次世代シーケンサーを用いた解析のご紹介

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環境サンプルからのDNA抽出 16S rRNA領域プライマー設計 PCR増幅 精製済PCR産物送付(1-5μg) お客様 タカラバイオ (高速シーケンス用ライブラリー作製) GS FLXを用いたシーケンス 1万リードから) 16S rRNAデータベースへの相同性検索 (オプション:タグによるサンプル分類) 及び RDP Classifier (1) による系統解析 次世代シーケンサーを用いた解析のご紹介 <16S rRNAシーケンス解析①> タカラバイオ株式会社 ドラゴンジェノミクスセンター 1.クローニングバイアスを考慮する必要がない 2.プライマーにタグ配列を付加することで、 複数検体を同時に解析可能 3.サンガー法と比較して大量の配列を取得可能 ○相同性検索結果:最新の16S rRNAデータベースに対して相同性検索を行い、上位5件をリスト化 ○系統分類結果:DomainレベルからGenusレベルまで分類した結果をリストおよびグラフ化 No Taxon Count 1 Nocardiopsaceae 5669 2 Bacillaceae 1324 3 Actinomycetales 892 4 Glycomyces 527 5 Flavobacteriaceae 475 6 Yaniella 453 7 Brachybacterium 336 8 Bacilli 319 9 Micrococcineae 278 10 Aequorivita 198 11 Bacillales 153 12 Gammaproteobacteria 149 13 Planifilum 148 14 Streptosporangineae 124 15 Brevibacterium 114 16 Unclassified_Bacteria 92 17 Pseudonocardiaceae 91 18 Arthrobacter 80 19 Corynebacterium 70 20 Joostella 61 Domain Genus Raed_name Domain Bootstrap value Phylum Bootstrap value Class Bootstrap value Subclass Bootstrap value Order Bootstrap value Suborder Bootstrap value Family Bootstrap value Genus Bootstrap value FG7DF1X10F78OS Bacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteridae 1 Actinomycetales 1 Streptosporangineae 0.87 Nocardiopsaceae 0.86 Streptomonospora 0.29 FG7DF1X10F9J3C Bacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteridae 1 Actinomycetales 1 Micrococcineae 0.99 Dermabacteraceae 0.89 Brachybacterium 0.86 FG7DF1X10F5YJH Bacteria 1 Actinobacteria 0.96 Actinobacteria 0.96 Rubrobacteridae 0.96 Solirubrobacterales 0.72 Conexibacteraceae 0.57 Conexibacter 0.57 FG7DF1X10F6T4S Bacteria 1 Proteobacteria 1 Betaproteobacteria 1 Burkholderiales 1 Alcaligenaceae 1 Alcaligenes 0.49 FG7DF1X10F959A Bacteria 1 Actinobacteria 0.99 Actinobacteria 0.99 Actinobacteridae 0.99 Actinomycetales 0.99 Streptosporangineae 0.95 Nocardiopsaceae 0.94 Nocardiopsis 0.44 FG7DF1X10F6EFD Bacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteridae 1 Actinomycetales 1 Streptosporangineae 0.67 Nocardiopsaceae 0.57 Haloactinospora 0.39 FG7DF1X10GF46A Bacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteridae 1 Actinomycetales 1 Streptosporangineae 0.83 Nocardiopsaceae 0.78 Streptomonospora 0.34 FG7DF1X10GBQ7I Bacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteridae 1 Actinomycetales 1 Micrococcineae 1 Dermabacteraceae 0.93 Brachybacterium 0.91 FG7DF1X10GA74C Bacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteridae 1 Actinomycetales 1 Streptosporangineae 0.93 Nocardiopsaceae 0.9 Streptomonospora 0.43 FG7DF1X10F6KO0 Bacteria 1 Actinobacteria 0.94 Actinobacteria 0.94 Acidimicrobidae 0.92 Acidimicrobiales 0.75 Acidimicrobineae 0.75 Iamiaceae 0.73 Iamia 0.73 49% 11% 8% 5% 4% 4% 3% 3% 2% 2% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% Pie Chart of abundance of the taxa found by RDP classifier Nocardiopsaceae Bacillaceae Actinomycetales Glycomyces Flavobacteriaceae Yaniella Brachybacterium Bacilli Micrococcineae Aequorivita Bacillales Gammaproteobacteria Planifilum Streptosporangineae Brevibacterium Unclassified_Bacteria Pseudonocardiaceae Arthrobacter Corynebacterium Joostella 系統分類結果を元に菌叢構造をグラフ化 Query QUERY SIZE QUERY HIT Comment ORG Comment2 Length HitPosNo Score Expect Identities_1 Identities_2 Gaps Strand QUERY START QUERY END SUBJECT START SUBJECT END QUERY STRING SUBJECT STRING FG7DF1X10 120 1 EF010836_ Virgibacillus sp. 171-4.2-CV-H26(h)-06 EF010836_1 438 1 174 4.00E-43 112 116 3 No 5 120 337 225 actgctgcctc actgctgcctcc FG7DF1X10 120 2 EU037266_ Bacillus sp. G1DM-84 EU037266_1 1492 1 167 9.00E-41 110 116 2 No 5 120 357 244 actgctgcctc actgctgcctcc FG7DF1X10 120 3 EF623842_ Bacillus cereus EF623842_1 1429 1 167 9.00E-41 93 96 0 No 5 100 335 240 actgctgcctc actgctgcctcc FG7DF1X10 120 4 EF113684_ Bacillus thuringiensis EF113684_1 699 1 167 9.00E-41 110 116 2 No 5 120 334 221 actgctgcctc actgctgcctcc FG7DF1X10 120 5 EF101166_ Virgibacillus sp. 30-7 EF101166_1 637 1 167 9.00E-41 111 116 3 No 5 120 345 233 actgctgcctc actgctgcctcc FG7DF1X10 121 1 EU274333_ Micromonospora sp. QAII13 EU274333_1 1372 1 186 1.00E-46 117 122 2 No 1 121 296 176 ccccactgct ccccactgctg FG7DF1X10 121 2 EF216369_ Knoellia sp. 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Microbiol. 73(16):5261-7 FLX adaptor A FLX adaptor B tag 検体1由来 検体2由来 検体3由来 検体4由来 1.検体を識別するタグ配列を付加したプライマーで鋳型DNAPCR primer F primer R 2PCR産物を混合し、タグ付きライブラリーを作製 シーケンス 3.タグ配列を利用して検体ごとに取得リードを分別して情報解析 信頼性が高い(弊社デフォルトではブートストラップ確率が0.6以上) 分類名を抜き出してカウント DomainGenus各レベルにおいて、 分類の信頼性(ブートストラップ確率)を表示 ⇒ 例えば、“Escherichia属”とは言い切れないが、 Enterobacteriaceae科”であることは確からしい、 といった解釈が可能 系統分類解析 相同性検索 ・データベース内の配列と高い相同性を示す配列 が存在する場合は、SpeciesStrainレベルで細菌 種の特定が可能 研究目的に応じた使い分けが可能

