1.erriska r p (sps + bab 4) revisisian 1 bu erda.docx
TRANSCRIPT
Ekstraksi Astasantin dari Tepung Kulit Udang dengan Metode Maserasi untuk Uji Aktivitas Antioksidan
Skripsi
Disusun untuk melengkapi syarat-syarat guna memperoleh gelar Sarjana Sains
OlehErriska Rahma Putri
3325102418
Program Studi KimiaJURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS NEGERI JAKARTA
2014
i
ii
ABSTRAK
Erriska Rahma Putri. Ekstraksi Astasantin dari Tepung Kulit Udang
dengan Metode Maserasi untuk Uji Aktivitas Antioksidan. Skripsi. Jakarta:
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri
Jakarta. 2014.
Telah dilakukan ekstraksi Astasantin dari tepung kulit udang. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh waktu dan rasio perbandingan antara tepung kulit udang dengan pelarut, terhadap besar ekstrak Astasantin yang dihasilkan. Tujuan lain dari penelitian ini adalah untuk menguji aktivitas antioksidan ekstrak yang didapat. Dalam penelitian ini dilakukan karakterisasi menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan FTIR. Setelah proses karakterisasi ekstrak diukur konsentrasinya menggunakann KCKT dan diuji aktivitas antioksidannya dengan metode DPPH. Waktu optimum untuk ekstraksi Astasantin dari tepung kulit udang dengan metode maserasi yaitu selam 5 hari. Rasio perbandingan optimum antara tepung kulit udang dengan pelarut pada proses maserasi yaitu, sebanyak 1:8 (5 gram tepung kulit udang dalam 40 mL pelarut aseton). Pengukuran panjang gelombang maksimum dengan spektrofotometer UV-Vis menghasilkan nilai 468 nm, hal ini menjadi salah satu indikasi bahwa senyawa ekstrak yang dihasilkan berupa senyawa Astasantin. Karakterisasi spektrum infra merah menguatkan indikasi bahwa gugus fungsi yang terkandung dalam ekstrak merupakan gugus fungsi senyawa Astasantin, ini dibuktikan dengan munculnya puncak pada bilangan gelombang 3369,64 cm-1, 2924,09 cm-1, 1712,79 cm-1, dan 1620,21 cm-1. Hasil pengukuran konsentrasi ekstrak Astasantin menggunakan KCKT yaitu sebesar 7,466 ± 0,05 ppm. Uji aktivitas antioksidan ekstrak Astasantin dengan metode DPPH memberikan nilai IC50 sebesar 338,500 ppm.
Kata kunci : Astasantin, Tepung Kulit Udang, Pengaruh Waktu Maserasi, Pengaruh Rasio Pelarut, Spektrofotometer UV-Vis, Fourier Transform Infrared (FTIR), Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), Uji Aktivitas Antioksidan, Metode DPPH.
iii
KATA PENGANTAR
Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat dan
karunia yang telah dilimpahkan kepada penulis sehingga penulis dapat
menyelesaikan proposal yang berjudul “Ekstraksi Astasantin dari Tepung
Kulit Udang dengan Metode Maserasi untuk Uji Aktivitas Antioksidan”.
Proposal ini disusun sebagai salah satu prasyarat lulus dalam mata kuliah
Skripsi.
Penulis tidak dapat menyelesaikan proposal ini tanpa bantuan dari
berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih
kepada :
1. Dr. Riskiono Slamet, M.Sc. sebagai dosen pembimbing I.
2. Dr. Erdawati, M.Sc sebagai dosen pembimbing II.
3. Dr. Yusmaniar, M.Si sebagai dosen mata kuliah Skripsi.
4. Orang tua yang telah memberikan dukungan dan doa.
5. Segenap pihak yang telah berperan dalam proses penyelesaian
proposal ini.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih memiliki banyak
kekurangan. Penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun
dari pembaca. Semoga proposal ini dapat memberikan manfaat bagi
pembaca pada khususnya dan perkembangan ilmu pengetahuan pada
umumnya.
Jakarta, 16 Juni 2014
Penulis
ii
iv
DAFTAR ISI
Halaman
ABSTRAK......................................................................................... i
KATA PENGANTAR......................................................................... ii
DAFTAR ISI...................................................................................... iii
DAFTAR TABEL............................................................................... vi
DAFTAR GAMBAR.......................................................................... vii
DAFTAR LAMPIRAN........................................................................ viii
I. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang .................................................................... 1
1.2. Identifikasi Masalah ............................................................ 2
1.3. Pembatasan Masalah ......................................................... 3
1.4. Perumusan Masalah ........................................................... 3
1.5. Tujuan Penelitian ................................................................ 4
1.6. Manfaat Penelitian .............................................................. 4
II. LANDASAN TEORI
2.1. Kajian Teori.......................................................................... 5
2.1.1. Udang...................................................................... 5
2.1.2. Ekstraksi ................................................................. 7
2.1.3. Astasantin (Pigmen Karotenoid) ............................. 15
2.1.4. Karotenoid Alami dalam Menangkal Radikal Bebas 16
2.1.5. Antioksidan.............................................................. 18
2.1.6. Ekstraksi Astasantin dari Tepung Udang dan
Astasantin Sebagai Antioksidan Alami.................... 22
2.1.7. Spektrofotometri UV-Vis.......................................... 23
2.1.8. Spektrofotometri Infra Merah................................... 26
iii
v
2.1.8. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)................ 27
2.2. Kerangka Berpikir................................................................ 29
2.3. Penelitian Sebelumnya........................................................ 29
III. METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Tujuan Operasional Penelitian ........................................... 32
3.2. Tempat dan Waktu Penelitian ............................................ 32
3.3. Alat dan Bahan .................................................................. 32
3.4. Prosedur ............................................................................ 33
3.4.1. Pembuatan Tepung Kulit Udang ............................ 33
3.4.2. Pengaruh Waktu Ekstraksi terhadap Jumlah
Ekstrak Astasantin yang didapatkan ..................... 33
3.4.3. Pengaruh Rasio Tepung Kulit Udang dengan
Pelarut Aseton terhadap Jumlah Ekstrak Astasantin
yang didapatkan...................................................... 33
3.4.4. Pemurnian Astasantin dan Penentuan
Panjang Gelombang Maksimum ............................ 34
3.4.5. Karakterisasi Ekstrak Astasantin
dengan Spektrofotometer Infra Merah ................... 35
3.4.6. Pengujian Konsentrasi Ekstrak Astasantin
dengan KCKT......................................................... 36
3.4.7. Uji Aktivitas Antioksidan dengan DPPH................... 37
IV. HASIL dan PEMBAHASAN
4.1. Preparasi Sampel ............................................................... 39
4.2. Pemurnian Sampel.............................................................. 40
4.3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum........................ 42
4.4. Hasil Pengaruh Waktu Maserasi.......................................... 42
4.5. Hasil Pengaruh Rasio Tepung Kuli Udang dengan
Pelarut Aseton..................................................................... 44
4.6. Karakterisasi Ekstrak dengan FTIR..................................... 46
iv
vi
4.7. Penentuan Konsentrasi Ekstrak dengan KCKT................... 48
4.8. Uji Antioksidan dengan Metode DPPH................................ 49
V. KESIMPULAN dan SARAN
5.1. Kesimpulan.......................................................................... 55
5.2. Saran................................................................................... 56
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................ 57
LAMPIRAN ...................................................................................... 63
v
DAFTAR TABELHalaman
Tabel 1. Komposisi Kimia Limbah Udang dan Kulit Udang............... 6Tabel 2. Perbandingan Sifat Fisik dari Gas, Cairan, dan Fluida
Superkritis............................................................................ 11Tabel 3. Beberapa Jenis Pelarut Organik dan Sifat Fisiknya............. 14Tabel 4. Spektrum Cahaya Tampak dan Warna-Warna
Komplementer..................................................................... 24Tabel 5. Pengaruh Waktu Maserasi terhadap Jumlah Ekstrak
Astasantin............................................................................ 34Tabel 6. Pengaruh Rasio Tepung Kulit Udang : Volume Aseton
terhadap Jumlah Ekstrak Astasantin................................... 34Tabel 7. Interpretasi Spektra FTIR ................................................... 36Tabel 8. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan dengan DPPH ..................... 38Tabel 9. Panjang Gelombang Maksimum Pelarut untuk Ekstraksi
Astasantin............................................................................ 42Tabel 10. Hasil Absorbansi Ekstrak Astasantin dari Perlakuan Waktu
Maserasi.............................................................................. 43Tabel 11. Hasil Absorbansi Ekstrak Astasantin dari Perlakuan Rasio
Pelarut................................................................................. 44Tabel 12. Interpretasi Spektra FTIR.................................................... 46Tabel 13. Nilai Inhibisi terhadap Konsentrasi pada Uji Antioksidan..... 49Tabel 14. Kisaran Kekuatan Potensi Antioksidan................................ 51
DAFTAR GAMBAR
Halaman
i
vi
ii
Gambar 1. Alat Soklet ............................................................................ 8
Gambar 2. Alat Craig ............................................................................. 9
Gambar 3. Model Kerja Alat Craig.......................................................... 10
Gambar 4. Struktur β-Karoten dan Astasantin........................................ 16
Gambar 5. Diagram Blok Spektrofotometer............................................ 25
Gambar 6................................................................................................ Spektra Infra Merah Ekstrak Astasantin 27
Gambar 7. Deskripsi kurva kalibrasi standar internal............................. 29
Gambar 8. Kerangka Berpikir................................................................. 30
Gambar 9. Alat Spektrofotometer Infra Merah ....................................... 35
Gambar 10. Pembuatan Tepung Kulit Udang ........................................ 39
Gambar 11. Ekstrak Astasantin Hasil Maserasi dengan 50 mL Aseton terhadap Waktu Maserasi ................................................. 40
Gambar 12. Ekstrak Astasantin Hasil Maserasi terhadap Volume Pelarut Aseton 50 mL Aseton Maserasi 5 Hari ............... 40
Gambar 13. Pemurnian Ekstrak Astasantin ........................................... 41
Gambar 14. Grafik Waktu Maserasi terhadap Nilai Absorbansi Ekstrak Astasantin ......................................................................... 43
Gambar 15. Grafik Rasio Pelarut Aseton terhadap Nilai Absorbansi Ekstrak Astasantin............................................................. 45
Gambar 16. Grafik Hubungan Inhibisi dengan Konsentrasi pada Metode DPPH................................................................. 52
vii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Bagan Pembuatan Tepung Kulit Udang.............................. 63
Lampiran 2 Bagan Penentuan Waktu Optimum........................... 64
Lampiran 3 Bagan ekstraksi Astasantin (Penentuan Rasio Pelarut
Optimum)............................................................................. 65
Lampiran 4 Bagan Karakterisasi Ekstrak Astasantin dengan
Spektrofotometer Infra Merah.............................................. 66
Lampiran 5 Bagan Pengujian Konsentrasi Ekstrak Astasantin dengan
KCKT................................................................................... 67
Lampiran 6 Bagan Pembuatan Larutan DPPH 0,4 mM Uji Aktivitas
Antioksidan.......................................................................... 68
Lampiran 7 Bagan Pembuatan Larutan Blanko Uji Aktivitas
Antioksidan.......................................................................... 69
Lampiran 8 Bagan Pembuatan Larutan Uji Aktivitas Antioksidan 70
Lampiran 9 Pembuatan Larutan Kontrol Uji Aktivitas
Antioksidan.................................................................................. 71
Lampiran 10 Spektra Infra Merah Hasil Ekstrak Astasantin......... 72
Lampiran 11 Hasil Analisis Puncak Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
untuk Standar Astasantin.................................................. 73
Lampiran 12 Hasil Analisis Puncak Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
untuk Ekstrak Astasantin................................................... 74
Lampiran 13 Perhitungan Konsentrasi Ekstrak Astasantin dengan
KCKT................................................................................. 75
Lampiran 14 Hasil Uji Antioksidan pada Ekstrak Astasantin dengan
DPPH................................................................................. 76
Lampiran 15 Perhitungan Aktivitas Antioksidan pada Metode DPPH
untuk Larutan Sampel Ekstrak Astasantin......................... 77
Lampiran 16 Perhitungan Aktivitas Antioksidan pada Metode DPPH
untuk Larutan Kontrol Asam Askorbat............................... 78
Lampiran 17 Perhitungan Nilai IC50 pada Metode DPPH........... 791viii
BAB IPENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Udang adalah komoditas handalan sektor perikanan yang umumnya
diekspor dalam bentuk beku. Indonesia merupakan salah satu negara
pengekspor udang terbesar di dunia. Pada proses pembekuan udang
(cold storage) dihasilkan limbah sebanyak 60-70% dari berat udang,
dalam bentuk kepala dan kulit udang. Limbah sebanyak ini, jika tidak
ditangani secara tepat, akan menimbulkan dampak negatif bagi
lingkungan, karena dapat menyebarkan bau busuk dan ketidaknyamanan
bagi lingkungan sekitarnya.
Selama ini pemanfaatan limbah kulit udang hanya terbatas untuk
campuran pakan ternak serta sumber kitin dan kitosan. Salah satu alasan
pemanfaatan limbah kulit udang sebagai pakan ternak adalah kandungan
karotenoid yaitu pigmen Astasantin pada kulit udang yang dapat
meningkatkan warna kuning telur ayam dan itik serta mencerahkan warna
kulit ikan hias.
Penelitian mengenai karotenoid dari kulit udang sebagai pigmen,
masih jarang ditemukan dan umumnya penelitian terhadap kulit udang
lebih difokuskan untuk menghasilkan kitin dan kitosan. Hal ini
menyebabkan perlu dilakukan penelitian mengenai pigmen karotenoid
yang terdapat pada kulit udang.
Karotenoid pada kulit udang berada dalam bentuk kompleks
karoteno protein yang apabila diberi perlakuan panas dapat menyebabkan
renggangnya ikatan karotenoid dengan protein sehingga warna kulit
udang dapat mengalami perubahan dari gelap menjadi merah terang
(Hendry dan Houghton, 1996). Menurut Khanafari et al. (2007), jenis
pigmen karotenoid utama yang terdapat pada kulit udang ialah Astasantin.
Astasantin merupakan kelompok pigmen karotenoid jenis xantofil yang
memiliki aktivitas antioksidan tertinggi dibandingkan jenis pigmen
1
2
karotenoid lainnya (Astawan dan Kasih, 2008; Hendry dan Houghton,
1996).
