15.efecto del plasma rico en plaquetas en celulas del ligamento periodontal in vitro

7/25/2019 15.Efecto Del Plasma Rico en Plaquetas en Celulas Del Ligamento Periodontal in Vitro

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6 Revista Estomatologa

RESUMEN

Introduccin: La Gingivitis y la Pe-riodontitis son entidades inflamatoriascrnicas frecuentes en nuestra poblacin.La respuesta de los tejidos periodontalesante estas entidades, son el resultado de

la respuesta del husped frente a la biope-lcula formada sobre la supercie dental,

adyancente al tejido gingival.La severidad con la que puedan presen-tarse, es producto de la composicin del

biolm, junto a la presencia de factores

que puedan modicar la respuesta del hos-pedero, factores locales que predisponganla colonizacin bacteriana, hbitos, y stresentre otros.La interaccin entre mecanismos de defen-sa del husped y la liberacin de factoresde virulencia y mecanismos de evasin

por parte de periodontopticos, provocanuna destruccin no controlada de huesoalveolar y migracin del epitelio de unin;

por lo tanto es importante dirigir estrategiasteraputicas a nivel celular y molecular paraobtener la regeneracin de los tejidos perdi-dos. La terapia periodontal se ha enfocadoen detener la progresin de la enfermedad;Recientemente se busca mayor xito enregeneracin periodontal, al usar PRP, elcual tiene factores de crecimiento.Objetivo:Este estudio determin el efectosobre la proliferacin en FP, al ser expues-tos a diferentes concentraciones de PRP

obtenido de un Banco de Sangre.Met odologa: Se trabaj con cultivoscelulares (FP) de la Asociacin Banco yCentro para la Investigacin de CultivosCelulares In Vitro, Facultad de Salud, dela Universidad del Valle, y con el apoyodel Hemocentro de la Cruz Roja para ob-

tener PRP. Se utiliz el Kit XTT. paradeterminar la actividad metablica de losFP, frente al PRP a concentraciones de 10,15 y 20%.Resultados:La actividad celular en todaslas concentraciones fue signicativa hasta

las 72 horas, mayor que los controles SFBy FGF.Conclusin: El PRP obtenido en bancode sangre local tiene efectos positivos enFP in vitro.

Palabras Clave:Factores de crecimiento,

factor de crecimiento derivado de plaque-tas, ligamento periodontal, broblastos,

regeneracin tisular guiada, plasma rico enplaquetas, cicatrizacin.

SUMMARYIntroduction:Gingivitis and Periodontitisare the common inammatory diseases in

our community. The reaction of the pe-riodontal tissues results of the interactionof the hosp defense at the biolm formed

around the teeth and the gingival tissue.The severity of this entity depend of thecomposition of biolm and local or sys-temic factors can promote the bacterialcolonization or behavioral componentslike tobacco and stress can be modied the

individual response.Interaction between defense response byhosp and evasion mechanism by perio-dontopathogens plays an important role

Efecto del plasma rico en plaquetas en celulas delligamento periodontal in vitro

In vitro effect of platelet rich plasma on periodontal ligament cellsGail M. CLAVIJO1, Paola A. PINILLOS1, Oscar GUTIRREZ 2M.D., M.Sc.1. Periodoncista Universidad del Valle , 2. Profesor Asistente, Jefe Seccin de Farmacologa, Escuela de Ciencias Bsicas - Facultadde Salud Universidad del Valle.

Recibido para publicacin: Enero 31 de 2007.Aceptado para publicacin: Mayo 16 de 2007.Correspondencia:P. A. Pinillos, Universidad del Valle.Facultad de Salud.(e-mail: [email protected])

in the pathological process of alveolarbone destroy and migration the junctionepithelium.The periodontal therapy purpose is arrestthe disease progression. Recently in anattempt to increase the succes rate in re-generative procedures, it has incorporated

the use of platelet-rich plasma. It involvesthe growth factors that are proposed asenhancers of tissue regeneration of the

periodontal tissues.Purpose: The purpose of the study wasto evaluate the response of periodontalbroblasts (PF) at different concentration

of platelet rich plasma in vitro.Metodology:Cellular cultures of PF wereobtained from In Vitro Research Centerand PRP was get from the Hemocentro ofthe Red Cross, and dilutions were made toobtain concentrations to 10, 15 and 20%.

