新規細胞接着ペプチドを用いた創傷治療への応用

大分大学 医学部講師 岡本 修

研究背景

細胞外マトリックスの未知の蛋白質の生物学的な役割を解明することにより、不都合な生物現象の改変を目指す。

細胞外マトリックスにおける未知の蛋白質の分離精製。

細胞外マトリックス（細胞外基質）とは

組織で細胞の周囲を埋める物質

いずれの組織でも認められる。組織によって量の違いがある。

表皮

真皮

細胞外マトリックスに乏しい

細胞外マトリックスが豊富

真皮の細胞外マトリックスにおける未知の蛋白質の分離精製。

理由

細胞外マトリックスが豊富である。難溶性で一般的に研究が進んでいない。

競争相手が少ない。

出発材料：ウシ真皮２kg

グアニジン塩酸溶液で可溶化（約10リットル）

脱塩後、尿素存在下でゲルろ過

ＰｙｒE Y G D Y G Y S Y H Q Y H D YSDD

GWVNLNRQG F S Y Q C P H G Q V V V A V R S

IFNKKEGSDRQWNY

ACMPTPQSLGE P T E C W W E E I N R A

GMEWYQTC

SN N G L V A G F

QSRYFESVLD

REWQFYCCRYSKR

CPYSCWL

TT E Y P G H Y G E E M DMISYNYD

YYMRGATTTFSAV

ERD

RQWKFIMCRM

TDYD CEF

ANV

1 10

20

3040

5060

70 80

90

100

110

120

130 140

150160

170

180

22 kDa proteindermatopontin（デルマトポンチン）

183個のアミノ酸

疎水性、酸性蛋白質4個のループ構造繰り返し配列3ヶ所

DP

線維芽細胞接着 (1991)心筋梗塞巣周辺で強発現 (2002)

創傷治癒に関係か？

表皮細胞では？

DPについてわかっていたこと

1．線維芽細胞接着能を有する2．コラーゲンの構造を変化させる

真皮に比較的豊富に存在するが、機能がほとんどわかっていない

DPの機能解明

Abs

orba

nce

at 5

95 n

m

dermatopontin (μg/ml)

0

0.4

0.8

1.2

0 4 8 12 16 20

1 h

30 min

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0 10 20 30 40 50

D

B

A

C

0

0.625

1.25

2.5

F

E

G

5

10

20(μg/ml)

Fb

HaCaT

HaCaTはDPに接着する

DPはHaCaTのスプレッディング

を誘導する

HaCaT－DP の細胞接着はEDTAで抑制されるが、

ヘパリンによる抑制効果は弱い

heparin (μg/ml)

B

0

0.4

0.8

1.2

0 2 4 6 8 10

Abs

orba

nce

at 5

95 n

m

EDTA (mM)

A

0

0.4

0.8

1.2

0 2 4 6 8 10

anti-α1

anti-α2

anti-α3

anti-α6

anti-ß1PBS

background

Abs

orba

nce

at 5

95 n

m

0

0.2

0.4

0.6

0.8

*

*

DPのレセプターの1つはα3β1インテグリンである

0

0.4

0.8

1.2

dermatopontin

DP-1DP-2DP-3DP-4DP-5DP-6DP-7DP-8DP-9DP-10DP-11DP-12DP-13DP-14DP-15DP-16

background

B

Abs

orba

nce

at 5

95 n

m

*

DP-1DP-2DP-3DP-4DP-5DP-6DP-7DP-8DP-9DP-10DP-11DP-12DP-13DP-14DP-15DP-16

background

Abs

orba

nce

at 5

95 n

mPBS

0

0.4

0.8

1.2

A

*

DP-4 ペプチドで HaCaT-DP 細胞接着が阻害される

DP-4 ペプチドにHaCaT は接着する

ＰｙｒE Y G D Y G Y S Y H Q Y H D Y SDDGWVNLN

RQG F S Y Q C P H G Q V V V A V R S I F

NK

KEGSDRQWNYACMPTPQSLG E P T E C W W E E I N R A

GMEWYQTC

SN N G L V A G F

QSRYFESVLDR

EWQFYCCRYSKR

CPYSCW

LTTE Y P G H Y G E E M D

MISYNYD

YYMRGATTTFSAV

ERDR

QWKFIMCRM

TDYD CEFANV

1 10

20

3040

5060

70 80

90

100

110

120

130 140

150

160

170

180

DP-4 peptide

Abs

orba

nce

at 5

95 n

m

Peptide (μg/ml)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 10 20 30 40 50