Salah satu metode untuk mengekstrak Astasantin dari limbah kulit
udang adalah maserasi dengan pelarut organik seperti aseton, metanol,
etanol, heksana, isopropanol, etil asetat, dan petroleum eter (Sachindra et
al., 2006). Menurut Mezzomo et al. (2011), metode maserasi dengan
pelarut aseton akan menghasilkan Astasantin bebas terbanyak diantara
jenis pelarut lainnya yaitu 131±2 g g−1ekstrak dan menurut Storebakken et
al. (2004), Astasantin bebas memiliki aktivitas antioksidan yang besar.
Selain itu metode maserasi dipilih karena tidak membutuhkan suhu tinggi
dalam pelaksanaannya sehingga sesuai dengan sifat pigmen Astasantin
yang yang tidak tahan pada suhu tinggi. Menurut Pu (2008), Astasantin
akan mulai terdegradasi pada suhu di atas 60°C, sehingga dalam
penelitian ini digunakan suhu maserasi yang tidak melebihi suhu 60°C.
Beberapa kegunaan Astasantin dalam industri pangan yaitu sebagai
pewarna, antioksidan, dan prekursor pembentukan vitamin A, (Hendry dan
Houghton, 1996). Oleh karena itu penelitian ini juga bertujuan untuk
melakukan uji terhadap aktivitas antioksidan pada ekstrak Astasantin dari
tepung kulit udang.
1.2. Identifikasi MasalahBerdasarkan latar belakang masalah di atas, masalah yang dapat
muncul dalam penelitian ini diantaranya :
1. Bagaimana proses pembuatan tepung kulit udang dari limbah
udang?
2. Apa metode yang tepat untuk mengekstrak Astasantin dari tepung
kulit udang?
3. Apa pelarut yang tepat untuk menghasilkan absorbansi ekstrak
yang besar?
4. Berapa lama waktu ekstraksi yang diperlukan untuk menghasilkan
absorbansi ekstrak yang besar?
3
5. Berapa perbandingan rasio pelarut dengan massa tepung udang
yang diperlukan untuk menghasilkan absorbansi ekstrak yang
besar?
6. Apakah ekstrak yang didapatkan berupa senyawa Astasantin?
7. Berapa besar konsentrasi ekstrak Astasantin yang terdapat pada
ekstrak tepung kulit udang?
8. Berapa besar aktivitas antioksidan ekstrak Astasantin tepung kulit
udang?
1.3. Pembatasan MasalahPada penelitian ini, masalah yang dikaji dibatasi untuk mengetahui
waktu ekstraksi dan perbandingan rasio pelarut dengan massa tepung
udang terhadap absorbansi ekstrak Astasantin, menginterpretasikan
senyawa hasil ekstrak yang didapat dengan spektrofotometer infra merah,
mengetahui konsentrasi ekstrak Astasantin dari tepung kulit udang
dengan metode KCKT, dan pengujian aktivitas antioksidan dilakukan
menggunakan uji penangkapan radikal 1,1-difenil-pikrilhidrazil (DPPH).
1.4. Perumusan MasalahBerdasarkan pembatasan masalah di atas, perumusan masalah pada
penelitian ini adalah :
1. Berapa lama waktu ekstraksi yang diperlukan untuk menghasilkan
ekstrak Astasantin yang besar?
2. Berapa perbandingan rasio pelarut dengan massa tepung kulit
udang yang diperlukan untuk menghasilkan
ekstrak Astasantin yang besar?
3. Apakah ekstrak yang didapatkan berupa senyawa Astasantin?
4. Berapa besar konsentrasi ekstrak Astasantin yang terdapat pada
ekstrak tepung kulit udang yang diukur menggunakan KCKT?
5. Berapa besar aktivitas antioksidan ekstrak Astasantin tepung kulit
udang jika diuji dengan metode DPPH?
4
1.5. Tujuan PenelitianPenelitian ini bertujuan untuk mendapatkan ekstrak Astasantin dari
tepung kulit udang dengan absorbansi ekstrak yang besar dan
mengetahui besar aktivitas antioksidan ekstrak Astasantin tepung kulit
udang dengan menggunakan metode DPPH.
1.6. Manfaat PenelitianPenelitian ini diharapkan dapat meningkatkan nilai guna limbah kulit
udang, memberi informasi mengenai absorbansi, konsentrasi, dan
aktivitas antioksidan ekstrak Astasantin dari tepung kulit udang.
BAB IILandasan Teori
2.1. Kajian Teori2.1.1. Udang
Udang adalah hewan yang hidup di perairan, khususnya sungai
maupun laut atau danau. Udang dapat ditemukan di hampir semua
genangan air yang berukuran besar, baik air tawar, air payau, maupun air
asin pada kedalaman bervariasi, dari dekat permukaan hingga beberapa
ribu meter di bawah permukaan. Udang diklasifikasikan sebagai berikut :
Filum : Arthropoda
Subfilum : Crustacea (binatang berkulit keras)
Sub Kelas : Malacrostraca (udang-udangan tingkat tinggi)
Super Ordo : Eucarida
Ordo : Decapoda (binatang berkaki sepuluh)
Sub Ordo : Natantia (kaki digunakan untuk berenang)
Famili : Palaemonidae, Penaidae
(Departemen Kelautan dan perikanan Republik Indonesia, 2003)
Udang biasa dijadikan makanan laut (seafood). Sama seperti
seafood lainnya, udang mengandung sejumlah besar kalsium dan protein,
tetapi rendah kalori. Makanan dengan bahan utama udang merupakan
sumber kolesterol.
Dewasa ini budi daya udang tambak telah berkembang dengan
pesat, karena udang merupakan komoditi ekspor yang dapat diandalkan
dalam meningkatkan ekspor non migas dan merupakan salah satu jenis
biota laut yang bernilai ekonomis tinggi. Indonesia merupakan salah satu
negara pengekspor udang terbesar di dunia dengan nilai ekspor antara
850 juta sampai 1 miliar dollar AS per tahun (Departemen Kelautan dan
Perikanan Republik Indonesia, 2006). Udang yang diekspor diantaranya
dalam bentuk beku (block frozen) yang terdiri dari produk head on (utuh),
headless (tanpa kepala) dan peeled (tanpa kepala dan kulit).
5
6
Usaha ekspor udang tersebut menghasilkan limbah udang dalam
jumlah cukup besar yang terdiri dari bagian kepala, kulit dan ekor. Limbah
udang yang dihasiikan dari proses pembekuan udang, pengalengan
udang dan pengolahan kerupuk udang berkisar antara 60-70 % dari berat
udang. Dengan demikian, jumlah bagian yang terbuang dari usaha
pengolahan udang cukup tinggi.
Di Indonesia saat ini ada sekitar 170 industri pengolahan udang
dengan kapasitas produksi sekitar 500.000 ton per tahun. Diperkirakan,
dari proses pengolahan oleh seluruh unit pengolahan yang ada, akan
dihasilkan limbah sebesar 325.000 ton per tahun (Departemen Kelautan
dan Perikanan Republik Indonesia, 2006). Limbah sebanyak itu, jika tidak
ditangani secara tepat, akan menimbulkan dampak negatif bagi
lingkungan sebab limbah tersebut dapat menimbulkan bau busuk yang
memberikan ketidaknyamanan pada lingkungan. Sebagian kecil dari
limbah udang sudah termanfaatkan dalam hal pembuatan kerupuk udang,
petis, terasi, dan bahan pencampur pakan ternak serta pupuk.
Pemanfaatan limbah udang tidak hanya memberikan nilai tambah
pada usaha pengolahan udang, tetapi juga dapat menanggulangi masalah
pencemaran lingkungan yang ditimbulkan, terutama masalah bau yang
dikeluarkan serta estetika lingkungan yang kurang baik (Manjang, 1993).
Limbah kulit udang mengandung konstituen utama yang terdiri dari
protein, kalsium karbonat, khitin, pigmen dan abu. Kulit udang
mengandung protein sebanyak (25 % - 40%), kalsium karbonat (CaCO3)
(45% - 50%) dan kitin (15% - 20%), tetapi besarnya kandungan komponen
tersebut tergantung pada jenis udangnya (Focher et al., 1992). Komposisi
kimia limbah udang dan kulit udang dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Komposisi Kimia Limbah Udang dan Kulit Udang (No et al, 1989)
Komposisi Limbah Udang Kulit Udang
Protein kasar (%) 35,8 16,9
Lemak (%) 9,9 0,6
7
Serat Kasar (%) 13,20 0
Abu (%) 38,1 63,6
Ca (%) 12,3 24,8
Astasantin (ppm) 78 108
Astasantin merupakan pewarna alam yang sehat dan aman
dimakan, maka perlu diuji metode esktraksi yang paling banyak
mengekstrak Astasantin. Pada penelitian digunakan metode ekstraksi
dengan cara maserasi menggunakan pelarut aseton.
2.1.2. EkstraksiEkstraksi merupakan proses pemisahan dua zat atau lebih dengan
menggunakan pelarut yang tidak saling campur. Pemindahan komponen
dari padatan ke pelarut pada ekstraksi padat-cair melalui tiga tahapan,
yaitu difusi pelarut ke pori-pori padatan atau ke dinding sel, di dalam
dinding sel terjadi pelarutan padatan oleh pelarut, dan tahapan terakhir
adalah pemindahan larutan dari pori-pori menjadi larutan ekstrak.
Ekstraksi padat-cair dipengaruhi oleh waktu ekstraksi, suhu, pengadukan,
dan banyaknya pelarut yang digunakan (Harborne, 1987). Tingkat
ekstraksi bahan ditentukan oleh ukuran partikel bahan tersebut. Bahan
yang diekstrak sebaiknya berukuran seragam untuk mempermudah
kontak antara bahan dan pelarut sehingga ekstraksi berlangsung dengan
baik. Ekstraksi dapat dilakukan dengan berbagai cara yaitu ekstraksi
bertahap, ekstraksi kontinyu, ekstraksi counter current dan ekstraksi fluida
super kritis.
a. Ekstraksi Bertahap
Ekstraksi bertahap adalah metode ekstraksi yang paling mudah dan
sederhana, dan pada pengerjaannya hanya memerlukan corong pisah.
Pada metode ini larutan sampel yang akan diekstrak, dimasukkan ke
dalam corong pisah, kemudian tambahkan pelarut yang sesuai. Campuran
A schematic representation of a Soxhlet extractor1: Stirrer bar2: Still pot (the still pot should not be overfilled and the volume of solvent in the still pot should be 3 to 4 times the volume of the soxhlet chamber)3: Distillation path4: Thimble5: Solid6: Siphon top7: Siphon exit8: Expansion adapter9: Condenser10: Cooling water in11: Cooling water out
B
A
C
8
tersebut kemudian digoncang beberapa lama sampai komponen yang
diekstrak berada dalam kesetimbangan dengan komponen yang terdapat
dalam sampel. Diamkan larutan sampai pelarut dan larutan sampel
terpisah. Pelarut yang mengandung komponen sampel yang diekstrak
dipindahkan ke dalam wadah lain untuk dianalisis Iebih lanjut.
b. Ekstraksi Kontinyu
Ekstraksi kontinyu dapat dilakukan dengan menggunakan sokletasi.
Sokletasi dilakukan dengan pemanasan, sehingga uap yang timbul
setelah dingin secara kontinyu akan membasahi sampel, secara teratur
pelarut tersebut akan kembali kedalam labu dengan membawa senyawa
kimia yang terekstrak oleh pelarut tersebut. Pada gambar 1 menunjukkan
bagian dari alat soklet. Perangkat untuk sokletasi terdiri dari kolom
ekstraksi (B) yang dilengkapi dengan pipa-pipa penghubung di salah satu
kolom, labu bulat (A), kondesor dan alat pemanas.
Gambar 1. Alat Soklet (anonim, 2013)
Jika sampel yang akan diekstrak berupa zat padat, maka zat tersebut
dihaluskan, kemudian dimasukkan ke dalam sebuah tabung yang terbuat
dari kertas yang kalis air. Selanjutnya tabung (kertas yang berisi sampel)
9
tersebut dimasukkan ke dalam kolom B. Lalu dimasukkan beberapa butir
batu didih kedalam labu A. Susun alat seperti gambar 1 sokletasi. Isi labu
A dengan pelarut. Kemudian alirkan air pendingin, nyalakan alat pemanas,
sehingga pelarut dalam labu A mendidih. Uap dari labu A naik akan naik
ke kolom B melalui pipa C. Dalam kolom B, uap dari pelarut akan
terkondensasi menjadi cair, dan setelah beberapa lama, sampel yang ada
dalam tabung kertas akan terendam dengan cairan pelarut.
Karena labu A terus dipanaskan, maka uap dari pelarutnya terus
menerus terbentuk, dan tabung B lama kelamaan akan penuh dengan
pelarut. Jika permukaan pelarut sama tinggi dengan permukaan pipa di
sisi soklet, secara otomatis pelarut ini akan masuk ke dalam labu A sambil
membawa komponen yang terlarut. Proses ini terus berlangsung selama
alat pemanas dinyalakan. Akhirnya pada labu A akan terkumpul
komponen yang diekstraksi, dan pada kolom B tinggal komponen yang
tidak terekstraksi.
c. Ekstraksi Counter Current (Ekstraksi Craig)
Sebuah metode multiple ekstraksi cair-cair adalah ekstraksi
berlawanan, yang memungkinkan pemisahan zat dengan koefisien
distribusi yang berbeda (rasio). Lyman C. Craig pada tahun 1943
menciptakan desain cerdas untuk metode ekstraksi berlawanan yang
dikenal sebagai alat Craig seperti pada gambar 2.
Gambar 2. Alat Craig. Dioperasikan secara manual yang terdiri dari 25 tabung ( E.
Efstathiou, 2000)
10
Prinsip kerja alat Craig adalah ekstraksi berganda yang dilakukan
berulang-ulang seperti pada gambar 3. Dalam perhitungannya diandaikan
bahwa koefisien distribusi (Kd) = 1, dan volume fasa organik maupun
volume fasa air jumlahnya sama.