They were compared with 2 controls of 5%bovine fetal serum (BFS) and broblastic

growth factor (FGF). In order to determinethe metabolic activity of the FP stimulated

by PRP, Kit XTT was used.Results: Findings suggest that a higherconcentration of PRP results in positiveeffects on cellular growth and signicantly

increase in proliferation of FP at concen-tration of 20%.Conclusions:PRP resulted in positiveeffects on periodontal broblasts.

Key words:Growth factor, platelet derivedgrowth factor, periodontal ligament, bro-

blasts, guided tissue regeneration, plateletrich plasma, healing.

INTRODUCCIN

La regeneracin tisular guiada (RTG) se

R E V I S T A

ESTOMATOLOGIARevista Estomatologa 2007; 15(1):6-12


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basa en el aislamiento total de los tejidosgingivales conectivo y epitelial del rea

periodontal en cicatrizacin, con el n de

facilitar la repoblacin in situ de clulastanto del ligamento periodontal como del

hueso alveolar. Estos principios se consi-guieron mediante la utilizacin de barrerasfsicas, como las clsicas membranas dePolitetrauoretileno expandido (ePTFE).

Recientemente se ha comprendido muchomejor la regulacin celular mediante fac-tores de crecimiento y esto aporta nuevasopciones para el tratamiento regenerativodel tejido periodontal perdido (1,2).

Despus de una herida en el periodonto,las clulas que se originan tanto a partirdel ligamento periodontal como del tejido

conectivo gingival pueden repoblar el reaadyacente a la herida e incluso, la super-cie radicular expuesta. Estudios in Vitro

realizados previamente, sugieren que losbroblastos gingivales tienen una ventaja

competitiva para repoblar la zona ya quemigran ms rpidamente que las clulasdel ligamento periodontal (3).

Isidor et al. en 1985 y Karring et al. en1986 (4,5), observaron que las clulas delligamento periodontal, son las responsablesde la regeneracin del periodonto. Se ha

encontrado que durante la cicatrizacin pe-riodontal, si las clulas del tejido conectivogingival migran sobre la raz tratada, pue-den producir resorcin radicular, mientrasque cuando son las clulas del ligamento

periodontal las que migran selectivamentesobre la supercie radicular se ha observa-do una regeneracin periodontal funcionale histolgica.Gamal y Mailhot en 2000 y Mac Cullochet al.en 2000 (6,7), han enfocado el papelde los factores de crecimiento en la regula-cin de los eventos celulares crticos parala cicatrizacin.

Los factores de crecimiento controlanprotenas reguladoras del ciclo vital de lasclulas. En todas y cada una de las clulasdel organismo se encuentra presente unsistema ms o menos complejo de protenasreguladoras que controlan su ciclo vital

(crecimiento, reproduccin y muerte). Lasfunciones de los factores de crecimiento hasido estudiada sobre varios tipos celulares,

pero los broblastos del ligamento perio-dontal son el nico tipo celular del tejido

conectivo con caractersticas importantesen la regeneracin tisular, entre ellas:

a. Tienen aumentada la tasa de polariza-cin celular con organelas bien organi-zadas, las cuales proveen una actividadsinttica eciente de los componentes

de la matriz extracelular (7,8).b. Alta rata de sntesis de colgeno y la

ms eciente polimerizacin de mo-lculas colgenas nuevamente forma-das.

c. Propiedades osteoblsticas.

d. Capacidad de involucrarse en cemento-gnesis (1,8).

La comprensin de la secuencia de loseventos y de tipos celulares especcos

constituye una parte importante para eldesarrollo de tcnicas para la regeneracinde tejido periodontal perdido.

Esta investigacin busca evaluar la proli-feracin de las clulas del ligamento perio-dontal in Vitromediante el uso de plasmarico en plaquetas, ya que su contenido en

factores de crecimiento, aumenta la tasade proliferacin de clulas del ligamento

periodontal, para lograr un efecto sinrgicoen la regeneracin periodontal.

Este estudio recibi la aprobacin, delComit de Etica Humana, considerandosegn la categora de riesgo como mayoral mnimo.

MATERIALES Y MTODOSRecoleccin y preparacin de las muestras

Se escogieron 4 pacientes adultos saluda-bles, para toma de muestras de sangre en elHemocentro de la Cruz Roja. Posteriormen-te por medio de plasmafresis discontnua,siguiendo los protocolos establecidos porel laboratorio, se obtienen hemoderivados,entre ellos el concentrado de plasma ricoen plaquetas.