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Page 1: 次世代シーケンサーを用いた解析のご紹介

環境サンプルからのDNA抽出 16S rRNA領域プライマー設計 PCR増幅 精製済PCR産物送付(1-5μg)

お客様

タカラバイオ (高速シーケンス用ライブラリー作製) GS FLXを用いたシーケンス (1万リードから) 16S rRNAデータベースへの相同性検索 (オプション:タグによるサンプル分類) 及び RDP Classifier(1)による系統解析

次世代シーケンサーを用いた解析のご紹介<16S rRNAシーケンス解析①> タカラバイオ株式会社 ドラゴンジェノミクスセンター

1.クローニングバイアスを考慮する必要がない

2.プライマーにタグ配列を付加することで、 複数検体を同時に解析可能

3.サンガー法と比較して大量の配列を取得可能

○相同性検索結果:最新の16S rRNAデータベースに対して相同性検索を行い、上位5件をリスト化

○系統分類結果:DomainレベルからGenusレベルまで分類した結果をリストおよびグラフ化

No Taxon Count

1 Nocardiopsaceae 56692 Bacillaceae 13243 Actinomycetales 8924 Glycomyces 5275 Flavobacteriaceae 4756 Yaniella 4537 Brachybacterium 3368 Bacilli 3199 Micrococcineae 278

10 Aequorivita 19811 Bacillales 15312 Gammaproteobacteria 14913 Planifilum 14814 Streptosporangineae 12415 Brevibacterium 11416 Unclassified_Bacteria 9217 Pseudonocardiaceae 9118 Arthrobacter 8019 Corynebacterium 7020 Joostella 61