Gambar 3. Model Kerja Alat Craig ( E. Efstathiou, 2000)
d. Ekstraksi Fluida kritis
Ekstraksi fluida superkritis adalah suatu proses ekstraksi
menggunakan fluida superkritis sebagai pelarut. Teknologi ekstraksi ini
memanfaatkan kekuatan pelarut dan sifat fisik dari komponen murni atau
campuran pada temperatur dan tekanan kritisnya dalam keseimbangan
fase (Palmer, 1995). Fluida superkritis adalah fluida dengan tekanan dan
suhu di atas titik kritisnya (Mc Hugh dan Krukonis, 1986), yaitu suatu
keadaan dimana fluida berada dalam keadaan seimbang antara fase gas
dan fase cairnya. Untuk beberapa zat misalnya suhu dan tekanan
kritisnya ialah 31°C dan 73 atm.
Fluida kritis mempunyai kerapatan dan daya pelarutan yang sama
dengan pelarut-pelarut cair, namun mempunyai karakteristik tertentu yaitu
daya difusinya sangat cepat dan viskositasnya sama dengan viskositas
11
gas. Daya pelarutan yang mirip cairan dan difusi yang mirip gas ini
menghasilkan kondisi yang ideal untuk mengekstraksi zat dari berbagai
bahan dengan tingkat perolehan yang tinggi dalam waktu yang singkat.
Kerapatan fluida super kritis yang dapat divariasikan dan dikendalikan
dengan mengatur tekanan dan suhu.
Tabel 2. Perbandingan Sifat Fisik Dari Gas, Cairan, dan Fluida Superkritis (Sumber
: Hübshmann, H.J., 2009)
FaseDensitas(g.cm-3)
Difusivitas(cm2.s-1)
Viskositas (g.cm-1.s-1)
Gas 10-3 10-1 10-4
Fluida Superkritis 0,1-1,0 10-3-10-4 10-3-10-4
Cair 1 <10-5 10-2
Biasanya untuk ekstraksi fluida super kritis digunakan gas CO2. Sifat
gas CO2 yang non polar, mudah mencair, dan mudah melarutkan
senyawa-senyawa organik yang non polar. Daya larut dan sifat kepolaran
gas CO2 dapat ditingkatkan atau dikurangkan dengan memfariasikan suhu
dan tekanan.Tetapi jika peningkatan suhu dan tekanan tidak dapat
meningkatkan kepolarannya, sehingga tidak dapat melarutkan senyawa-
senyawa non polar, maka perlu ditambahkan sedikit pelarut lain “modifier”
seperti metanol, isopropanol, asetonitril, air atau benzena. Kelarutan
komponen dalam fluida superkritis tergantung pada densitas dari pelarut,
juga afinitas fisik kimia dari zat terlarut terhadap pelarut.
Selain itu menurut jenis bahan yang diekstrak, ekstraksi dibedakan
menjadi padat-cair, yaitu dengan cara sokletasi, perkolasi dan maserasi
dengan atau tanpa pemanasan. Metode lain yang lebih sederhana dalam
mengekstrak padatan adalah dengan mencampurkan seluruh bahan
dengan pelarut, lalu memisahkan larutan dengan padatan tak terlarut.
12
a. Sokletasi
Ekstraksi dengan menggunakan alat soklet ini dipakai untuk
mengekstrak senyawa organik dari bahan alam seperti daun, akar, dan
batang. Keuntungan ekstraksi dengan metode ini yaitu sampel dan pelarut
yang diperlukan sedikit, proses ekstraksi berlangsung cepat, dan dapat
mengambil senyawa organik dengan optimal. Kekurangan metode ini yaitu
tidak baik digunakan untuk mengekstraksi senyawa yang dapat rusak
karena pemanasan (Dinda, 2008).
b. Perkolasi
PerkoIasi adalah ekstraksi dengan mengalirkan pelarut melalui
serbuk sampel bahan alam yang telah dibasahi. Keuntungan metode ini
yaitu sampel padat telah terpisah dari ekstrak. Kekurangan metode ini
adalah, pelarut tidak melarutkan komponen secara optimal (Dinda, 2008).
c. Maserasi
Maserasi adalah perendaman sampel dalam pelarut organik pada
temperatur ruangan. Saat perendaman, senyawa bahan alam dapat
terekstrak karena terjadi pemecahan dinding dan membran sel akibat
perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar (Lenny, 2006).
Keuntungan metode ini adalah peralatan yang digunakan sederhana dan
balk untuk senyawa bahan alam yang tidak tahan panas. Kekurangan dari
metode ini adalah membutuhkan waktu lama dan banyak pelarut.
Menurut Harborne (1987), metode maserasi digunakan untuk
mengekstrak jaringan tanaman yang belum diketahui kandungan
senyawanya yang kemungkinan bersifat tidak tahan panas sehingga
kerusakan komponen tersebut dapat dihindari. Kekurangan dari metode
ini adalah waktu yang relatif lama dan membutuhkan banyak pelarut.
Ekstraksi dengan metode maserasi menggunakan prinsip kelarutan.
Prinsip kelarutan adalah like dissolve like, yaitu (1) pelarut polar akan
melarutkan senyawa polar, demikian juga sebaliknya pelarut nonpolar
13
akan melarutkan senyawa nonpolar, (2) pelarut organik akan melarutkan
senyawa organik. Ekstraksi senyawa aktif dari suatu jaringan tanaman
dengan berbagai jenis pelarut pada tingkat kepolaran yang berbeda
bertujuan untuk memperoleh hasil yang optimum, baik jumlah ekstrak
maupun senyawa aktif yang terkandung dalam contoh uji.
Polaritas sering diartikan sebagai adanya pemisahan kutub
bermuatan positif dan negatif dari suatu molekul sebagai akibat
terbentuknya konfigurasi tertentu dari atom-atom penyusunnya. Dengan
demikian, molekul tersebut dapat tertarik oleh molekul yang lain yang juga
mempunyai polaritas yang kurang lebih sama. Besarnya polaritas dari
suatu pelarut proporsional dengan besarnya konstanta dielektriknya
(Adnan, 1997). Menurut Stahl (2003), konstanta dielektrik (ε) merupakan
salah satu ukuran kepolaran pelarut yang mengukur kemampuan pelarut
untuk menyaring daya tarik elektrostatik antara isi yang berbeda.
Pelarut yang bersifat polar mampu mengekstrak senyawa seperti
komponen fenolik, karotenoid, tannin, dan asam-asam amino. Pelarut non
polar dapat mengekstrak senyawa kimia seperti lilin, lemak, dan minyak
yang mudah menguap. Metanol merupakan senyawa polar yang umum
disebut sebagai pelarut universal karena selain mampu mengekstrak
komponen polar juga dapat mengestrak komponen non polar seperti lilin
dan lemak
Prosedur klasik untuk memperoleh kandungan senyawa organik dari
jaringan tumbuhan kering adalah dengan proses ekstraksi
berkesinambungan atau bertingkat dengan menggunakan beberapa
pelarut yang berbeda tingkat kepolarannya (Harborne 1987). Ekstraksi
berkesinambungan dilakukan secara berturut-turut dimulai dengan pelarut
nonpolar (misalnya n-heksan atau kloroform) dilanjutkan dengan pelarut
semipolar (etil asetat atau dietil eter) kemudian dilanjutkan dengan pelarut
polar (metanol atau etanol). Pada proses ekstraksi akan diperoleh ekstrak
awal (crude extract) yang mengandung berturut-turut senyawa nonpolar,
semipolar, dan polar. Hasil ekstrak yang diperoleh tergantung pada
14
beberapa faktor, yaitu kondisi alamiah senyawa tersebut, metode
ekstraksi yang digunakan, ukuran partikel contoh uji, kondisi dan waktu
penyimpanan, lama waktu ekstraksi, dan perbandingan jumlah pelarut
terhadap jumlah contoh uji.
Pelarut yang digunakan untuk proses ekstraksi harus memenuhi
beberapa persyaratan yaitu pelarut tersebut merupkan pelarut terbaik
untuk bahan yang akan diekstraksi dan pelarut tersebut harus terpisah
dengan cepat setelah pengocokkan. Beberapa jenis pelarut organik yang
umum digunakan disertai sifat-sifat fisiknya dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Beberapa Jenis Pelarut Organik dan Sifat Fisiknya (Nur dan Adijuwana, 1989)
PelarutTitik Didih
(°C)Titik Beku
(°C)Konstanta Dielektrik
Dietil eter 35 -116 4,3
Karbon disulfit 46 -111 2,6
Aseton 56 -95 20,7
Kloroform 61 -64 4,8
MetanoI 65 -98 32,6
Tetrahidrofuran 66 -65 7,6
Di-isopropil eter 68 -60 3,9
N-heksan 69 -94 1,9
Karbon
tetraklorida
76 -23 2,2
Etil asetat 77 -84 6,0
Etanol 78 -117 24,3
Benzena 80 5,5 23
Siklolieksana 81 6,5 2,0
Isopropanol 82 -89 18,3
Air 100 0 78,5
Dioksan 102 12 2,2
Toluena 111 -95 2,4
Asam asetat
glacial
118 17 6,2
15
N.N dimetil
formamida
154 61 34,8
Dietilenaglikol 245 -10 37,7
Kelarutan suatu zat di dalam pelarut bergantung pada jenis ikatan di
dalamnya apakah polar atau non polar. Zat yang polar seperti air hanya
larut di dalam pelarut polar, sedangkan zat-zat non polar hanya larut di
dalam pelarut non polar.
Metode maserasi dengan pelarut organik telah digunakan untuk
mengekstrak karotenoid dari limbah kulit udang karena tidak memerlukan
suhu tinggi dalam pelaksanaannya (Sachindra et al., 2006). Menurut Pu
(2008), Astasantin yang merupakan jenis karotenoid utama dalam kulit
udang akan mulai terdegradasi pada suhu di atas 60°C. Karotenoid yang
terdapat pada kulit udang berikatan dengan protein membentuk kompleks
karotenoprotein sehingga dalam metode maserasi diperlukan jenis pelarut
organik yang dapat memutuskan ikatan karotenoid dengan protein
(Hendry dan Houghton, 1996).
2.1.3. Astasantin (Pigmen Karotenoid)Astasatin merupakan sebuah pigmen warna karotenoid. Nama
karotenoid berasal dari pigmen utama wortel (Daucus carota). Karotenoid
merupakan kelompok pigmen alami yang berperan cukup baik dalam
memberikan warna kuning, oranye, dan merah. Warna itu adalah akibat
dari adanya ikatan rangkap dua yang terkonyugasi. Makin banyak ikatan
rangkap yang terkonyugasi dalam molekul, pita serapan utama makin
bergeser ke daerah panjang gelombang yang lebih tinggi; akibatnya, rona
makin merah. Diperlukan minimum tujuh ikatan rangkap terkonyugasi
sebelum warna kuning yang dapat diserap timbul. Warna yang dihasilkan
dari karotenoid merupakan warna sitentik, namun telah dianggap ‘sama
dengan pewarna alam’ dan karena itu tidak perlu pemeriksaan toksikologi
secara ketat seperti bahan tambah lain (DeMan, 1997).
β-Karoten Astasantin
16
Karotenoid merupakan golongan besar senyawa yang tersebar luas
dalam produk yang berasal dari hewan dan tumbuhan. Pigmen ini
terdapat dalam ikan dan krustasea, sayur dan buah, telur, produk susu,
dan serealia. Pada hewan air senyawa karotenoid banyak ditemukan pada
kulit, kulit, dan kerangka luar (eksoskeleton). Selain itu, karotenoid juga
dapat ditemukan pada bakteri, kapang, ganggang, dan tanaman hijau
(Hendry dan Houghton,1996). Karotenoid yang terkandung pada hewan
disebabkan oleh aktivitas hewan tersebut yang mengkonsumsi tumbuh-
tumbuhan yang mengandung komponen karotenoid, seperti inisalnya
warna merah muda pada salmon dan kulit udang yang disebabkan
adanya komponen karotenoid jenis Astasantin yang berasal dari tumbuh-
tumbuhan laut yang dimakannya (Schwartz, 1994).
Berdasarkan unsur-unsur penyusunnya, karotenoid digolongkan
menjadi dua kelompok pigmen, yaitu karoten dan xantofil. Karoten
memiliki susunan kimia yang hanya terdiri dari gugus C dan H seperti
alfa, beta, dan gamma karoten, sedangkan xantofil terdiri atas gugus
atom C, H, dan O. Contoh-contoh dari senyawa yang termasuk golongan
xantofil yaitu kantaxantin, Astasantin, kapaxantin, rodoxanthin, dan
torularhodin (Hendry dan Houghton, 1996). Menurut Khanafari et al.
(2007), Astasantin merupakan jenis karotenoid utama yang terdapat
pada kulit udang.
Gambar 4. Struktur β-Karoten dan Astasantin (DeMan, 1997)
2.1.4. Karotenoid Alami dalam Menangkal Radikal BebasKarotenoid merupakan kelompok pigmen warna dan antioksidan
alami yang dapat meredam radikal bebas. Sebagai pigmen warna,
karetonoid dapat memunculkan warna kuning jingga dan merah pada
tanaman maupun kulit hewan (Gross, 1991; Roddrigues-Amaya, 2004;
17
Stahl dan Sies, 2003). Selain sebagai pigmen warna, karotenoid juga
merupakan sumber prekursor vitamin A, antioksidan, peningkatan daya
tahan tubuh, dan pengubahan metabolisme kanker (Zeb dan Mehmod,
2004).
Ditinjau karotenoid sebagai penangakap radikal bebas (antioksidan),
maka karotenoid dapat berfungsi sebagai pemadam oksigen singlet dan
pendeaktifasi radikal bebas (Palozza dan Krinsky, 1992; dalam Rodriguez-
Amaya, 2001). Strategi pertahanan karotenoid adalah yang paling
mungkin dalam pencarian dua spesies oksigen berupa molekul singlet
oksigen (1O2) dan peroksida radikal. Lebih lanjut karotenoid adalah
deaktivator efektif terhadap sensitaizer elektron exitasi molekul, dengan
melibatkan generasi dari radikal dan singlet oksigen. Interaksi dari
karotenoid dengan 1O2 tergantung kekuatan pemadaman proses fisika,
dimana terlibat langsung energi transfer diantara kedua molekul. Energi
dari molekul singlet oksigen berpindah ke molekul karotenoid, selanjutnya
diperoleh ground state (keadaan dasar) oksigen dan ketriplet exitasi
karotenoid (Stahl dan Sies, 2003). Kelebihan energi dari molekul yang
tereksitasi akan ditransfer melalui mekanisme pelepasan energi.