Cultivos celulares

Para nuestro estudio se emplearon cultivosde broblastos periodontales (FP) de la

Asociacin Banco y Centro para la Inves-

tigacin de Cultivos Celulares in Vitro,Facultad de Salud, de la Universidad delValle que los haba almacenado despusdel pase 6 de crecimiento en termos connitrgeno lquido. Para realizar el anlisis,

previa descongelacin de las clulas, seutilizaron broblastos periodontales en fase

7 de crecimiento.

Descongelacin de los FibroblastosPeriodontales

En un bao Mara y a 37 grados centgrados

se descongel un criovial de pase 6 quecontena 6 x106 clulas.

Las clulas se recuperaron por centrifuga-cin a 1500 rpm durante diez minutos; enseguida se determin el nmero de clulasdescongeladas por el mtodo de exclusincon azul tripam y se sembraron a unaconcentracin de 20.000 clulas por cm2en botellas de cultivo T-25 (FALCON) conmedio de crecimiento (Medio Modicado

Eagles Dulbeco (DMEM), suplementadocon 10% de Suero Fetal Bovino (FBS) , 2

mM de L-glutamina, estreptomicina (100mg/L), la penicilina (100.000 U/L) y 0,25mg del amphotericin B.

Las clulas dentro de las botellas de cultivofueron puestas a crecer en Incubadora conCO

2a 37oC. Despus del segundo o tercer

da in vitro (2-3 DIV) se les realiz cambiodel medio de crecimiento (previamentedescrito). Los cultivos fueron observadosdiariamente hasta obtener una conuencia

total del 100%.

Una vez obtenida la conuencia de las

clulas (7 DIV), se lavaron 3 veces conPBS por 5 minutos, posteriormente a cada

botella de cultivo se le adicionaron 2 mL.de solucin de tripsina/EDTA al 0,25% y seincubaron por 5 minutos a 37oC. Terminadoel tiempo de incubacin las clulas fueronobservadas al microscopio para vericar


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el desprendimiento celular. Cuando lasclulas se desprendieron se les adicionaron5 mL. del medio de crecimiento para inhibirla accin de la tripsina, el volumen total delmedio con los Fibroblasto Gingivales fue

transferido a un tubo para centrifuga de 10mL. a travs de una pipeta serolgica de5 mL., las clulas fueron centrifugadas a1500 rpm por 5 minutos, el sobrenadantese descart y el pellet de clulas se resus-

pendi en 10 mL. del medio de crecimientoy a continuacin se determino el nmerode clulas por mtodo de exclusin conazul de tripam.

Se ajusto el nmero de clulas a una con-centracin nal de 20.000 clulas por cada

200 L. y se depositaron en cada uno de los

pozos de la placa de cultivos de 96 pozos.La placa de 96 pozos en las que se sembra-ron las clulas fue incubada a 37oC en incu-

badora con CO2durante toda la noche.

Conteo celular

La determinacin del nmero de clulastanto para la siembra, como para los pa-ses se realiz por el mtodo de exclusincon azul tripam. Este mtodo consiste enrealizar una dilucin 1:10 de las clulas

aisladas (se diluye 0.1 mL. de clulas en0.9 mL. de azul de tripam) . La dilucin secoloca en una cmara de conteo celular y

bajo microscopio se determina el numerode clulas vivas y muertas.

El mtodo de exclusin con azul de tripampermite diferenciar las clulas vivas (sonaquellas que durante la observacin almicroscopio se ven normales porque porsu membrana celular impermeable no ad-quieren el colorante) de las clulas muertasque durante la observacin al microscopiose ven azules, por que en ellas si hay per-meabilidad de la membrana.

Condiciones ptimas de los Cultivos

Incubacin a 37C en una atmsfera hu-midicada con 5% de CO

2, con cambio

del medio de crecimiento celular cada 2 a

3 das hasta que se observe la conuencia

de la monocapa celular.

CARACTERSTICAS DE LOSFIBROBLASTOS EN CULTIVO

Los broblastos periodontales (FP) in Vi-tro, presentan una velocidad de crecimientosemejante a todas las clulas mesenquima-les, es decir; cuando inicialmente las clulasson aisladas del tejido, tienen un promediode 25 das para generar la monocapa celu-lar, al realizar pases, tienen un promediode formacin de monocapa celular deaproximadamente 4 das .

