1a. approcci tecnologici per lo studio del genoma
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8/6/2019 1a. Approcci Tecnologici Per Lo Studio Del Genoma
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Discovering Genomics,
Proteomics And Bioinformatics
By A.Malcolm Campbell& Laurie J.Heyer
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003
Teaching genomics to undergraduate students
is like vaccinating against flu:
Each year the novelties that have come to
dominate the field have to
be evaluated and course materials redesignedto prepare the student
body for the ever-changing
information landscape.
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Medicina Molecolare e Neoplasie
- Genetica - Analisi cromosomi
- Genomica - Analisi DNAgenomico/cDNA
- Proteomica - Analisi RNA
- Epigenetica - Analisi proteine
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Genetica Molecolare
Struttura e Funzione dei Geni
Genomica
Progetto Genoma - Sequenziamento
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2nm
11nm
30nm
300nm
1400nm
700n
m
Mb (1000 Kb)
Kb (1000 bps)
Nucleotide (1 bp)
Gb
(1000Mb)
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Human Chromosomes
telomere
p arm
q arm
centromere
Male 46,XY
Female 46,XX
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Genome Anatomy
EUCHROMATIN 1,5%Transcribed gene
polymorphisms > 1 protein
98,5% NON CODING
intragenic = introns
Intergenic
repetitive
1 gene 1 protein old dogma!
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G-BANDING KARYOTYPE
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Gene
Candidato
Cromosoma 12 Cloni/Sonderegione 12q12
Geniregione 12q1
Metodiutilizzati
Cariotipo
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COSMID 4-1 +COSMID 9-4
Chromosome 5
q33
5
3
PDGFRB
4.1
9.4
5
FISH (PDGFRB 5q33)
DUAL COLOR FISH
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I-FISH
der(12)
der(5)
nl(5)
nl(5) der(5)
der(12)
M-FISH
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I h FISH
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D-FISH, dual colour dual fusion
ABL1
BCR
fusion
fusion
Interphase FISH
ABL1
BCRnormale Ph+
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CROMOSOMA
Braccio corto, p
Braccio lungo, q
banda
sonda monocolore complementare a tutto il gene
gene candidato rottura e separazione (split)gene candidato separazione (break apart)
sonde bicolore fiancheggianti il gene
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RT - PCR
PCR: reazione a catena
della DNA-polimerasi
RT: trascrizione inversa
Le molecole di mRNA (53)
vengono retrotrascritte in
cDNA (filamento antisenso
35)
Sintesi del filamento senso (5
3) e amplificazione del cDNA
------------------------AAAA mRNA5 3
3 5cDNA
53
5 3cDNA
Filamento senso
Filamento antisenso
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VAL 617F in PVVAL 617F in PV
WT
PV
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WTWT
959
959
W T G A T C T CT G G C A G T G G A G G A A G T C T C T T T A A G A A A A T
B G AT CT C T G C A T G G C A G T G G A G G A AG TC TC TT TA AG A AA AT
D G AT CT C T G C C T G G C A G T G G A G G A AG TC TC TT TA AG A AA AT
965
965
Journal of Molecular Diagnostics,2006
INS 959_960 CATG vs CCTGINS 959_960 CATG vs CCTG
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Types of genes wich may mutate to cause cancer
Tumour suppressor genes
proto-oncogenes
DNA repair genes
checkpoint genes
food
viruses
tobacco smokeradiation
chemical
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Oncogene ci
che risulta dalproto-oncogene
dopo insulto
genetico e il cuiprodotto ha la
capacit
trasformante
Proto - Oncogene
Un gene il cui
prodotto ha la
capacit di
indurre
trasformazionecellulare a
seguito di insulti
genetici
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Tumour Suppressor Genes
1) The genes normal function is to regulate cell division.
To lose gene activity both alleles need to be mutated
2) The first mutation may be inherited or somatic
3) the second mutation will often be a gross event leadingto loss of heterozygosity in the surronding area (deletion)
es: retinoblastoma gene (13q14)
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Retinoblastoma Gene (13q14)
both copies of gene as to be inactivated
first allele inactivation
hereditysomatic mutation
somatic mutation
second allele inactivation
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p53 Mutant Mice Develop Cancer
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Mutazione dominante negativa
Una mutazione il cui prodotto
interferisce con il prodotto del gene
normale nella stessa cellula
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BER Base Excision Repair
NER Nucleotide Excision Repair
MMR Mismatch Repair (HNPCC)
REPAIR GENES
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Checkpoints Genes
Sistema cellulare di protezione dallinstabilitgenomica e della tossicit derivata dal danno al
DNA
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Functional Goals Of Mutations
Induzione di segnali di crescita
Perdita di capacit di sopprimere
Regolazione anormale dellapoptosi
Diminuzione della stabilit genomica
Evasione delle difese immunologiche
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Proteomica
Caratterizzazione della neoplasia attarverso le
sue proteine
( elettroforesi bidimensionale: gradienti di pH +
peso molecolare - spettrometria di massa )
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Dogma Della Biologia
DNA
ProteineRNA
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Mi h i
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Microarray showing genes
distinguishing ALL from AML.