Mekanisme karotenoid sebagai pemadam oksigen singlet adalah:1O2 + 1Karotenoid 3O2 + 3Karotenoid
Energi akan dilepas melalui interaksi rotasi dan vibrasi antara
karotenoid triplet dengan pelarut untuk mengembalikan karotenoid
kekeadaan semula (He, dkk., 2000; Palva dan Russel, 1999; Pokorny dan
Gordon, 2001, Stahl dan Sies, 2003).3Karotenoid* 1Karotenoid + energi panas
Fungsi karotenoid sebagai pendeaktivasi radikal bebas terjadi
melalui proses transfer elektron. Reaksi karotenoid sebagai
pendeaktivasi radikal bebas adalah:
R* + Karotenoid RH + Karotenoid*
R’ + Karotenoid R- + Karotenoid+
18
Karotenoid jenis Astasantin yang merupakan karotenoid utama pada
hewan golongan crustacea seperti lobster, udang, dan kepiting
merupakan jenis karotenoid yang memiliki aktifitas antioksidan terkuat
(Astawan dan Kasih, 2008). Menurut Naguib (2000), aktifitas antioksidan
pada Astasantin 10 kali lebih kuat dibandingkan dengan jenis karotenoid
lainnya. Aktivitas antioksidan pada karotenoid didasarkan pada
kemampuan karoten untuk menangkal singlet oxygen dan radikal proksil.
Kemampuan karotenoid dalam menangkal singlet oxygen sangat
bergantung pada jumlah ikatan rangkap molekul yang terkonjugasi.
2.1.5. AntioksidanAntioksidan didefinisikan sebagai senyawa yang dapat menunda,
memperlambat, dan mencegah proses oksidasi lipid. Dalam arti khusus,
antioksidan adalah zat yang dapat menunda atau mencegah terjadinya
reaksi antioksidasi radikal bebas dalam oksidasi lipid.
Tubuh dapat menghasilkan antioksidan yang berupa enzim yang
aktif bila didukung oleh nutrisi pendukung atau mineral yang disebut juga
ko-faktor. Antioksidan yang dihasilkan oleh tubuh antara lain:
1. Superoksida dismulase
Antioksidan ini merupakan enzim yang bekerja bila ada
pembantunya yaitu berupa mineral-mineral seperti tembaga, mangan
yang bersumber pada kacang-kacangan, padi-padian. Dengan demikian
sangat diperlukan sekali mengkonsumsi bahan tersebut di atas.
Sayangnya kita lebih senang mengkonsumsi bahan yang enak dimakan.
Bagi orang yang mampu, kekurangan mineral dapat dilakukan dengan
meminum multivitamin dan suplemen mineral tetapi bagi orang yang
hidupnya biasa saja lebih balk mengkonsumsi mineral dari tanaman
karena banyak juga tanaman yang dapat menghasilkan SOD antara lain
brokoli, bayam, sawi dan juga hasil-hasil olahan seperti tempe.
2. Glutathione peroksidase
19
Adalah enzim yang berperan aktif dalam menghilangkan H2O2 dalam
tubuh dan mempergunakannya untuk merubah glutathione (GSH) menjadi
glutathine teroksidasi (GSSG).
Enzim tersebut mendukung aktivitas enzim SOD bersama-sama
dengan enzim katalase dan menjaga absorbansi ekstrak oksigen akhir
agar stabil dan tidak berubah menjadi pro-oksidan. Makanan yang kaya
glutahione adalah kubis, brokoli, asparagus, alpukat dan kenari.
Glutathione sangat penting sekali melindungi selaput-selaput sel.
Senyawa ini merupakan tripeptida yang terdiri dari asam amino glisin,
asam glutamat dan sistein.
3. Katalase
Enzim katalase di samping mendukung aktivitas enzim SOD juga
dapat mengkatalisa perubahan berbagai macam peroksida dan radikal
bebas menjadi oksigen dan air.
Enzim-enzim tersebut di atas dalam bekerjanya sengat
membutuhkan mineral-mineral penyusun sebagai berikut :
• Copper (Cu)
• Zinc (Zn)
• Selenium (Se)
• Manganese (Mn)
• Besi (Fe)
Berdasarkan sumbernya, antioksidan di luar tubuh dapat
dikelompokkan menjadi dua kelompok, yaitu antioksidan sintetik
(antioksidan yang diperoleh dari hasil sintesis reaksi kimia) dan
antioksidan alami (antioksidan hasil ekstraksi bahan alami) (Kochar and
Rossell, 1990).
Antioksidan alami di dalam makanan dapat berasal dari (a) senyawa
antioksidan yang sudah ada dari satu atau dua komponen makanan, (b)
senyawa antioksidan yang terbentuk dari reaksi-reaksi selama proses
pengolahan, (c) senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami dan
ditambahkan ke makanan sebagai bahan tam bahan pangan (Pratt, 1992).
Asupan bahan makanan yang mengandung antioksidan kuat
dibutuhkan bila kapasitas antioksidan dalam tubuh menurun. Terdapat
20
banyak sekali jenis makanan yang memiliki kekuatan antioksidan,
misalnya β-karoten, vitamin A, E dan C.
Terdapat sekitar 732 jenis antioksidan dari golongan karotenoid.
Karotenoid tidak bisa disintesis oleh tubuh, karena itu antioksidan jenis ini
diperoleh dari asupan makanan. Terdapat dua kelas antioksidan dari
kelompok karotenoid, yaitu xantofil dan karoten. Antioksidan dari kelas
karoten misalnya β-karoten dan likopen, sedangkan dari kelas xantotil
contohnya Iutein dan Astasantin. Berdasarkan fungsinya, antioksidan
dapat dibedakan atas:
1. Antioksidan primer
Antioksidan ini berfungsi untuk mencegah terbentuknya radikal
bebas baru, karena antioksidan ini dapat merubah radikal bebas yang ada
menjadi molekul yang berkurang dampak negatifnya, sebelum sempat
bereaksi. Antioksidan primer yang ada dalam tubuh adalah enzim
superoksida dismutase. Enzim ini sangat penting karena dapat melindungi
sel-sel tubuh dari serangan radikal bebas. Kerja enzim ini sangat
dipengaruhi oleh mineral seperti mangan, seng, tembaga dan selenium
yang terdapat dalam makanan.
2. Antioksidan sekunder
Antioksidan sekunder merupakan senyawa yang berfungsi
menangkap radikal bebas serta mencegah terjadinya reaksi berantai
sehingga tidak terjadi kerusakan yang lebih besar. Contoh antioksidan
sekunder adalah vitamin E, vitamin C dan beta karoten yang dapat
diperoleh dari buah-buahan.
3. Antioksidan tersier
Antioksidan tersier merupakan senyawa yang memperbaiki sel-sel
dan jaringan yang rusak karena serangan radikal bebas. Biasanya yang
termasuk kelompok ini adalah jenis enzim, misalnya metionin sulfoksidan
reduktase yang dapat memperbaiki DNA dalam inti sel. Enzim ini
bermanfaat untuk perbaikan DNA pada penderita kanker.
4. Oxygen scavenger
21
Antioksidan yang termasuk oxygen scavenger mengikat oksigen
sehingga tidak mendukung reaksi oksidasi. misalnya vitamin C.
5. Chelator /sesquesstrant
Antioksidan jenis ini mengikat logam yang mampu mengkatalisis
reaksi oksidasi, misalnya asam sitrat dan asam amino.
Mekanisme kerja antioksidan secara umum adalah menghambat
oksidasi Iemak. Oksidasi lemak terdiri dari tiga tahap utama, yaitu inisiasi,
propagasi, dan terminasi. Pada tahap inisiasi terjadi pembentukan radikal
asam lemak, yaitu suatu senyawa turunan asam lemak yang bersifat tidak
stabil dan sangat reaktif akibat dari hilangnya satu atom hidrogen. Pada
tahap propagasi, radikal asam lemak akan bereaksi dengan oksigen
membentuk radikal peroksi. Radikal peroksi akan menyerang asarn lemak
menghasilkan hidroperoksida dan radikal asam lemak baru.
Hidroperoksida yang terbentuk bersifat tidak stabil dan akan terdegradasi
lebih lanjut menghasilkan senyawa-senyawa karbonil rantai pendek
seperti aldehida dan keton yang bertanggungjawab atas flavor makanan
berlemak (Gordon, 1990).
Proses penuaan dan penyakit degeneratif seperti kanker
kardiovaskuler, penyumbatan pembuluh darah yang meliputi
hiperlipidemik, aterosklerosis, stroke, dan tekanan darah tinggi serta
terganggunya sistem imun tubuh dapat disebabkan oleh stres oksidatif.
Stres oksidatif adalah keadaan tidak seimbangnya jumlah oksidan dan
prooksidan dalam tubuh. Pada kondisi ini, aktivitas molekul radikal bebas
atau reactive oxygen species (ROS) dapat menimbulkan kerusakan
seluler dan genetika. Kekurangan zat gizi dan adanya senyawa xenobiotik
dari makanan atau lingkungan yang terpolusi akan memperparah keadaan
tersebut.
Umumnya masyarakat Jepang atau beberapa masyarakat Asia
jarang memiliki masalah dengan berbagai penyakit degeneratif. Hal ini
disebabkan oleh menu sehat tradisionalnya yang kaya zat gizi dan
komponen bioaktif. Zat-zat ini mempunyai kemampuan sebagai
22
antioksidan, yang berperan penting dalam menghambat reaksi kimia
oksidasi yang dapat merusak makromolekul dan dapat menimbulkan
berbagai masalah kesehatan.
Peran positif antioksidan terhadap penyakit kanker dan
kardiovaskuler (terutama yang diakibatkan oleh aterosklerosis
(penyumbatan) dan penyempitan pembuluh darah) juga banyak diteliti.
Antioksidan berperan dalam melindungi lipoprotein densitas rendah (LDL)
dan sangat rendah (VLDL) dari reaksi oksidasi. Pencegahan
aterosklerosis ini dapat dilakukan dengan menghambat oksidasi LDL
menggunakan antioksidan yang banyak ditemukan pada bahan pangan.
Untuk kanker dan tumor, banyak ilmuwan spesialis setuju bahwa penyakit
ini berawal dari mutasi gen atau DNA sel. Perubahan pada mutasi gen
dapat terjadi melalui mekanisme kesalahan replikasi dan kesalahan
genetika yang berkisar antara 10-15 %, atau faktor dari luar yang merubah
struktur DNA seperti virus, polusi, radiasi, dan senyawa xenobiotik dari
konsumsi pangan sebesar 80-85 %. Radikal bebas dan reaksi oksidasi
berantai yang dihasilkan berperan pada proses mutasi ini. Resiko ini dapat
dikurangi dengan mengkonsumsi antioksidan dalam jumlah yang cukup.
2.1.6. Ekstraksi Astasantin dari Tepung Kulit Udang Sebagai Antioksidan Alami
Ekstraksi Astasantin dari tepung kulit udang dapat dilakukan dengan
menggunakan metode maserasi, karena metode maserasi tidak
memerlukan suhu tinggi dalam pelaksanaannya. Hal ini sesuai dengan
sifat pigmen Astasantin yang merupakan jenis karotenoid utama pada kulit
udang yang tidak tahan pada suhu tinggi. Menurut Pu (2008), Astasantin
akan mulai terdegradasi pada suhu diatas 60°C, sehingga dalam
penelitian ini digunakan suhu maserasi yang tidak melebihi suhu 60°C.
Pada proses maserasi tepung kulit udang diperlukan suatu pelarut
yang tepat, menurut Sachindra et al. (2006) pelarut organik merupakan
pelarut yang baik untuk mengekstrak karotenoid dari limbah kulit udang.
23
Karotenoid yang terdapat pada kulit udang berikatan dengan protein
membentuk kompleks karotenoprotein sehingga dalam metode maserasi
diperlukan jenis pelarut organik yang dapat memutuskan ikatan karotenoid
dengan protein (Hendry dan Houghton, 1996). Kelarutan suatu zat di
dalam pelarut bergantung pada jenis ikatan di dalamnya apakah polar
atau non polar. Zat yang polar seperti air hanya larut di dalam pelarut
polar, sedangkan zat-zat non polar hanya larut di dalam pelarut non polar.
Pelarut yang bersifat polar mampu mengekstrak senyawa seperti
komponen fenolik, karotenoid, tannin, dan asam-asam amino. Pelarut non
polar dapat mengekstrak senyawa kimia seperti lilin, lemak, dan minyak
yang mudah menguap.
Menurut Khanafari et al. (2007), jenis pigmen karotenoid utama yang
terdapat pada kulit udang ialah Astasantin. Astasantin merupakan
kelompok pigmen karotenoid jenis xantofil yang memiliki aktivitas
antioksidan tertinggi dibandingkan jenis pigmen karotenoid lainnya
(Astawan dan Kasih, 2008; Hendry dan Houghton, 1996). Menurut
Mezzomo et al. (2011), metode maserasi dengan pelarut aseton
mengandung Astasantin bebas terbanyak diantara jenis pelarut lainnya
yaitu 131±2 g g−1ekstrak dan menurut Storebakken et al. (2004), Astasantin
bebas memiliki antioksidan yang besar.
Struktur karotenoid mempengaruhi bioaktivitas yang dimilikinya,
seperti faktor ikatan rangkap, rantai terbuka, dan sedikitnya jumlah
substituen oksigen akan meningkatkan aktivitas antioksidan karotenoid (Di
Mascio et al., 1989). Salah satu cara meningkatkan aktivitas antioksidan
alami dari limbah kulit udang yaitu dengan maserasi menggunakan pelarut
aseton, hal ini dikarenakan hasil karotenoid yang didapat berupa
Astasantin dalam bentuk bebas. Ketidakstabilan Astasantin bebas
terhadap cahaya, oksigen, kadar asam, dan suhu tinggi membuat
Astasantin bebas ini mudah teroksidasi, degradasi, dan isomerisasi. Hal
tersebut membuat kemampuan Astasantin bebas sebagai antioksidan
dalam menangkap radikal bebas semakin meningkat (Storebakken, 2004).