Domain Genus

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FG7DF1X10F78OS Bacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteridae 1 Actinomycetales 1 Streptosporangineae 0.87 Nocardiopsaceae 0.86 Streptomonospora 0.29FG7DF1X10F9J3C Bacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteridae 1 Actinomycetales 1 Micrococcineae 0.99 Dermabacteraceae 0.89 Brachybacterium 0.86FG7DF1X10F5YJH Bacteria 1 Actinobacteria 0.96 Actinobacteria 0.96 Rubrobacteridae 0.96 Solirubrobacterales 0.72 Conexibacteraceae 0.57 Conexibacter 0.57FG7DF1X10F6T4S Bacteria 1 Proteobacteria 1 Betaproteobacteria 1 Burkholderiales 1 Alcaligenaceae 1 Alcaligenes 0.49FG7DF1X10F959A Bacteria 1 Actinobacteria 0.99 Actinobacteria 0.99 Actinobacteridae 0.99 Actinomycetales 0.99 Streptosporangineae 0.95 Nocardiopsaceae 0.94 Nocardiopsis 0.44FG7DF1X10F6EFD Bacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteridae 1 Actinomycetales 1 Streptosporangineae 0.67 Nocardiopsaceae 0.57 Haloactinospora 0.39FG7DF1X10GF46A Bacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteridae 1 Actinomycetales 1 Streptosporangineae 0.83 Nocardiopsaceae 0.78 Streptomonospora 0.34FG7DF1X10GBQ7I Bacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteridae 1 Actinomycetales 1 Micrococcineae 1 Dermabacteraceae 0.93 Brachybacterium 0.91FG7DF1X10GA74C Bacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteria 1 Actinobacteridae 1 Actinomycetales 1 Streptosporangineae 0.93 Nocardiopsaceae 0.9 Streptomonospora 0.43FG7DF1X10F6KO0 Bacteria 1 Actinobacteria 0.94 Actinobacteria 0.94 Acidimicrobidae 0.92 Acidimicrobiales 0.75 Acidimicrobineae 0.75 Iamiaceae 0.73 Iamia 0.73

49%

11%

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1%

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1%

1% 1%1% 1%

Pie Chart of abundance of the taxa found by RDP classifier

Nocardiopsaceae

Bacillaceae

Actinomycetales

Glycomyces

Flavobacteriaceae

Yaniella

Brachybacterium

Bacilli

Micrococcineae

Aequorivita

Bacillales

Gammaproteobacteria

Planifilum

Streptosporangineae

Brevibacterium

Unclassified_Bacteria

Pseudonocardiaceae

Arthrobacter

Corynebacterium

Joostella

系統分類結果を元に菌叢構造をグラフ化

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生物種情報 相同性 配列情報

*参考文献 (1)Wang Q et al., (2007) Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Appl. Environ. Microbiol. 73(16):5261-7

FLX adaptor A FLX adaptor B tag

検体1由来

検体2由来

検体3由来

検体4由来 ・ ・

1.検体を識別するタグ配列を付加したプライマーで鋳型DNAをPCR

primer F primer R

2.PCR産物を混合し、タグ付きライブラリーを作製 ⇒ シーケンス

3.タグ配列を利用して検体ごとに取得リードを分別して情報解析

信頼性が高い(弊社デフォルトではブートストラップ確率が0.6以上) 分類名を抜き出してカウント

・Domain~Genus各レベルにおいて、 分類の信頼性(ブートストラップ確率)を表示 ⇒ 例えば、“Escherichia属”とは言い切れないが、 “Enterobacteriaceae科”であることは確からしい、 といった解釈が可能

系統分類解析 相同性検索

・データベース内の配列と高い相同性を示す配列が存在する場合は、Species、Strainレベルで細菌種の特定が可能

研究目的に応じた使い分けが可能

Page 2: 次世代シーケンサーを用いた解析のご紹介

次世代シーケンサーを用いた解析のご紹介 <16S rRNAシーケンス解析②~菌叢比較解析(UniFrac(1)解析)~> タカラバイオ株式会社 ドラゴンジェノミクスセンター

Unifrac distance = (各サンプルに固有の枝長[赤+黄]) / (全ての枝長の和[赤+黄+水色])

0 0.3 0.7

0.3 0 0.6

0.7 0.6 0

PCoA (Principal Coordinates Analysis )

Cluster Samples

Weighted Unifrac : community structureについての解析 (リード数を考慮した解析) Unweighted Unifrac : community memberについての解析 (リード数を考慮しない解析)

Unifrac Distance Matrix

*参考文献 (1)Hamady M et al., (2010) Fast UniFrac: facilitating high-throughput phylogenetic analyses of microbial communities including analysis of pyrosequencing and PhyloChip data. ISME Journal 4(1): 17–27 (2)Turque AS et al., (2010) Environmental shaping of sponge associated archaeal communities. PLoS One. 30;5(12):e15774.