La morfologa de los Fibroblastos Perio-dontales presenta un citoplasma alargado,

delgado con ncleos grandes, muestranuna alineacin en forma de paquetes o deremolinos caractersticos de su funcin desoporte, debido a los subsecuentes pasesrealizados durante el proceso de aislamien-to de estas clulas, se ha visto que tienenla propiedad de ser muy homogneas en eltiempo post cultivo in vitro.

Ensayo de Proliferacin Celular con el Kitde XTT ROCHE

Este ensayo se basa en el cambio de las

sales del tetrazolium del XTT a un coloranaranjado del formazan por la actividadmetablica de las clulas. Esta conversinocurre solamente en clulas viables. Lacoloracin del formazan formado es solu-

ble en soluciones acuosas y se cuantica

directamente usando un espectrofotmetrode multiplicas (lector de ELISA).Se indujo el crecimiento celular, en una

placa de cultivo de tejido de 96 pozos, seincuban con la solucin amarilla de XTT(concentracin nal 0.3 mg/mL.) por 4-24

h y durante el procedimiento de anlisis.Despus de este perodo de incubacin, segenera la solucin de formazan de coloranaranjado, que se cuantica espectro fo-tometricamente usando un lector de placasde ELISA.

Un aumento en el nmero de clulas vivasda lugar a un aumento en la actividad

total de dehidrogenasa mitocondrial enla muestra. Este aumento se correlacionadirectamente con la cantidad de formazanque se ha formado (color anaranjado).

El anlisis fue diseado para la cuantica-cin espectrofotomtrica del crecimientoy de la viabilidad de las clulas sin el usode istopos radiactivos. Se utiliza parala medida de proliferacin de las clulasen respuesta a diferentes factores, comocitoquinas y factores de crecimiento, entreotros.

Metodologa del la prueba de XTT, paraproliferacin celular

Los FG se crecen en las microplacas de cul-

tivo celular, de 96 pozos, con fondo plano,con un volumen nal de 200 l de medio

de cultivo fresco, segn las necesidades delos FG por el medio de crecimiento, se deberealizar en una atmsfera humidificada(37C, 5% CO

2).

Despus del perodo de incubacin inicialse retira todo el medio y se lavan las clulascon solucin de PBS 3 veces por 5 minutos,

posteriormente se adiciona a cada pozo 50l de la mezcla de XTT, se adiciona 100l del medio de crecimiento, generando

una concentracin final de 0.3 mg/mLde XTT. La placas se incuban de 24 a 96h en atmsfera humidicada (37C, 5%

CO2). Las mediciones de la absorcin se

realizan cada 24 horas usando el lector demicroplacas para vericar la proliferacin

celular de los FG en presencia de la resinacon los respectivos controles de crecimien-to, un control alto de crecimiento, dondelos broblastos son activados con factor

de crecimiento bsico para broblastos y

un control bajo, al cual se le disminuye laconcentracin de Suero Fetal Bovino del10% al 5%, adicionalmente se toma uncontrol blanco, que solo contiene medio decrecimiento, pero son clulas.

RESULTADOS

Las pruebas estadsticas utilizadas paracomparar los diferentes medios y con-


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centraciones fueron: Anlisis de Varianzaparamtrico de un factor con un nivel designicancia < 0.05, para aquellas variables

que tuvieron una distribucin normal; yen el caso del PRP que su distribucin fue

diferente a la normal se utiliz el Anlisisde Varianza no paramtrico de KruskallWallis, se utiliz tambin como pruebascomplementarias POSANOVA de Bonfe-rroni y Sheffe.

Proliferacin de broblastos

Para el anlisis estadstico, como primeramedida, se realiz una prueba de normali-dad para determinar si los datos obtenidosen cuanto a proliferacin celular tuvieronuna distribucin normal; la anterior prueba

mostr que los resultados de Plasma sinplaquetas (PSP), y los controles negati-vos suero fetal bovino (SFB) y factor decrecimiento fibroblstico (FGF) tienenuna distribucin normal, los resultados dePlasma rico en plaquetas (PRP) tienen unadistribucin diferente a la normal.

Proliferacin celular en respuesta a PRP

Se evalu la proliferacin de broblastos

periodontales en 3 muestras de plasma ricoen plaquetas a concentraciones de 10%,

15% y 20%, y se compar con la respuestacelular a SFB y FGF al 10% y 5 % comocontroles alto y bajo respectivamente.Se realizaron lecturas a las 6, 24, 48, 72,96, 120 y 144 horas.