24
2.1.7. Spektrofotometri UV-VisTeknik spektroskopik adalah salah satu teknik analisis fisiko-kimia
yang mengamati interaksi antara atom atau molekul dengan radiasi
elektromagnetik (REM). Terdapat tiga jenis spektrum yang dihasilkan
antara atom atau molekul dengan REM, diantaranya adalah hamburan,
absorpsi, dan emisi. Salah satu spektrum absorpsi REM adalah
spetrofotometri UV-Visibel (Mulja, 1995:19).
Spektrofotometri UV-Visibel (UV-Vis) merupakan teknik analisis
spektroskopik yang memakai sumber radiasi elektromagnetik ultra violet
(190 - 380 nm) dan sinar tampak (380 – 780 nm) dengan memakai
instrumen spektrofotometer (Mulja, 1995:26). Spektrofotometri UV – Vis
lebih banyak digunakan untuk analisis kuantitatif daripada kualitatif karena
melibatkan energi elektronik pada molekul yang dianalisis. Panjang
gelombang yang terpilih harus memiliki warna berbeda dengan sampel
(warna komplementer).Tabel 4. Spektrum Cahaya Tampak dan Warna-Warna Komplementer (Day, 2002)
Panjang Gelombang (nm)
Warna yang diabsorp
Warna komplementer
400-435 Violet Kuning-hijau
435-480 Biru Kuning
480-490 Hijau-biru Jingga
490-500 Biru-hijau Merah
500-560 Hijau Ungu
560-580 Kuning-hijau Violet
580-595 Kuning Biru
595-610 Jingga Hijau-biru
610-750 Merah Biru-hijau
Spektrofotometer UV-Vis terdiri dari beberapa bagian penting, yaitu:
sumber radiasi (sinar), monokromator, sel (tempat) sampel dan detektor
25
yang dihubungkan dengan printer atau komputerisasi (Sitorus, 2009).
Runtunan instrumentasi ini akan menghasilkan nilai absorbansi yang
sesuai dengan panjang gelombang yang dikehendaki.
Gambar 5. Diagram Blok Spektrofotometer
(http://faculty.sdmiramar.edu/fgarces/LabMatters/Instruments/UV_Vis/Cary50.htm)
Hubungan antara besarnya absorbansi dan konsentrasi sampel
dirumuskan oleh Beer (1959). Dimana jika satuan konsentrasi adalah
molaritas (yaitu jumlah mol per liter), maka tetapannya adalah
keterserapan molar ().
Keterangan :
A : absorbansi
a : absorptivitas (tergantung satuan); a (ppm) dan ε (Molar)
c : konsentrasi larutan
b : tebal media/kuvet
: absorptivitas molar/epsilon (L mol-1 cm -1)
26
2.1.8. Spektrofotometri Infra MerahSpektrofotometri infra merah merupakan suatu metode yang
mengamati interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik yang berada
pada daerah panjang gelombang 0,75 – 1.000 µm atau pada bilangan
gelombang 13.000 – 10 cm-1 (Giwangkara, 2007). Spektrofotometer infra
merah atau Fourier Transform Infra Red merupakan alat untuk
mendeteksi gugus fungsional, mengidentifikasi senyawaan dan
menganalisis campuran. Banyak pita absorpsi yang terdapat dalam
daerah yang di sebut daerah “sidik jari” spektrum. Spektrum FTIR suatu
sampel dapat di ketahui letak pita serapan yang dikaitkan dengan adanya
suatu gugus fungsional tertentu (Day dan Underwood, 1999).
Jenis instrumen untuk absorbsi inframerah ada dua macam yaitu
instrumen dispersi dan instrumentasi yang menggunakan Fourier
Transform (FTIR). Pada prinsipnya bentuk spektra yang diperoleh dari dua
metode tersebut adalah sama, namun kualitas dan cara memperoleh
spektra sangat berbeda. Perbedaan dari keduanya adalah bila pada
sistem dispersi menggunakan prisma (grating) sebagai pengisolasi
radiasi, maka pada sistem Fourier Trasform Infra Red (FTIR)
menggunakan interferometer yang dikontrol secara otomatis dengan
komputer. Pada sistem FTIR dipakai LADER yang berguna sebagai
radiasi yang diinterferensikan dengan radiasi IR agar sinyal yang diterima
oleh detektor utuh lebih baik (Hayati, 2007).
Spektrokopi FTIR digunakan sebagai alat secara kualitatif untuk
menentukan gugus fungsi. Gugus fungsi dapat diintepretasi dengan
memeriksa puncak absorbsi dari spektrum FTIR. Widmer, et al. (1981)
menjelaskan struktur Astasantin pada umumnya memberikan serapan
sedang-kuat antara 3750-3000 cm-1 (uluran -OH), serapan yang cukup
kuat antara 2955-2935 cm-1 (uluran C-H asimetris dari alifatik jenuh dan
rantai samping aromatik), dan serapan lemah-sedang antara 1900-1650
(Uluran C=O). Adapun spektra infra merah yang dihasilkan seperti yang
terdapat pada gambar 6 berikut :
27
Gambar 6. Spektra infra merah ekstrak Astasantin, (Widmer, 1981).
2.1.9. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)KCKT adalah istilah yang umum dipakai ilmuwan di Indonesia yang
merupakan singkatan dari Kromatografi Cair Kinerja Tinggi sebagai
pengganti istilah HPLC (High Performance Liquid Chromatography).
Manfaat dan tujuan penggunaan KCKT yaitu untuk mendapatkan
pemisahan suatu komponen senyawa yang baik dengan waktu proses
yang relatif singkat. Hasil yang didapat dari proses pemisahan suatu
komponen senyawa menggunakan KCKT disebut dengan kromatogram
KCKT.
Jika ditinjau dari sistem peralatannya maka KCKT termasuk
kromatografi kolom karena fasa diam yang digunakan ter “packing”
didalam kolom. Kolom kromatografi cair kinerja tinggi dibedakan menjadi
dua jenis, jika ditinjau dari fase diam dan fase geraknya (Mulja, 1995).
Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya “normal”
bersifat polar dan fasa geraknya bersifat non polar disebut kolom fase
normal. Sedangkan kromatografi dengan kolom yang fase geraknya
28
bersifat polar dan fase diamnya bersifat non polar disebut kolom fase
terbalik. Fase diam pada kolom fase terbalik yang umum digunakan
antara lain adalah C18, C8, dan C2.
KCKT selain digunakan untuk pemisahan suatu komponen juga
dapat digunakan untuk mengetahui besar konsentrasi komponen yang
terkandung didalamnya. Penggunaan metode kurva kalibrasi absolut dan
standar internal dapat digunakan dalam penentuan konsentrasi suatu
komponen, yaitu setelah pemisahan preparatif dilakukan
pengidentifikasian berdasarkan waktu retensi, pengamatan pada spektrum
UV atau instrumen analitis lainnya.
Penentuan konsentrasi suatu komponen dilakukan dengan
membandingkan luas atau tinggi puncak standar dengan sampel. Kurva
kalibrasi dibuat terlebih dahulu dengan menggunakan standar. Pembuatan
kurva kalibrasi standar internal harus memperhatikan beberapa syarat
antara lain ialah standar harus memiliki sifat kimia yang mirip dengan zat
sampel dan puncak standar harus tampil relatif dekat dari zat sampel.
Adapun deskripsi kurva kalibrasi standar internal dapat dilihat pada
gambar 7.
29
Gambar 7. Deskripsi kurva kalibrasi standar internal (Munson, 1981)
Menurut Meija et al. (1988), metode KCKT merupakan metode
identifikasi dan purifikasi karotenoid yang sedang berkembang pesat. Hal
ini disebabkan KCKT mempunyai kepekaan yang tinggi dan dapat
langsung digunakan dalam proses pemisahan serta penentuan
konsentrasi. Kelebihan lain dari metode identifikasi KCKT dibandingkan
metode identifikasi lainnya adalah kemampuannya untuk mendeteksi
isomer cis-trans pada karotenoid. Analisis dengan menggunakan KCKT
dilakukan dengan mengukur luas area peak yang tertentu dengan
mengacu karotenoid yang terbentuk pada retention time pada standar
yang digunakan (Hendry dan Houghton, 1996).
2.2. Kerangka BerpikirPada kulit udang banyak terdapat karotenoid. Karotenoid memiliki
pigmen warna Astasantin, dimana Astasantin dapat dihasilkan dengan
mengekstraksi tepung kulit udang menggunakan pelarut aseton tanpa
adanya pemanasan, sehingga metode ekstraksi yang tepat adalah
Kulit Udang
Karotenoid
Astasantin bebas
Antioksidan
Mengandung
Maserasi dengan aseton menghasilkan pigmen
Bermanfaat untuk meredam radikal bebas
30
maserasi. Penggunaan pelarut polar seperti aseton membuat Astasantin
bebas semakin banyak. Astasantin bebas ini dapat berperan sebagai
antioksidan alami dengan meredam radikal bebas.
Gambar 8. Kerangka Berpikir
2.3. Penelitian SebelumnyaPenelitian sebelumnya yang relavan dengan penelitian ini adalah
penelitian yang dilakukan oleh Mezzomo et al. (2011). Penelitian yang
dilakukan oleh Mezzomo adalah penentuan metode ekstraksi terbaik
untuk menghasilkan konsentrasi karotenoid yang besar menggunakan
limbah udang P. brasiliensis dan P. paulensis. Metode ini dapat
meningkatkan nilai guna limbah udang.
Kelebihan lain dari penelitian Mezzomo adalah terdapatnya
beberapa macam perlakuan untuk mengekstrak karotenoid dari kulit
udang sehingga didapat konsentrasi karotenoid yang berbeda-beda.
Variasi perlakuan yang dilakukan oleh Mezzomo antara lain untuk
membandingkan konsentrasi ekstrak kulit udang antara kulit udang natural
(tanpa diberi perlakuan awal) dengan kulit udang yang diolah terlebih
dahulu menjadi tepung kulit udang. Pada proses ektraksi, Mezzomo
menggunakan variasi metode dan pelarut berbeda. Metode ekstraksi yang
digunakan antara lain maserasi, sokletasi, Ultrasound extraction (UE), dan
Hot and cold oil extraction (OilH and OilC). Variasi pelarut yang digunakan
31
antara lain heksana, pencampuran heksana dengan isopropanol,
isopropanol, etanol, dan aseton.
Berdasarkan hasil penelitian Mezzomo kulit udang yang diolah
terlebih dahulu menjadi tepung kulit udang mengandung ekstrak
karotenoid lebih banyak, dari pada kulit udang yang tanpa perlakuan awal.
Pelarut terbaik untuk mengekstrak karotenoid berdasarkan penelitain
Mezzomo antara lain adalah aseton dan pencampuran antara heksana
dengan isopropanol. Metode terbaik untuk ekstraksi karotenoid adalah
maserasi. Metode maserasi menggunakan pencampuran pelarut heksana
dengan isopropanol akan menghasilkan ekstraksi karotenoid yang lebih
banyak dari pada metode maserasi menggunakan aseton, namun pigmen
karotenoid yang berupa Astasantin bebas yang dihasilkan lebih sedikit.
Pada penelitian Mezzomo tidak menjelaskan waktu maserasi dan
rasio penggunaan pelarut dengan massa tepung kulit udang, untuk
menghasilkan konsentrasi Astasantin yang besar. Selain itu Mezzomo
tidak memaparkan aktivitas antioksidan dari pigmen karotenoid yang
berupa Astasantin bebas.
BAB IIIMETODOLOGI PENELITIAN
3.1. Tujuan Operasional PenelitianTujuan Operasional Penelitian ini antara lain sebagai berikut :
1. Mengetahui waktu maserasi yang tepat untuk mendapatkan ekstrak
Astasantin yang besar dari tepung kulit udang.
2. Mengetahui rasio tepung kulit udang dengan pelarut aseton yang
tepat untuk mendapatkan ekstrak Astasantin yang banyak.
3. Mampu menginterpretasikan senyawa hasil ekstrak yang didapat
dengan spektrofotometer infra merah.
4. Mengetahui konsentrasi ekstrak ekstrak Astasantin yang didapat
dengan menggunakan KCKT.
5. Menguji aktivitas antioksidan ekstrak Astasantin tepung kulit udang
dengan menggunakan metode DPPH.
3.2.Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Analitik FMIPA UNJ
Jakarta Timur. Waktu penelitian dari Januari sampai April 2013.
3.3. Alat dan BahanAlat yang diperlukan
Alat-alat gelas yang umum digunakan, corong pisah, spatula,
homogeniser, blender, pipet volumetrik, bulp, mikro pipet, aluminum foil,
neraca analitik, rotary evaporator, spektrofotometer UV-Vis,
spektrofotometri infra merah, dan KCKT.
Bahan yang diperlukan Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini yaitu limbah kulit
udang yang diperoleh dari limbah kulit udang di pasar tradisional, larutan
aseton pro analisis dan Astasantin murni yang digunakan sebagai larutan
33
standar. Bahan lainnya yang digunakan pada penelitian ini yaitu kitosan,
HCl 6 M, larutan n-heksana, metanol, asetonitril, dan senyawa 1,1-
dipheny1-2-picrylhydrazyl (DPPH).
3.4. Prosedur3.4.1. Pembuatan tepung kulit udang
Kulit udang dicuci, kemudian dikukus selama 10 menit pada suhu
100°C. Hal ini karena karotenoid pada kulit udang berada dalam bentuk
kompleks karotenoprotein, yang apabila diberi perlakuan panas dapat
menyebabkan renggangnya ikatan yang mengikat karotenoid dengan
protein sehingga warna udang dapat mengalami perubahan dari gelap
menjadi merah terang (Hendry dan Houghton, 1996). Dengan demikian
protein akan terdenaturasi berupa koagulasi dengan pengendapan di air.
Perlakuan selanjutnya adalah mengeringkan kulit udang pada suhu yang
tidak melebihi 60°C. Pengeringan dilakukan hingga didapatkan massa
yang stabil. Lalu kulit udang yang telah kering digiling sampai menjadi
tepung.
3.4.2. Pengaruh waktu ekstraksi terhadap jumlah ekstrak Astasantin yang didapatkan
Ekstraksi Astasantin dilakukan dengan metode maserasi, 5 gram
tepung kulit udang dilarutkan dengan 50 mL aseton. Perendaman
dilakukan selama beberapa hari pada suhu ruang dan setiap hari diaduk.