The 50 genes most highly
correlated with the ALL-AMLclass distinction are shown. Each
row corresponds to a gene, with
the columns corresponding to
expression levels in different
samples. Expression levels for
each gene are normalized across
the samples such that the mean is
0 and the SD is 1. expression
levels greater than the mean areshaded in red, and those below
the mean are shaded in blue. The
scales indicated SDs above or
below the mean.
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Epigenetica:
( Espressione Genica )
Metilazione
De-acetilazioneRNA interferents
Epigenetica:
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p gMetilazione
Sequenze di DNA di 200-2000 basi conuna pi alta frequenza di CG rispetto alresto del genoma.
Circa 30000 nel genoma, il 50-60%
localizzato allinterno dei promotorigenici.
La metilazione del promotore a livellodelle CpG associata a silenziamento
trascrizionale e deacetilazione degli
*CpGIsland:
-3
* * *
Promoter exon 15-
ATG
exon 2 exon 3
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Copia inattiva
del gene (imprinted)
acetilazione istonica
metilazione
Copia attiva
del gene
acetilazione istonica
metilazione
attivit deacetilasica
attivit acetilasica
repressione della trascrizione
attivazione della trascrizione
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INIBITORIINIBITORI
Azacitidina, Decitabina, Zebularina
Acido Valproico, Tricostatina A,SAHA, Fenil-butirrato, MGCD0103
Substrati non-IstoniciSubstrati non-Istonici
Fattori di trascrizioneFattori di trascrizione
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BCR/ABL1 + loss 5'ABL1/3'BCR
normal BCR/ABL1
BCR/ABL1 + loss 5'ABL1
der(9)
t(9;22)(q34;q11) D-FISH
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HYBRIDIZATION
+DNA target DNA probe+apten
DENATURATION DETECTION
Ab
anti-apten
Ab
I)
II)
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Mutations can be
induced by
chemical
modification
of a base
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B G 138/00
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B.G. 138/00
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Tecniche di Citogenetica e di Biologia Molecolare
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Epigenetica:
( Espressione Genica )
Metilazione
AcetilazioneRNA interferents
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Gene
Expression
is
a multistage
process
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WHO Integrated Classifications
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WHO Integrated Classifications
Morphology:Cytology
Histopathology
Molecular
GeneticsCytogenetic
Immunology:Immuno-cyto-
histochemistry
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The New England Journal of Medicine. Jan 4, Vol 356, No. 1, 79-81
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Eredit di tipo Mendeliano
Dominante
Recessiva
Penetranza
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Selected SyndromesCancers
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Selected human
cancers
associated
withMendelian
syndromes
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Oncogeni
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Oncogeni
Proto - Oncogeni (c-onc)Mutazioni
OncogeneVirus RNA
tumorali
(v-onc)
spliced RNA copies
of the c-onc
no introns
Domande
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Domande
Che cos la citogenetica molecolare ?
Che cos un oncogene ?
Che cos un gene checkpoint ?
Che cosa studia lepigenetica ? Quale la differenza tra DNA genomico e cDNA ?
Strumenti di analisi dellespressione genica
Che cos un gene soppressore? A cosa servono i telomeri?
B G 138/00
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B.G. 138/00
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E h d M t i S t
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Enhanced Mutagenesis Spontaneous
biosynthetic errors induced byendogenous/exogenous agents
Inefficient repair
Clonal selection
REPAIR GENES
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REPAIR GENES
BER Base Excision Repair
NER Nucleotide Excision repair
MMR Mismatch repair (HNPCC)
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GEL ELETTROFORETICO IN AGAROSIO
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GEL ELETTROFORETICO IN AGAROSIO
123 bp ladder /HindIII
Migrazione Elettroforesi
I-FISH
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-NUMERICAL ABERRATIONS
Monosomy / Trisomy
Amplification
-STRUCTURAL ABERRATIONS
Deletion / Duplication
Translocation / Inversion
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Methylation Specific PCR (MSP)
U Primer:
Epigenetica:Metilazione
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Trattamento con Sodio Bisulfito
O
NH2
NH
N
CITOSINACITOSINA
Deaminazione
URACILE
O
ONH
NH
GCGTAATGGCGATCG
CACATTACCACTAAC
5. .3
DNA metilato:
CACATTACCACTAAC
GUGTAATGGUGATUG5. .3
DNA NON metilato:
M Primer:
U Primer:
CGCATTACCGCTAGC
DNA metilato:
CGCATTACCGCTAGC
GUGTAATGGUGATUG5. .3
DNA NON metilato:
5 metilcitosina
O
NH2
NH
N
5 metilcitosina
O
NH2
NH
N
CH3
Deaminazione
CH3
Sequenze di DNA di 200-2000 basi conuna pi alta frequenza di CG rispetto alresto del genoma.
Circa 30000 nel genoma, il 50-60%
localizzato allinterno dei promotorigenici.
La metilazione del promotore a livello
*CpGIsland:
-3
* * *
Promoter exon 15-
ATG
exon 2 exon 3