Respuesta celular dependiente de tiempoy concentracin

Se compar si existieron diferencias en laproliferacin celular a diferentes tiempos6, 24, 48, 72, 96, 120 y 144 horas. Alcomparar PRP y los controles negativos(SFB, FGF) se encontr una diferenciaestadsticamente signicativa entre las 6

y 24 horas que muestra una mayor proli-feracin celular al adicionar PRP. En laslecturas realizadas posteriormente no seencontraron diferencias estadsticamentesignicativas.

La proliferacin celular en respuesta a unaconcentracin relativamente elevada dePRP al 20% fue evaluada a las 6, 24, 48, 72,96, 120 y 144 horas, y se observ el picode proliferacin celular a las 24 horas. Esta

tendencia se mantuvo a lo largo del periodode observacin. Sin embargo al compararla tasa de proliferacin entre los controlesSFB y FGF se observ una respuesta celular

poco signicativa (Figura 1).

Cuando las clulas fueron expuestas a PRPa una concentracin del 15 % se observun comportamiento similar en todas lasmuestras incluyendo el control de FGF; la

proliferacin se mantiene hasta la ltimalectura (Figura 2).

La mayor tasa de proliferacin se observ alexponer los FP a una concentracin de 20%de PRP. Al compararlo con los controles ylas otras concentraciones se observ unadiferencia signicativa. El mximo incre-mento en proliferacin celular se obtuvoen el da 5 (Figura 3).

Al hacer una comparacin intergrupal en lalectura realizada a las 6 horas se observuna proliferacin celular marcada al adi-cionar PRP a las diferentes concentraciones(20%, 15%, 10%) comparado con el grupo

sin PRP (SFB, FGF), sin embargo las dife-rencias ms representativas se observaronal adicionar PRP al 20% .En la Figura 4, el eje Y muestra la densidadptica y el X los das en la cual se observanlas diferencias entre las muestras. Las demayor proliferacin celular fueron estimu-ladas con PRP, las siguientes 3 muestras sonlas estimuladas con plasma sin plaquetasy las dos con menor proliferacin fueronlas estimuladas con FCF y SFB respec-tivamente.

Cuando se realiz la lectura a las 48 horas,aunque se observa una tendencia de cre-cimiento celular, sta no es tan marcadacomo la lectura anterior. La respuesta

proliferativa encontrada revela un ligeroincremento que no es tan signicativo como

en las primeras 24 horas. Este comporta-miento se mantiene hasta las 72 horas lo

cual demuestra que el PRP tiene un efectopositivo en la proliferacin celular, aun alas 72 horas (Figura 4).

A partir de las lecturas siguientes 96, 120

y 144 horas se observ una tendencia ala estabilizacin de la poblacin celular,lo cual puede sugerir que la proliferacinde broblastos periodontales se detiene al

establecerse la monocapa (Figura 4).

DISCUSIN

En los eventos de regeneracin periodontalinteractan diferentes grupos celulares, porlo tanto, es importante la investigacin demtodos que tengan inuencia directa en la

velocidad de cicatrizacin. Los broblastos

periodontales son las clulas necesariaspara la regeneracin periodontal. Variasinvestigaciones se han enfocado en la eva-luacin de los factores de crecimiento queactan como protenas reguladoras en el

proceso de cicatrizacin en diferentes lneascelulares humanas in Vitro (8-10). Estosmediadores biolgicos naturales ejercensu efecto en la migracin, diferenciacin ysntesis de matriz celular. Los resultadoshan sido contradictorios ya que algunos es-tudios in vitro no encuentran una respuesta

positiva dependiente de la dosis del PRP, al

ser comparado con los controles (11).Annunziata et al.en 2005 (12) realizaronun estudio para observar las interacciones

biolgicas entre el plasma rico en plaquetasy las clulas periodontales (del ligamento

periodontal, broblastos gingivales y que-ratinocitos). Los resultados presentarondiferencias en el crecimiento siendo mayorla proliferacin en las clulas del ligamen-to periodontal, moderado en broblastos

gingivales y mnimo en queratinocitos.Concluyen la importancia del uso del PRPen las cirugas periodontales para acelerarla cicatrizacin de los tejidos blandos.