Esktrak dipisahkan dengan menggunakan kertas saring. Untuk
menghasilkan ekstrak yang banyak dengan absorbansi ekstrak yang
besar dilakukan maserasi pada waktu yang berbeda beda yaitu 3, 5, dan
7 hari seperti yang ditunjukkan pada tabel 5.
34
Tabel 5. Pengaruh Waktu Maserasi terhadap Jumlah Ekstrak Astasantin
Waktu maserasi (hari) *Absorbansi 3
5
7
*Nilai absorbansi didapatkan setelah ekstrak dimurnikan
3.4.3. Pengaruh rasio tepung kulit udang dengan pelarut aseton terhadap jumlah ekstrak Astasantin yang didapatkan
Proses optimasi dilanjutkan dengan mengganti perlakuan waktu
maserasi dengan rasio tepung kulit udang dan pelarut aseton. Setelah
didapatkan waktu yang optimum pada penelitian sebelumnya, meserasi
diulangi dengan mengganti volume pelarut menjadi 40 mL dan 45 mL
aseton. Proses maserasi dilakukan selama waktu optimum. Data yang
didapatkan berupa nilai absorbansi dan disajikan seperti pada tabel 6.
Proses pengukuran absorbansi dilakukan setelah ekstrak dimurnikan.Tabel 6. Pengaruh Rasio Tepung Kulit Udang : Volume Aseton terhadap Jumlah
Ekstrak Astasantin
No Rasio tepung kulit udang : pelarut *Absorbansi 1 1 : 8 (5 mL : 40 g)
2 1 : 9 (5 mL : 45 g)
*Nilai absorbansi didapatkan setelah ekstrak dimurnikan
3.4.4. Pemurnian Astasantin dan Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Sebelum dilakukan pengukuran absorbansi, ekstrak dari masing-
masing perlakuan maserasi dimurnikan terlebih dahulu, cara pemurnian ini
diadopsi dari penelitian Sachindra et al. (2006). Proses pemurnian
dilakukan dengan metode ekstraksi sederhana dengan menggunakan
corong pisah.
35
Mula-mula ekstrak dimurnikan dengan petroleum eter. Penggunaan
petroleum eter berfungsi untuk menarik pelarut (aseton) dari ekstrak yang
dihasilkan. Untuk menghilangkan sisa aseton, ekstrak Astasantin kembali
diekstraksi dengan larutan garam NaCl 1% digunakan dan ekstrak yang
telah dipisahkan dari larutan garam ditambahkan dengan padatan natrium
sulfat anhidrat. Lalu filtrat disaring dan dialirkan gas nitrogen selama 5
menit, selanjutnya untuk mendapatkan ekstrak murni asatasantin
kemudian ekstrak dipekatkan dengan menggunakan alat rotary evaporator
dengan suhu 40oC (Sachindra, 2006).
Ekstrak yang telah bebas dari pelarut kemudian diukur
absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri cahaya tampak.
Pengukuran absorbansi dilakukan dengan menggunakan panjang
gelombang maksimum. Kisaran panjang gelombang yang digunakan
untuk mengukur absorbansi Astasantin adalah 460-490 nm (Rodriguez,
2001).
3.4.5. Karakterisasi Ekstrak Astasantin dengan Spektrofotometer Infra Merah
Karakterisasi senyawa yang terkandung dalam ekstrak yang
dihasilkan dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer infra
merah.Pada penelitian spektrofotometer infra merah yang digunakan ialah
Shimadzu IR untuk sampel berupa cairan, dengan tipe wadah sampel
ATR-8200 H/8200 HA.
36
Gambar 9. Alat Spektrofotometer Infra Merah
Data yang diperoleh dari hasil spektrum infra merah berupa informasi
gugus-gugus fungsional yang menyusun suatu struktur senyawa. Gugus
tersebut diidentifikasi sesuai dengan yang ditunjukkan pada tabel 7.
Tabel 7. Interpretasi Spektra FTIR
No
Bilangan
Gelombang
(cm-1)
Range (cm-1)Intensitas
ReferensiVibrasi Referensi
1 3750-3000 Sedang-kuatUluran O-H dari ikatan hidrogen
intermolekuler
2 2955-2935 Sedang-kuat
Uluran C-H asimetris dari alifatik
jenuh dan rantai samping
aromatik
3 1900-1650 Lemah Uluran C=O
4 1665-1630 Lemah-sedang Uluran C=C dari alkena
3.4.6. Pengujian konsentrasi ekstrak Astasantin dengan KCKT
Penggunaan instrumen kromatografi cair kinerja tinggi juga dapat
digunakan untuk menghitung konsentrasi Astasantin yang terdapat dalam
ekstrak limbah kulit udang (Mezzomo et al., 2011). Adapun tahap
pengujian Astasantin menggunakan KCKT diadopsi dari penelitian
Mezzomo et al. (2001).
Proses pengujian kadar Astasantin menggunakan KCKT adalah
sebagai berikut, mula-mula sampel ekstrak Astasantin yang sudah
dimurnikan diencerkan dengan 2 mL pelarut n-heksana, lalu dilakukan
penghomogenisasian menggunakan homogeniser selama 5 menit.
Tahapan selanjutnya sebanyak 5 L ekstrak Astasantin diinjeksikan
kedalam injektor KCKT.
37
Pengoperasian KCKT dilakukan dengan suhu kolom 40°C. Kolom
yang digunakan pada proses pemisahan yaitu kolom fasa balik C18. Fasa
gerak yang digunakan pada pengujian yaitu campuran antara asetonitril
dengan metanol (90:10, v/v). Laju alir pada pengujian diatur menjadi 0,8
mL/menit. Pengujian dilakukan dengan pengulangan sebanyak 3 kali
(triplicate)
3.4.7. Uji aktivitas antioksidan dengan DPPH
Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH (1,1-difenil
pikrilhidrazil). Parameter hasil pengujian dengan metode DPPH adalah
dengan IC (Inhibition Concentration), yaitu konsentrasi larutan sampel
yang dibutuhkan untuk menghambat 50% radikal bebas.
Radikal DPPH merupakan senyawa organik yang memiliki
kandungan nitrogen yang tidak stabil dengan nilai absorbansi yang kuat
pada panjang gelombang 517 nm dan memiliki warna ungu gelap. Warna
ungu pada DPPH akan tereduksi menjadi warna kuning apabila bereaksi
dengan senyawa antioksidan. Besarnya tingkat perubahan warna yang
terjadi diukur dengan menggunakan spektrofotometer (Molyneux, 2004).
Pada pengujian aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
dilakukan proses pembuatan larutan DPPH 0,4 mM adalah dengan cara
melarutkan DPPH sebanyak 7,4 mg (BM 394,32 g/mol) dan
melarutkannya dalam methanol pro analisis. Larutan kemudian
dipindahkan ke labu ukur 50 mL dan diencerkan sampai tanda batas.
Sampel dibuat menjadi larutan dengan berbagai variasi konsentrasi yaitu
5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL dan 100 μg/mL. Kontrol positif
yang digunakan pada penelitian adalah larutan vitamin C. Perlakuan yang
sama seperti sampel, kontrol pun dibuat menjadi larutan dengan berbagai
variasi konsentrasi yaitu 3 μg/mL, 6 μg/mL, 9 μg/mL, 12 μg/mL dan 15
μg/mL. Masing-masing larutan sampel dan standar dengan berbagai
konsentrasi tersebut kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi dan
38
dicampurkan dengan 1 mL larutan DPPH. Setelah dicampurkan, larutan
tersebut diinkubasi dalam penangas air 37oC selama 30 menit. Serapan
larutan diukur pada panjang gelombang serapan maksimum 515 nm
menggunakan spektrofotometer cahaya tampak.
Persentase inhibisi dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Hambatan (inhibisi) = Serapan blanko – Serapan sampel X 100%
Serapan blanko
Nilai IC50 (Inhibition Concentration 50) adalah konsentrasi
antioksidan (g/mL) yang mampu menghambat 50 % radikal bebas. Nilai
IC50 diperoleh dari perpotongan garis antara 50% daya hambat dengan
sumbu konsentrasi, kemudian dimasukkan ke dalam persamaan :
Y = a+bX
Berdasarkan literatur Y bernilai 50, sehingga nilai X yang
menunjukkan besarnya IC50 dapat diketahui. Ekstrak yang dinyatakan
aktif dalam menangkal radikal bebas yaitu bila nilai IC50 kurang dari 100
g/mL.
Nilai IC50 didefinisikan sebagai konsentrasi dari senyawa antioksidan
yang dapat menyebabkan hilangnya 50% aktivitas DPPH dan pada
umumnya dinyatakan dalam satuan ppm. Semakin kecil nilai IC50 maka
aktivitas antioksidan dari sampel tersebut semakin baik. Data yang
diperoleh dinyatakan dalam tabel 8. Tabel 8. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan pada Ekstrak Astasantin dengan DPPH
NamaSampel
C(ppm) A1 A2 Ā A
BlankoInhibisi
(%)IC50
(ppm)Sampel
Vitamin C
Keterangan : C (ppm) =konsentrasi (ppm)
A1= absorbansi simplo
A2= absorbansi duplo
Ā = absorbansi rata-rata
IC50 = Inhibisi konsentrasi 50
BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui waktu dan rasio pelarut
aseton yang tepat untuk mendapatkan konsentrasi ekstrak Astasantin
yang besar dari tepung kulit udang. Mengetahui konsentrasi ekstrak
Astasantin dari tepung kulit udang yang diukur dengan menggunakan
KCKT dan menguji aktivitas antioksidan ekstrak Astasantin tepung kulit
udang dengan menggunakan metode DPPH. Hasil penelitian diuraikan
menjadi beberapa bagian sebagai berikut :
4.1. Preparasi Sampel,
4.2. Pemurnian Sampel,
4.3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum,
4.4. Hasil Pengaruh Waktu Maserasi,
4.5. Hasil Pengaruh Rasio Tepung Kulit Udang dengan Pelarut Aseton,
4.6. Karakterisasi Ekstrak dengan FTIR,
4.7. Penentuan Konsentrasi Ekstrak dengan KCKT, dan
4.8. Uji Antioksidan dengan Metode DPPH.
4.1. Preparasi SampelLimbah kulit udang yang telah dibersihkan, dikukus, dan
dikeringkan kemudian digiling. Hasil proses preparasi sampel
ditunjukkan pada gambar 10.
(a) (b) (c) (d)Gambar 10. Pembuatan tepung kulit udang. (a) Limbah kulit udang yang telah bersih,
(b) Kulit udang setelah dikukus, (c) Kulit udang setelah dikeringkan, dan (d) Kulit udang digiling hingga menjadi tepung.
40
Warna kulit udang setelah proses pengukusan menjadi merah
terang, hal ini dikarenakan renggangnya ikatan yang mengikat
karotenoid dengan protein. Protein yang telah terlepas dari
karotenoid tersebut akan terdenaturasi dengan koagulasi dan
mengendap pada air.
4.2. Pemurnian SampelTepung kulit udang dimaserasi menggunakan pelarut aseton
dengan masing-masing perlakuan. Hasil ekstraksi tepung kulit udang
dengan pelarut aseton dapat dilihat pada gambar 11.
(a) (b) (c)
Gambar 11. Ekstrak Astasantin hasil maserasi dengan 50 mL aseton terhadap waktu maserasi. (a) Waktu maserasi 3 hari, (b) Waktu maserasi 5 hari, dan (c) Waktu maserasi 7 hari.
(a) (b)
Gambar 12. Ekstrak Astasantin terhadap volume pelarut aseton waktu maserasi 5 hari. (a) Volume aseton 40 mL, (b) Volume aseton 45 mL.
41
Berdasarkan gambar 11 terlihat bahwa warna ekstrak hasil
maserasi bebeda pada masing-masing waktu maserasi. Pada waktu
maserasi 5 hari terlihat warnanya paling cerah daripada warna
ekstrak lainnya. Sedangkan pada gambar 12 terlihat warna ekstrak
dengan volume aseton 40 mL lebih pekat, daripada warna ekstrak
dengan volume aseton 45 mL.
Ekstrak yang dihasilkan kemudian dimurnikan. Hasil yang
didapatkan setelah pemurnian ekstrak dapat dilihat pada gambar 13.
(a) (b) (c) (d) (e)Gambar 13. Pemurnian ekstrak Astasantin. (a) Waktu maserasi 3 hari, (b)
Waktu maserasi 5 hari, (c) Waktu maserasi 7 hari, (d) Volume aseton 40 mL, dan (e) Volume aseton 45 mL.
Gambar 13 menunjukkan perbedaan warna masing-masing
ekstrak setelah dimurnikan. Pada ekstraksi dengan pengaruh waktu,
terlihat bahwa warna ekstrak hasil maserasi selama 5 hari lebih
pekat daripada ekstrak lainnya. Untuk warna yang dimunculkan pada
ekstraksi pengaruh rasio terlihat sama antara ekstrak dengan volume
aseton 40 mL maupun 45 mL.
Warna ekstrak setelah proses maserasi terlihat lebih pekat
daripada sebelum ekstraksi. Hal tersebut dapat dikarenakan ekstrak
sudah bebas dari pelarut. Berkurangnya volume ekstrak setelah
dimurnikan juga menguatkan dugaan bahwa pelarut pada ekstrak
telah menguap.
42
4.3. Penentuan Panjang Gelombang MaksimumUntuk mengetahui hasil ekstrak terbanyak dari masing-masing
perlakuan, dilakukan pengukuran absorbansi dari tiap ekstrak, pada
panjang gelombang maksimum. Pengukuran absorbansi ekstrak
menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Rentang panjang
gelombang yang digunakan pada pengukuran adalah 700nm –
300nm.
Berdasarkan pengukuran absorbansi ekstrak didapatkan
panjang gelombang maksimum pada 468 nm. Panjang gelombang
tersebut sesuai dengan panjang gelombang maksimum untuk
pengukuran Astasantin dengan pelarut petroleum eter (Rodriguez-
Amaya, 2001). Hal ini dikarenakan pada proses pemurnian ekstrak,
pelarut aseton telah habis terekstrak oleh petroleum eter.
Tabel 9. Panjang Gelombang Maksimum Pelarut untuk Ekstraksi Astasantin (Rodriguez, 2001).