DP-4

DP-5

D

B F

E

G

A

0

1.56

C

3.13

6.25

12.5

25

50(μ g/ml)

HaCaTはDP-4に接着する

DP-4はHaCaTのスプレッディング

を弱く誘導する

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

DP-44a 4b 4c 4d 4e 4f 4g 4h 4ibackground

PBS

A

Abs

orba

nce

at 5

95 n

mpeptide

* *

peptide

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

background

DP-44a 4b 4c 4d 4e 4f 4g 4h 4idermatopontin

Abs

orba

nce

at 5

95 n

m

B

**

*

* **

HaCaT-DP-4 細胞接着阻害

HaCaT-欠損ペプチド接着

PHGQVVVAVRS

-HGQVVVAVRS--GQVVVAVRS----VVVAVRS-----VVAVRS

DP4

DP4aDP4bDP4cDP4d

DP4eDP4fDP4gDP4hDP4i

PHGQVVVAVR-PHGQVVVAV--PHGQVVVA---PHGQVVV----PHGQVV-----

DP4 欠損ペプチド

ＰｙｒE Y G D Y G Y S Y H Q Y H D Y SDDGWVNLN

RQG F S Y Q C P H G Q V V V A V R S I F

NK

KEGSDRQWNYACMPTPQSLG E P T E C W W E E I N R A

GMEWYQTC

SN N G L V A G F

QSRYFESVLDR

EWQFYCCRYSKR

CPYSCW

LTTE Y P G H Y G E E M D

MISYNYD

YYMRGATTTFSAV

ERDR

QWKFIMCRM

TDYD CEFANV

1 10

20

3040

5060

70 80

90

100

110

120

130 140

150

160

170

180

DP-4 peptide

Abs

orba

nce

at 5

95 n

m

EDTA (mM)

A

0

0.4

0.8

1.2

1.6

0 2 4 6 8 10heparin (μg/ml)

B

0

0.4

0.8

1.2

1.6

0 1 2 3 4

HaCaT－DP の細胞接着はヘパリンにより強く抑制されるが、EDTAによる抑制はやや弱い

Heparitinase I

Chondroitinase ABC

PBSblank

0

0.5

1

1.5

2

*

Abs

orba

nce

at 5

95 n

m

DP-4のレセプターはヘパラン

硫酸プロテオグリカンである。

0

0.4

0.8

1.2

1.6

DP-4DP-4SDP-4TDP-5DP-8blank

Abs

orba

nce

at 4

05 n

m

*

* * *

DP-4はヘパリンに

結合する

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Syn-1 Syn-1

DP-4 DP-5

*

control control1 2 3 4

Abs

orba

nce

at 5

95 n

m

DP-4のレセプターの１つはシンデカンである。

Day 4 Day 6

Day 10Day 15

DPは皮膚の創傷治癒過程で発現する

生体ではDPは真皮に発現して新生表皮の

接着や遊走を助けていると思われる。

ではDPの細胞接着部位であるDP-4を創傷に

投与すれば表皮の接着、遊走が誘導されるか＝創傷治癒は促進されるのか

A B

C D

6d

DP-4PBS

DP-4PBS

0

0.5

1

コントロール DP-4 投与

P=0.0038

新生

上皮

延長

距離

(mm

)

**

DP-4投与により創傷治癒が促進する

DP-4 投与 トラフェルミン 投与

新生

上皮

延長

距離

(mm

)

0

0.5

1

1.5

2

2.5P=0.0228

*

DP-4はトラフェルミンと同等以上の

創傷治癒促進効果を示す

まとめ

１．DPは強力な表皮細胞接着能を有する。

２．接着に関わるレセプターはインテグリンとシンデカンである。

３．シンデカン結合部位はDP-4ペプチドだが、

インテグリン結合部位は不明である。４．DP-4も強力な表皮細胞接着活性を持つ。５．DP-4は既存の製品と同等以上の創傷治癒

促進活性を持つ。

想定される用途

急性の創傷の治療（熱傷など）

胃潰瘍の治癒促進？

実用化に向けた課題

創傷へのペプチドの接着性の向上

新技術の特徴・従来技術との比較

１．合成の容易な単純なペプチドである。

２．化学的に大量生産が可能。

本技術に関する知的財産権

• 発明の名称 ：ペプチド製創傷治療剤

• 出願番号 ：特願2008-13600• 出願人 ：大分大学

• 発明者 ：岡本 修

• 大分大学

• 知的財産本部 福永将司

• ＴＥＬ ０９７－５５４ －７４３０

• ＦＡＸ ０９７－５５４ －７９８２

• E-mail chizai＠cc.oita-u.ac.jp

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