Kawase et al.en 2005 (13) observaron laexpresin del colgeno tipo 1 de las clulasdel ligamento periodontal es estimulada

por el bringeno que se encuentra dentro

del PRP, este incrementa la actividad dela fosfatasa alcalina y provee un numero


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de efectos potentes sobre las clulas delligamento periodontal.Es racional pensar que a mayor concen-tracin de plaquetas hay mayor cantidadde factores de crecimiento pero no es muy

claro la cantidad precisa de cada factorliberado por plaquetas, como una medidaestndar. Un estudio experimental (14) re-

port que la cantidad de plaquetas viables,diere segn el protocolo utilizado para su

obtencin y as mismo vara el contenidode factores de crecimiento.

Existen varios reportes de la aplicacinclnica de PRP al combinarlo con injertosseos para obtener regeneracin. Al inte-ractuar una fuente celular autgena, plaque-tas concentradas que aseguran los factores

de crecimiento e injertos o sustitutos seos,los cuales sirven como andamiaje para lamigracin celular; facilitan el proceso decicatrizacin en un menor tiempo (15-18).El PRP tambin ha resultado exitoso en eltratamiento de defectos infraseos, en loscuales se encontraron cambios estadsti-camente signicativos a los seis meses

en relacin a la profundidad de la bolsa,recesin y nivel clnico de insercin (19).Otro estudio similar evalu el efecto a las12 semanas y adems de datos clnicos yradiogrcos, se realiz evaluacin histo-

lgica mediante biopsias obtenidas en laciruga de reentrada, en las cuales se ob-serv neoformacin sea. Las diferenciasfueron estadsticamente signicativas al

compararlas con el grupo control (17).

El efecto del FCDP en la proliferacin yquimiotaxis de los broblastos periodon-tales se ha estudiado ampliamente, sindeterminar la concentracin necesaria paraobtener una mxima respuesta celular. Serealiz un estudio in Vitro en clulas stemestromales (SSC), estudio en el cual losautores determinaron que la concentracinmnima requerida para obtener una marcada

proliferacin y diferenciacin celular eraPRP al 10%. Una vez retirado el estmu-lo las clulas retornan a una velocidadde proliferacin regular, pero las clulasmantienen la informacin para diferencia-cin hacia diferentes linajes. Lo anterior

PROLIFERACIN CELULAR 20%

0

1000

2000

3000

4000

6 24 48 72 96 120 144

TIEMPO EN HORAS

DENSIDAD

OPTICA

(D.O)

PRP

PSP

Figura 1. Muestra momento mximo de proliferacin celular y estabilizacin

PROLIFERACIN CELULAR 72 A 144HORAS

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

20%

15%

10%

20%

15%

10%

20%

15%

10%

20%

15%

10%

72 96 120 144

TIEMPO EN HORAS Y CONCENTRACIN

DENSIDADOPTICA

(D.O)

PRP

PSP

Figura 3. Se observa estabilizacin de la proliferacin de broblastos periodontales FP apartir de las 72 horas

PROLIFERACIN CELULAR 15%

0

1000

2000

3000

4000

6 24 48 72 96 120 144

TIEMPO EN HORAS

DENSIDAD

OPTICA

(D.O

)

PRP

PSP

Figura 2. Muestra un comportamiento similar al exponer FP a una concentracin dePRP al 20%, comparado con los controles negativos


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En el estudio que aqu se reporta la acti-vidad metablica de las clulas frente alas diferentes concentraciones (10%, 15%y 20%) fueron signicativas hasta las 72

horas cuando se compar con los controles

negativos de SFB y FGF; a partir de stemomento se inicia un periodo de estabili-zacin en la poblacin celular, el cual se

puede deber a que, una vez establecida lamonocapa, la proliferacin celular se detie-ne. No sabemos si despus de transcurrir las72 horas hubiera mayor proliferacin, porlo tanto se sugiere realizar estudios con unamenor poblacin celular como base.

CONCLUSIONES

Nuestro estudio demuestra que el plasma

rico en plaquetas (PRP) obtenido de Ban-cos de sangre local, es una alternativa detratamiento en la regeneracin periodontal,ya que adems de modular la proliferacincelular de manera selectiva para Fibroblas-tos Periodontales como se reporta en otrainvestigacin (11) tiene la capacidad desuprimir la proliferacin celular epitelial, locual es una gran ventaja cuando buscamosla regeneracin periodontal, por lo tanto suaplicacin clnica es una practica segura

para obtener resultados positivos.