PelarutPanjang Gelombang
Maksimum (nm)Aseton 480
Benzena, Kloroform 485
Etanol 478
Petroleum Eter 468
4.4. Hasil Pengaruh Waktu MaserasiParameter yang diuji pada penelitian ini adalah nilai absorbansi
dari ekstrak Astasantin tepung kulit udang. Pengukuran absorbansi
dilakukan pada panjang gelombang makasimum, yaitu pada panjang
gelombang 468 nm. Data hasil pengaruh waktu terhadap nilai
absorbansi disajikan pada Tabel 10 dan Gambar 14.
43
Tabel 10. Hasil Absorbansi Ekstrak Astasantin dari Perlakuan Waktu Maserasi
Waktu Maserasi Absorbansi
3 hari 0,819
5 hari 0,919
7 hari 0,438
Gambar 14. Grafik Waktu Maserasi terhadap Nilai Absorbansi Ekstrak Astasantin. Sumbu X merupakan waktu maserasi tepung kulit
udang. Sumbu Y merupakan nilai absorbansi dalam satuan nm.
Hasil dari grafik waktu maserasi terhadap nilai absorbansi
ekstrak Astasantin dapat diketahui, bahwa terjadi penaikan nilai
absorbansi pada hari ke-5. Hal ini dikarenakan selama
berlangsungnya maserasi terjadi pemecahan membran sel bahan
akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel, sehingga
senyawa yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut
organik. Semakin lama waktu maserasi terhadap bahan, maka
semakin banyak pula membran sel yang pecah sehingga semakin
3 Hari 5 Hari 7 Hari0
0.10.20.30.40.50.60.70.80.9
1
0.8190.919
0.438000000000003
Grafik Waktu Maserasi terhadap Nilai Absorbansi Ekstrak Astasantin
Grafik Waktu Maserasi terhadap Nilai Absorbansi Ekstrak Astasantin
Waktu Maserasi
Abso
rban
si
44
banyak Astasantin dalam bentuk yang tersedia maupun bebas yang
terbentuk.
Pada proses maserasi selama 7 hari terjadi penurunan nilai
absorbansi. Hal ini disebabkan karena pelarut aseton yang
higroskopis sehingga mempengaruhi kejenuhan pelarut terhadap
sampel. Aseton merupakan pelarut yang mudah menguap dimana
titik didihnya mencapai 56,2 oC (Science Lab.com). Hal ini
menunjukkan bahwa waktu optimal untuk melakukan maserasi
Astasantin dari tepung kulit udang pada suhu ruang adalah selama 5
hari, hasil serupa ditunjukkan pula pada penelitian Mezzomo (2011).
4.5. Hasil Pengaruh Rasio Tepung Kulit Udang dengan Pelarut Aseton
Setelah didapatkan waktu optimum maserasi, kemudian proses
optimasi dilanjutkan untuk mengetahui rasio tepung kulit udang
dengan pelarut. Pada penelitian ini proses maserasi dilakukan
selama waktu optimum yaitu selama 5 hari dan maserasi dilakukan
pada suhu ruang. Selanjutnya untuk pengukuran absorbansi
dilakukan pada panjang gelombang maksimum yaitu 468 nm. Hasil
yang didapatkan pada proses optimasi kedua ini disajikan pada
Tabel 11 dan Gambar 15.
Tabel 11. Hasil Absorbansi Ekstrak Astasantin dari Perlakuan Rasio PelarutRasio
Tepung Kulit Udang : Pelarut
Volume Pelarut
(mL)Absorbansi
1:8 40 2,882
1:9 45 2,582
45
Gambar 15. Grafik Rasio Pelarut Aseton terhadap Nilai Absorbansi Ekstrak Astasantin. Sumbu X merupakan volume pelarut aseton. Sumbu Y merupakan nilai absorbansi dalam satuan nm.
Nilai absorbansi maksimum dari grafik rasio pelarut ditunjukkan
pada rasio 1:8 dimana, 5 gram tepung kulit udang dimaserasi
dengan 40 mL pelarut aseton. Hal ini sesuai dengan hukum Lambert-
Beer terhadap persamaan molaritas, dimana nilai absobansi akan
berbanding terbalik dengan volume suatu larutan.
Berdasarkan hukum Lambert-Beer dapat diketahui bahwa nilai
absorbansi akan berbanding lurus dengan konsentrasi dan nilai
konsentrasi pada persamaan molaritas akan berbanding terbalik
dengan volume pelarut yang digunakan. Jika ditarik kesimpulan
maka nilai absorbansi pun akan berbanding terbalik dengan volume
pelarut, sehingga jika volume pelarut semakin kecil nilai absorbansi
akan semakin besar.
Hasil yang didapatkan dari pengaruh waktu maserasi dan rasio
volume aseton terhadap nilai absorbansi ekstrak Astasantin ialah,
40 mL aseton 45 mL aseton2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
3
2.882
2.582
Grafik Rasio Pelarut Aseton terhadap Nilai Absorbansi Ekstrak Astasantin
Grafik Rasio Pelarut Aseton terhadap Nilai Absorbansi Ek-strak Astasantin
Volume Pelarut Aseton
Abso
rban
si
46
nilai panjang gelombang pengukuran absorbansi ekstrak sesuai
dengan panjang gelombang ekstraksi Astasantin dengan pelarut
petroleum eter. Pada penelitian optimasi waktu maserasi, didapatkan
waktu maserasi yang menghasilkan nilai absorbansi tertinggi ialah
selama 5 hari. Selanjutnya pada penelitian optimasi rasio pelarut
untuk ekstraksi Astasantin, didapatkan bahawa rasio 1:8 (5 gram
Astasantin dilarutkan pada 40 mL aseton) merupakan rasio yang
dapat menghasilkan nilai absorbansi tertinggi.
4.6. Karakterisasi Ekstrak dengan FTIRKarakterisasi ekstrak Astasantin dilakukan dengan
menggunakan spektrofotometer infra merah, sehingga dapat
diketahui gugus fungsi yang terdapat pada ekstrak. Hasil yang
didapat dari pengukuran panjang gelombang maksimum pada
spektrofotometri UV-Vis didukung dengan spektra FTIR yang
ditunjukkan pada Lampiran 10. Interpretasi gugus fungsi yang
tedapat pada ekstrak disajikan pada Tabel 12.Tabel 12. Interpretasi Spektra FTIR
No
Bilangan
Gelombang
(cm-1)
Range (cm-1)Intensitas
ReferensiVibrasi Referensi
1 3369,64 3750-3000 Sedang-kuatUluran O-H dari ikatan
hidrogen intermolekuler
2 2924,09 2955-2935 Sedang-kuat
Uluran C-H asimetris
dari alifatik jenuh dan
rantai samping aromatik
3 1712,79 1900-1650 Lemah Uluran C=O
4 1620,21 1665-1630 Lemah-sedang Uluran C=C dari alkena
5 1463,97 1475-1300 Sedang Lentur C-H
6 1377,17 Lentur C-H
47
7 1220,94 1300-1200 Lemah Tekuk C-H
8 1170,79 1115-1090 Sedang-kuatGoyangan C=C dari
alkena
9 1049,28 1060-1020 Kuat Uluran C-O dari alkohol
10 960,55
1000-650 LemahTekukan CH kibasan
dari –CH=CH2
11 916,19
12 840,96
Hasil analisis pola serapan FTIR yang didapatkan dari
penelitian ini menunjukkan adanya uluran O-H dari ikatan hidrogen
intermolekuler pada daerah panjang gelombang 3369,64 cm -1.
Vibrasi ulur C-H asimetris dari aromatik CH3 memberikan serapan
pada bilangan gelombang 2924,09 cm-1. Vibrasi ulur C=O
ditunjukkan dengan adanya serapan pada 1712,79 cm-1 dan vibrasi
ulur C=C dari alkena ditunjukkan oleh serapan pada daerah 1620,21
cm-1.
Adanya serapan sedang pada bilangan gelombang 1463,97
dan 1377,17 cm-1 akibat dari vibrasi lentur C-H dan serapan lemah
pada bilangan gelombang 1220,94 cm-1 merupakan akibat dari
vibrasi tekuk C-H. Sedangkan serapan sedang-kuat pada bilangan
gelombang 1170,79 cm-1 merupakan akibat dari vibrasi uluran C=C
dari alkena. Serapan kuat pada bilangan gelombang 1049,28 cm-1
merupakan akibat dari vibrasi uluran C-O dari alkohol dan serapan
lemah ditunjukkan pada bilangan gelombang 960,55; 916,19; dan
840,96 merupakan vibrasi tekukan CH kibasan dari –CH=CH2 .
Berdasarkan hasil pengamatan spektra FTIR dapat diketahui
bahwa gugus fungsi yang terdapat pada ekstrak adalah gugus O-H
dari ikatan hidrogen intermolekuler, C-H dari alifatik CH3, CH simetris
dari CH2, C=C dari alkena, CH2, C-O dari alkohol. Hasil yang
48
didapatkan ini sesuai dengan komponen penyusun Astasantin dan
dengan spektrum infra merah Astasantin yang dipaparkan oleh
Widmer et al. (1981).
4.7. Penentuan Konsentrasi Ekstrak dengan KCKTTahap penelitian selanjutnya ialah pengujian konsentrasi
ekstrak Astasantin yang telah didapat dengan menggunakan
instrumen kromatografi cair kinerja tinggi. Pengujian konsentrasi
ekstrak Astasantin dengan instrumen KCKT dilakukan di
Laboratorium Pengujian Balai Besar Penelitian dan Pengembangan
Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan -
Badan Penelitian Pengembangan Kelautan dan Perikanan,
Kementerian Kelautan dan Perikanan.
Hasil yang didapatkan di lampirkan pada Lampiran 12 dan
Lampiran 13. Berdasarkan grafik didapatkan puncak standar dan
puncak sampel yang muncul pada panjang gelombang 460 nm.
Panjang gelombang yang dihasilkan sesuai dengan kisaran panjang
gelombang ekstrak Astasantin dengan pelarut petroleum eter.
Berdasarkan hasil yang didapat, puncak standar muncul pada
menit ke 13,624, dengan luas area sebesar 29,080. Sedangkan
puncak sampel muncul pada menit ke 13,280 dengan luas area
sebesar 29,080.
Berdasarkan perhitungan konsentrasi ekstrak Astasantin yang
terlampir pada Lampiran 14, diketahui bahwa besar konsentrasi
sampel (ekstrak Astasantin) yaitu sebesar 7,466 ± 0,05 ppm. Hal ini
disebabkan nilai luas area puncak standar standar lebih besar
daripada luas area puncak sampel.
4.8. Uji Antioksidan dengan Metode DPPHTerhadap ekstrak Astasantin yang telah didapat, selanjutnya
dilakukan uji antioksidan menggunakan metode penangkapan radikal
49
DPPH. Pengujian aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
dilakukan di Laboratorium Kimia Bahan Alam, Pusat Penelitian
Bioteknologi-LIPI. Nilai Inhibisi terhadap konsentrasi pada uji
antioksidan dapat dilihat pada Tabel 13.
Tabel 13. Nilai Inhibisi terhadap Konsentrasi pada Uji AntioksidanNama
SampelC
(ppm) Ā Inhibisi(%)
Sampel
5 0,798 0,125
10 0,786 1,690
25 0,779 2,503
50 0,770 3,630
100 0,677 15,332
Vitamin C
3 0,480 39,987
6 0,264 66,959
9 0,042 94,806
14 0,035 95,620
15 0,029 96,370
Keterangan : C (ppm) = konsentrasi (ppm)
Ā = absorbansi rata-rata
Berdasarkan data yang diperoleh pada Tabel 13 terlihat jika
konsentrasi meningkat maka nilai absorbansi akan semakin rendah.
Absorbansi yang rendah dari campuran reaksi mengindikasikan
penangkapan aktivitas radikal yang tinggi (Gulcin, 2003). Penurunan
nilai absorbansi terjadi karena adanya donasi atom hidrogen dari
sampel ke DPPH (reduksi DPPH). Donasi proton ini membuat DPPH
yang bersifat radikal tereduksi menjadi 1,1difenil-2-pikrilhidrazin yang
bersifat non radikal. Sedangkan sampel yang bereaksi dengan
radikal DPPH diubah menjadi suatu senyawa baru yang bersifat
stabil.
Terlihat pula pada Tabel 13 hubungan antara konsentrasi
dengan nilai inhibisi ialah berbanding lurus. Semakin besar
konsentrasi sampel yang ditambahkan maka semakin besar nilai
50
inhibisinya pula. Pada Tabel 13, terlihat bahwa larutan kontrol positif
asam askorbat memiliki nilai inhibisi (aktivitas antioksidan) yang
tinggi, sedangkan pada sampel yang diujikan, ekstrak Astasantin
memiliki aktivitas antioksidan yang kurang baik. Aktivitas antioksidan
merupakan kemampuan suatu senyawa atau ekstrak, untuk
menghambat reaksi oksidasi yang dapat dinyatakan dengan persen
penghambatan.