Turqueらのデータ(2) (環境汚染の程度が異なる2つの環境における海綿共生細菌叢と海水中の細菌叢とを比較)を テストデータとして使用し、解析を行った(Accession No: GU058339-GU058920)

1.配列長をそろえたリードデータの作成

2.相同配列のクラスタリングおよび代表配列の抽出

3.クラスタリング結果および代表配列を用いて、 系統樹データ(Input data1)およびEnvironment file*( Input data 2)を作成 4.Input data 1と2を用いてUnifrac distance matrixを作成

Input data 1 系統樹データ

Sample1由来のシーケンス

Sample2由来のシーケンス

Sample3由来のシーケンス

Read1 Sample1 100 Read2 Sample1 50 Read3 Sample2 200 Read4 Sample3 40 Read5 Sample3 30 ・ ・ ・ ・ ・ ・

リード名 サンプル名 リード数

Input data 2 Environment file

全てのサンプル由来のシーケンス間(赤 vs 黄、黄 vs 青、青 vs 赤)で Unifrac Distance(Weighted、 Unweighted)を計算

*複数サンプル由来のリードを混合して系統樹を作成するため、 各リードの由来サンプルとリード数を特定するために使用

Sample1由来のシーケンスに特異的な枝

Sample2由来のシーケンスに特異的な枝

Sample1由来とSample2由来のシーケンスに跨る枝

例:Sample1由来のシーケンスとSample2由来のシーケンスのUnifrac Distanceの計算

Cluster Samples PCoA

古典的多次元尺度構成法または主座標分析と呼ばれる 多変量解析の1手法。 各サンプルを点で表現し、個体間の親近性データを2次元 あるいは3次元空間に、類似したものを近くに、そうでない ものは遠くに配置する方法(納品物イメージ参照)。

UPGMA(Unweigted Pair Group Method with Arithmetic mean:非加重結合)法による階層的クラスタリング解析。 Unifrac distanceの値が小さい(= サンプル間の菌叢の違い が少ない)組み合わせから順にクラスタリングされていく (納品物イメージ参照)。

○ PCoAの結果をScatter Plotで表現した結果

○ Cluster Samplesを行った結果

HhCA: Cagarras列島沿岸水域*の海綿動物Hymeniacidon heliophilaに共生する細菌群

HhP92: Guanabara湾付近*の海綿動物Hymeniacidon heliophilaに共生する細菌群

PcCA: Cagarras列島沿岸水域の海綿動物Petromica citrinaに共生する細菌群

PmCA: Cagarras列島沿岸水域の海綿動物Paraleucilla magnaに共生する細菌群

PmP92: Guanabara湾付近の海綿動物Paraleucilla magnaに共生する細菌群

SwCA: Cagarras列島沿岸水域に存在するfree-livingの細菌群

SwP92: Guanabara湾に存在するfree-livingの細菌群

*注1, Cagarras列島沿岸水域:環境汚染が進んでいない海域

*注2, Guanabara湾付近:環境汚染が進んでいる海域

HhCA HhP92 PcCA PmCA PmP92 SwCA SwP92HhCA 0 0.88 0.74 0.39 0.90 0.86 0.96HhP92 0.88 0 0.89 0.88 0.82 0.93 0.93PcCA 0.74 0.89 0 0.75 0.91 0.90 0.97PmCA 0.39 0.88 0.75 0 0.90 0.86 0.96PmP92 0.90 0.82 0.91 0.90 0 0.81 0.87SwCA 0.86 0.93 0.90 0.86 0.81 0 0.89SwP92 0.96 0.93 0.97 0.96 0.87 0.89 0

○ Unifrac distance matrix(Unweighted)

・Cagarras列島沿岸水域(環境汚染が進んでいない)の菌叢と Guanabara湾(環境汚染が進んでいない)の菌叢は異なっている

・同じ環境に生息する海綿共生細菌叢(HhCAとPmCAとPcCA、HhP92とPmP92)は互いに類似しており、 free-livingの細菌叢とは異なっている

これらの解析から示唆されること

背景

解析結果

海綿動物の環境適応機構の一部は体内に共生する細菌に関係すると考えられている。また、海綿動物に共生する古細菌は、 アンモニア酸化作用を有していることが示唆されており、富栄養化など環境汚染が進んだ海域においてアンモニアの代謝にかかわっていると考えられている。 そこで筆者らは、環境汚染が進んだ海域に生息する海綿共生細菌群と環境汚染が比較的進んでいない海域に生育する海綿共生細菌群、 さらに両海域で共生を行わず存在している細菌群の菌叢比較を行った。

本解析においても、Turqueらと同様の結論が導かれた

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

-0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

P2

-P

ercen

t v

aria

tio

n e

xp

lain

ed

20

.25

%

P1 - Percent variation explained 33.07%

PCoA - P1 vs P2

HhCA

HhP92

PcCA

PmCA

PmP92

SwCA

SwP92

海綿共生細菌群

(Cagarras列島沿岸水域)

海綿共生細菌群

(Guanabara湾)