1. Los hallazgos de ste estudio sugierenque el PRP a una concentracin al 20%aumenta signicativamente la prolife-racin de FP.

2. La actividad celular frente a concen-traciones de 10%, 15% y 20% fueronsignicativas hasta las 72 horas, mayor

que los controles SFB y FGF.3. No hubo un incremento signicativo

despus de las 72 horas, momento a par-tir del cual se observa una tendencia a laestabilizacin de la poblacin celular.

4. La estabilizacin de la poblacin celularpuede deberse a que una vez establecidala monocapa la proliferacin celularse detiene. Sera interesante en futurostrabajos sembrar en pozos de mayortamao para determinar si sta proli-feracin se contina ms all de las 72horas.

5. La mxima concentracin utilizada

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

1 2 3 4 5 6 7

Serie1

Serie2

Serie3

Serie4

Serie5

Serie6

Serie7

Serie8

Figura 4. El eje Y muestra la densidad ptica y el X los das , aqu se observan las diferen-cias entre las muestras. Las de mayor proliferacin celular fueron estimuladas con PRP, lassiguientes 3 muestras son las estimuladas con plasma sin plaquetas y las dos con menorproliferacin fueron las estimuladas con FCF y SFB respectivamente

indica que el efecto mittico del PRP estransitorio, lo cual es clnicamente desea-

ble para disminuir la aparicin de efectossecundarios (10). Dentro de las limitacionesdel estudio los autores no evaluaron losefectos biolgicos del PRP a concentracio-nes ms elevadas, pero en nuestro estudio

se evalu el efecto del PRP hasta un 20%,cuando se obtuvo una respuesta positivadosisdependiente y, por lo tanto, una

mayor proliferacin celular.Mediante anlisis enzimtico y PCR serealiz una investigacin in vitro paraevaluar el contenido de factores de creci-miento y su efecto biolgico y molecular,cuyo resultado sugiere que el TGF-, puede

favorecer la diferenciacin de osteoblastosy cementoblastos, adems de la produccinde bronectina, una molcula involucrada

tanto en la adhesin de broblastos a la

supercie radicular como en el proceso de

angiognesis (9,10).

Accin biolgica de broblastos periodon-tales in vitro en respuesta al PRP

El diseo de esta investigacin permitievaluar la respuesta de los fibroblastos

periodontales (FP) a diferentes concentra-ciones de PRP, medio en el cual las clulasse mantuvieron en continua actividad, encomparacin con SBF y FCF.

En otro estudio in vitro donde se comparael efecto de PRP en poblacin celular debroblastos gingivales y periodontales conrespecto a la proliferacin, se observ unasignicativa respuesta de los FP mientras

que en los FG hubo una ligera tendencia ala inhibicin en la actividad proliferativacuando se incrementaron las concentracio-nes de PRP (20).

El presente estudio mostr una respuestacelular altamente proliferativa al exponerlos FP al PRP, con una concentracindel 10% y un mayor incremento en laconcentracin de PRP estimul an msla proliferacin celular. Estos hallazgoscontradicen los obtenidos en un estudioreciente (17) ya que en este no encontrarondiferencias estadsticamente signicativas

en cuanto a crecimiento, proliferacin, ofuncin celular, en broblastos gingivales,

ni osteoblastos, al realizar lecturas hasta las72 horas y 21 das respectivamente.


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en este estudio fue al 20% y fue en laque se obtuvo una mayor proliferacincelular, se sugiere realizar futuros es-tudios con mayores concentraciones

para determinar si el efecto en cuanto

a proliferacin celular es directamenteproporcional a la concentracin.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecemos la valiosa cola-boracin de la Asociacin Banco y Centropara la Investigacin de Cultivos CelularesIn Vitro, Facultad de Salud, Universidaddel Valle y al Bacterilogo Dr. WilliamCriollo por su incondicional acompaa-miento y asesora para la ejecucin de stainvestigacin.

REFERENCIAS

1. Oates TW, Rouse CA, Cochran DL.Mitogenic Effects of Growth Factors onHuman Periodontal Ligament Celis InVitro. J Periodontol 1993; 64:142-148.

2. Dennison DK, Vallone DR, PineroGJ. Differential Effect of TGF-f31 andPDGF on Proliferation of PeriodontalLigament Cells and Gingival Fibroblasts.J Periodontol 1994; 65:641-648.

