov in poskusov, prilagoditve parametrov in na koncu še dodatne statistične analize

Možni zapleti• Naravno prisotni izotopi

• Tehnični zapleti pri večjih globalnih izračunih

• Napačni metabolni zemljevidi

• Zapleti na merilnih napravah

• Slabo predhodno definirano:a) lokacije metabolnih reakcij (organeli)b) transport med celičnimi kompartmenti

• Uporaba več različnih 13C substratov (dvoumni rezultati)

• Uporaba biosintetičnih substratnih približkov

model z dodanoglioksilatno potjo

model brez dodaneglioksilatne poti

Potek 13C analize metabolnega fluksa1. Osnovna in silico napoved metabolnega fluksa

2. Priprava celic oz. celične kulture

3. Ugotavljanje prejetega in „izvržnega“ fluksa

4. Hidroliza celic

5. (opcijske izolacije posameznih celičnih frakcij)

6. Meritve s pomočjo MS (masne sprektrometrije) ali NMR (nuklearne magnetne resonance)

7. Analiza eksperimentalnih podatkov

8. Rekonfiguracija in optimizacija in silico predikcije

9. Statistična analiza

lokalni izračun globalni izračunprotokol