3. Marioti A, Cochran DL. Characterization

of Fibroblasts Derived From HumanPeriodontal Ligament and Gingiva. JPeriodontol 1990; 61:103-111.

4. Isidor F, Karring T, Nyman S, LindheJ. The significance of coronal growthof periodontal ligament tissue for newattachment. J Clin Periodontol 1986;13:145-150.

5. Karring T, Isidor F, Nyman S, Lindhe J.New attachment formation on teeth with areduced but healthy periodontal ligament.J Clin Periodontol 1985; 12:51-60.

6. Gamal AY, Mailhot JM. The effect of localdelivery of PDGF_BB on attachment ofhuman periodontal ligament broblasts

to periodontitis-affected root surfaces- invitro. J Clin Periodontol 2000; 27:347-353.

7. Mc. Culloch C, Lekic P, McKee M. Roleof physical forces in regulating the formand function of the periodontal ligament.

Periodontology 2000 2000; 24:56-72.8. Sammartino G, Tia M, Marenzi G, Espedito

di Lauro A. Use of autologous platelet-rich plasma(PRP) in periodontal defecttreatment after extraction of impacted

mandibular third molars. J Oral MaxillofacSurg 2005; 63:766-770.9. Kanno T, Takahashi T, Tsujisawa T,

Ariyoshi W, Nishihara T. Platelet-richplasma enhances humanosteoblast-likecell proliferation and differentiation. J OralMaxillofac Surg 2005; 63:362-369.

10. Lucarellia E, Beccheronia A, Davide DA,Sangiorgia L, Cenacchid A, Del VentorAM, Meottid C, Zambon BA, GiardinoeR, Fornasaric PM, Mercurio M, Piccia P.Platelet-derived growth factors enhance

proliferation of human stromal stem cells.

Biomaterials 2003; 24:30953100.11. Cenni E, Ciapetti G, Pagani S, Perut F,

Giunti A, Baldini N. Effects of activatedplatelet concentrates on human primarycultures of broblast and osteoblast. J

Periodontol 2005; 76:323-328.12. Annunziata M, liva A, Buonaiuto C, Di

Feo A, Pasquale R, Passaro I. In vitrocell-type specific biological responseof human periodontally related cells to

platelet-rich plasma. J Periodontal Res2005; 40(6):489-95.

13. Kawase T, Okuda K, Saito Y, Yoshie H. In

vitro evidence that the biological effectsof platelet-rich plasma on periodontalligament cells is not mediated solely byconstituent transforming-growth factor-

beta or platelet-derived growth factor. JPeriodontol 2005;76(5):760-7.

14. Barry LE, Woodell JE, Higgins JB. PlateletQuantication and Growth Factor Analysis

from Platelet-Rich Plasma: Implicationsfor Wound Healing. American Society ofPlastic Surgeons 2004; 14(6):1502-1508.

15. Oyama T, Nishi moto S, Tsugaw a T,Shimizu F. Efficacy of platelet-rich

plasma in alveolar bone grafting. J OralMaxillofac Surg 2004; 62:555-558.

16. Choi BH, I CJ, Huh JY , Suh JJ, Lee S.Effect of platelet-rich plasma on boneregeneration in autogenous bone graft. IntJ Oral Maxillofac Surg 2004; 33:56-59.

17. Fortes C, Carriel MC, Scarso FJ, GranjeiroJM, Oliveira CM, De Souza MR. Platelet-

rich plasma inuence on human osteoblasts

growth. Clin. Oral Impl. Res. 2005;16:456-460.

18. Raghoebar GM, Schortingh uis JRS,Liem B, Jan LR, van der Wal JE, Vissink

A. Does platelet-rich plasma promoteremodeling of autologous bone graftsused for augmentation of the maxillarysinus oor? Clin Oral Impl Res 2005; 16:

349-356.19. Hanna R, Trejo PM, Weltman RL.

Treatment of intrabony defects withbovine - derived xenograft alone ancombination with Platelet rich plasma :A randomized clinical trial. J Periodontol2004; 75:1668-1677.

20. Mumford JH, Carnes DL, Cochran DL,Oates TW. The Effects of Platelet-Derived

Growth Factor-BB on Periodontal Cells inan In Vitro Wound Model. J Periodontol2001; 72:331-340.

15.efecto del plasma rico en plaquetas en celulas del ligamento periodontal in vitro

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