Parameter yang dipakai untuk menunjukkan aktivitas
antioksidan adalah dengan menentukan harga IC50. Harga IC50 telah
ditentukan dari penelitian ini. IC50 (Inhibition Concentration)
merupakan konsentrasi suatu zat antioksidan yang dapat
menyebabkan 50% DPPH kehilangan karakter radikalnya. Zat yang
mempunyai aktivitas antioksidan tinggi, akan mempunyai harga IC50
yang rendah (Brand-Williams et al., 1995). Nilai IC50 dapat digunakan
untuk menyimpulkan seberapa besar sampel berpotensi sebagai
antioksidan. Range terkait kuat atau lemahnya potensi antioksidan
berdasarkan nilai IC50 terangkum pada tabel kisaran kekuatan
potensi antioksidan berikut :
Tabel 14. Kisaran Kekuatan Potensi Antioksidan (Brand-Williams et al., 1995)
Kisaran nilai IC50 Kekuatan potensi antioksidan
< 50 Sangat Kuat Berpotensi
50 – 100 Kuat
100 – 150 Sedang
150 – 200 Lemah
>200 Tidak Berpotensi
Penentuan harga IC50 dapat dilakukan dengan mencari
persamaan regresi hubungan persentase inhibisi dengan
51
konsentrasi. Persamaan regresi sampel dan kontrol dapat dilihat
pada Gambar 16 berikut ini :
(a)
(b)
Gambar 16. Grafik Hubungan Inhibisi dengan Konsentrasi pada Metode DPPH. (a) Kontrol Positif (Vitamin C), (b) Ekstrak Astasantin; Sumbu X merupakan konsentrasi ekstrak Astasantin dalam satuan ppm. Sumbu Y merupakan nilai inhibisi dalam satuan %.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000.000
2.000
4.000
6.000
8.000
10.000
12.000
14.000
16.000
18.000
0.1251.690
2.5033.630
15.332
f(x) = 0.15093864013267 x − 1.07966832504146R² = 0.922050503236156
Grafik Hubungan Inhibisi dengan Konsentrasi
Grafik Hubungan Inhibisi dengan Konsentrasi pada Metode DPPH
Linear (Grafik Hubungan Inhibisi dengan Konsen-trasi pada Metode DPPH)
Konsentrasi (ppm)
Inhi
bisi
(%)
IC50 : 338,500 ppm
2 4 6 8 10 12 14 16 18 200.000
20.000
40.000
60.000
80.000
100.000
120.000
39.987
66.959
94.806 95.62096.370
f(x) = 4.35384220532319 x + 37.822283269962R² = 0.79943942626825
Grafik Hubungan Inhibisi dengan Konsentrasi
Grafik Hubungan Inhibisi dengan Konsentrasi
Linear (Grafik Hubungan Inhibisi dengan Konsen-trasi)
Konsentrasi (ppm)
Inhi
bisi
(%)
IC50 : 2,797 ppm
53
Berdasarkan persamaan regresi dari Gambar 16 dapat
diketahui nilai IC50 dari larutan kontrol dan ekstrak Astasantin. Nilai
IC50 ini diketahui dengan cara menetapkan nilai 50 pada Y, sehingga
x (nilai IC50) akan didapatkan. Adapun data untuk mendapatkan nilai
IC50 dan perhitungan nilai IC50 telah disajikan pada Lampiran 15,
Lampiran 16 dan Lampiran 17.
Pada larutan kontrol asam askorbat nilai IC50 yang didapat yaitu
sebesar 2,797 ppm. Hal ini membuktikan bahwa larutan asam
askorbat memiliki potensi yang sangat kuat sebagai antioksidan.
Dilihat dari nilai IC50 yang didapat < 50 yaitu 2,797 dengan kata lain,
asam askorbat dikatakan sangat aktif sebagai antioksidan karena
hanya memerlukan konsentrasi sebesar 2,797 ppm untuk mampu
meredam 50% radikal bebas (Darmanto, 2005). Vitamin C memiliki
aktivitas antioksidan yang cukup tinggi karena vitamin C memiliki 4
gugus hidroksil. Menurut May (1999) vitamin C sebagai antioksidan
dapat memberikan satu atau dua elektronnya untuk menstabilkan
radikal bebas.
Selanjutnya dari grafik hubungan persentase inhibisi dengan
konsentrasi pada ekstrak Astasantin, didapatkan nilai IC50 sebesar
338,500 ppm. Nilai IC50 pada senyawa Astasantin menunjukkan
bahwa Astasantin tidak berpotensi sebagai antioksidan jika ditinjau
dari pengujian aktivitas antioksidan dengan metode DPPH. Hal ini
dapat dikarenakan ikatan ganda terkonjugasi Astasantin yang tidak
mampu mempengaruhi kation radikal dari senyawa DPPH, sehingga
tidak terjadi interaksi penyumbangan proton atau elektron kepada
radikal DPPH atau dengan kata lain tidak terjadi reduksi radikal
DPPH menjadi DPPH-H. Menurut Sowmya dan Sachindra (2012)
Astasantin dapat menangkap radikal bebas dengan baik jika
pengujian antioksidan dilakukan dengan metode ABTS radical-
scavenging assay. Uji aktivitas antioksidan Astasantin juga baik
dilakukan dengan menggunakan metode bleaching terhadap β-
54
karoten, dimana pada metode tersebut β-karoten akan mengalami
destruksi oleh produk degradasi asam linoleat (Saleha, 2009).
Namun nilai IC50 yang didapatkan pada pengujian antioksidan
dengan metode Astasantin ini lebih baik dari penelitian Hartono
(2011), dimana nilai IC50 terbaik yang didapatkannya mencapai 2.963
ppm. Hal tersebut dikarenakan pemilihan pelarut yang tepat juga
sangat penting. Pada penelitian Hartono (2011) digunakan pelarut
untuk maserasi adalah n-heksana, isopropanol, dan campuran
keduanya, sedangkan pada penelitian ini digunakan pelarut aseton.
Pemilihan pelarut aseton dikarenakan hasil ekstrak yang didapat
merupakan Astasantin dalam bentuk bebas. Ketidakstabilan
Astasantin bebas terhadap cahaya, oksigen, kadar asam, dan suhu
tinggi membuat Astasantin bebas ini mudah teroksidasi, degradasi,
dan isomerisasi, sehingga kemampuan Astasantin bebas sebagai
antioksidan dalam menangkap radikal bebas semakin meningkat
(Storebakken, 2004).
BAB VKESIMPULAN dan SARAN
5.1. KesimpulanPada penelitian ini telah dilakukan ekstraksi, pemurnian,
karakterisasi, pengujian konsentrasi dan uji antioksidan ekstrak Astasantin
dari tepung kulit udang. Pada proses ekstraksi ditentukan waktu maserasi
dan rasio perbandingan tepung kulit udang dengan pelarut yang tepat,
perlakuan tersebut supaya didapatkan ekstrak dalam jumlah banyak.
Berdasarkan hasil penelitian, untuk mendapatkan ekstrak Astasantin
terbanyak proses maserasi dilakukan selama 5 hari, dengan rasio
perbandingan tepung kulit udang dan pelarut aseton sebanyak 1:8, yaitu 5
gram tepung kulit udang dimaserasi dengan 40 mL aseton. Parameter
banyak atau sedikitnya ekstrak yang didapatkan berdasarkan pengukuran
absorbansi menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Panjang gelombang
maksimum yang digunakan pada penelitian ini yaitu sebesar 468 nm.
Panjang gelombang tersebut merupakan panjang gelombang untuk
ekstrak Astasantin dengan pelarut petroleum eter. Ekstrak yang
didapatkan kemudian dikarakterisasi dengan spektrofotometer infra
merah. Bilangan gelombang yang didapatkan dari spektra infra merah
diantaranya 3369,64 cm-1, 2924,09 cm-1, 1712,79 cm-1, dan 1620,21 cm-1.
Bilangan gelombang tersebut menunjukkan bahwa gugus fungsi yang
terdapat pada ekstrak merupakan gugus fungsi senyawa Astasantin.
Selanjutnya konsentrasi ekstrak Astasantin diukur menggunakan KCKT
dan didapatkan konsentrasi ekstrak sebesar 7,466 ± 0,05 ppm. Ekstrak
Astasantin kemudian diuji aktivitas antioksidannya menggunakan metode
DPPH dan didapatkan nilai IC50 sebesar 338,500 ppm. Nilai IC50 ini
menunjukkan bahwa Astasantin kurang efektif dalam mengikat radikal
bebas berupa DPPH, karena tidak terjadi reduksi radikal DPPH menjadi
DPPH-H.
5.2. SaranPerlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pengujian aktivitas
antioksidan ekstrak Astasantin dari tepung kulit udang menggunakan
pelarut aseton. Adapun pengujian aktivitas antioksidan yang disarankan
antara lain dengan menggunakan metode ABTS radical scavenging
assay, Singlet oxygen quenching, dan Reducing activity.
56
DAFTAR PUSTAKA
Adnan, M. 1997. Teknik Kromatografi Untuk Analisa Bahan Makanan.
Yogyakarta : Andi.
Anonim. 2013. Soxhlet extractor.
http://en.wikipedia.org/wiki/Soxhlet_extractor. (Diakses pada tanggal
23 November 2013, pukul 13.12 WIB).
Anonim. 2004. UV Visible Absorption Spectroscopy.
http://faculty.sdmiramar.edu/fgarces/LabMatters/Instruments/UV_Vis/
Cary50.htm. (Diakses pada tanggal 14 Desember 2013, pukul 02.19
WIB).
Arab, L., S. Steck-Scott and P. Bowen. 2001. Partisipation of Lycopen and
Betacarotene in Carcinogenesis: Defenders, Aggresors, or Passive
Bystanders. Epidemiologic Reviews, Vol 23. No 2, p.221-229
Arifin, Z., Adiwijaya, D., Komaruddin, U., dan Susanto, A. 2007.
Penerapan Best Management Practises (BMP) pada Budidaya
Udang Windu. Jepara : Departemen Kelautan dan Perikanan
Direktorat Jendral Perikanan Budidaya Balai Besar Pengembang
Budidaya Air Payau.
Astawan, M., Kasih, L.A. 2008. Khasiat Warna-Warni Makanan.
Jakarta : PT. Gramedia Pustaka Utama.
Brand-Williams, W., Cuvelier, M.E., Berset C. 1995. Use of Free Radical
Method to Evaluate Antioxidant Activity, cit. Journal of
Pharmacheutical 3: 96-105.
Britton, G, Jensen, S.L., and Pfander, H. 1995. Carotenoids Volume IA:
Isolation and Analysis. Birkhauser Verlag. Berlin p: 211.
Britton, G, Jensen, S.L., and Pfander, H. 1995. Carotenoids Volume
IB:Spectroscopy. Birkhauser Verlag. Berlin p: 211.
Darmanto, W. 2005. Pemanfaatan Polysaccharide Krestine (PSK) dalam
Menurunkan Radikal Bebas pada Darah Mencit Akibat Induksi 2-
Methoxyethanol. Jurnal ILMU DASAR Vol. 6 No. 2, 2005 : 96-102.
58
Day, R. A. dan A. L. Underwood. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi
Keenam. Jakarta: Erlangga.
DeMan, John. 1997. Kimia Makanan Edisi Kedua. Penerjemah
Padmawinata, K. Bandung : ITB Press.
Departemen Kelautan dan Perikanan Republik Indonesia. 2006. Industri
Kitin: Dari Limbah Menjadi Bernilai Tambah, Jakarta.
Dinda. 2008. Ekstraksi. http://www.medicafarma.com/ekstraksi (Diakses
pada tanggal 5 November 2013, pukul 21:05 WIB).
E. Efstathiou, C. 2000. Countercurrent Extraction - Craig Apparatus. http://www.chem.uoa.gr/applets/AppletCraig/Appl_Craig2.html.
(Diakses pada tanggal 9 Desember 2013, pukul 23:00 WIB).
Erdawati. 2011. Bahan Ajar Kimia Analitik. Jakarta : UNJ.
Giwangkara, E.G. 2007. Spektrofotometri Infra Merah.
http://persembahanku. Word press
.com/2007/06/26/spektrofotometri-infra-merah/. (Diakses pada
tanggal 5 Juni 2014, pukul 23:00 WIB).
Gordon, M.H. 1990. The Mechanism of Antioxidants Action In Vitro. Di
dalam: B.J.F. Hudson, editor. Food Antioxidants. Elsivier Applied
Science, London.
Gross, Jeana. 1991. Pigments In Vegetables (Chlorophylls and
Carotenoids). Van Nostrand Reinhold. New York. 7: 75.
Gulcin, I. 2003. Antioxidant and Analgesic Activities of Turpentine of Pinus
nigra arn. Subsp. Pallsiana (Lamb.) Holmboe. Journal of
Ethnopharmacology 86: 51-58.
Harborne, J. B. 1987. Metode Fitokimia Edisi kedua. Bandung: ITB.
Hartono, Gary. 2011. Karakterisasi Aktivitas Antioksidan Ekstrak
Karotenoid dari Cangkang Udang Windu (Peneaus monodon Fab.).
Karawaci : Universitas Pelita Harapan.
Hayati, E.K. 2007. Buku Ajar Dasar-Dasar Analisis Spektroskopi. Malang :
Universitas Negeri Malang. Hal:39.
59
Hendry, G.A.F., Houghton, J.D. 1996. Natural Food Colorants 2nd Edition.
London, Glasgow, Weinheim, New York, Tokyo, Melbourne, Madras
Blackie Academic & Professional.
Houghton, PJ dan Raman, A. 1998. Laboratory Handbook for The
Fractination of Natural Extract : Methods of Extraction and Sample
Clean-up. London : Chapman and Hall Ltd.
Hübshmann, Joachim. 2009. Handbook of GC/MS. WILEY-VCH Verlag
GmbH & Co. KGaA, Weinheim
Hugh, M. A. dan V. J. Krukonis. 1986. Supercritical Fluid Extraction :
Principles and Practisce. Buster Worth Publischers, Stochom. USA.
Khanafari, A., Saberi, A., Azar, M., Vosooghi, Gh. Jamili,Sh.,
Sabbaghzadeh. 2007. Extraction of Astaxanthin Esters From Shrimp
Waste By Chemical and microbial Methods. Iranian Journal of
Environment, Health, and Science Engineering. 4 (2) : 93-98.
Kochar, S.P. and B. Rossell. 1990. Detection Estimation and Evaluation of
Antioxidants in Food System. di dalam: B.J.F. Hudson, editor. Food
Antioxidants. Elvisier Applied Science. London.
Lenny, S. 2006. Senyawa Flavonoida, Fenil Propanoida dan Alkaloida.
Sumut: USU Respository.
http://librarv.usu.ac.id/downloadfimipa/06003488.pdf senyawa.
(Diakses pada tanggal akses 5 November 2013, pukul 20.30 WIB).
Manjang, Y. 1993. Analisa Ekstrak Berbagai Jenis Kulit Udang Terhadap
Mutu Khitosan. Jurnal Penelitian Andalas. 12 (V) :138-143.
Meija, E.A., E. Hudson, E. Gonzalez., D. Meijia., dan F. Vazque. 1988.
Carotenoid Contents and Vitamin A Activity of Some Common
Cultivars of Mexican Peppers as Determined by HPLC. Journal of
Food Science. 53 : 1448-1451.
Molyneux, P. 2004. The Use of Stable Free Radicals Diphenylpirylhydrazyl
(DPPH) for Estimating Antioxidant Activity. Songklanakarin Journal of
Science Technology. 26 : 211-219.
60
Mulja, M.H., 1995. Analisis Instrumental. Surabaya : Airlangga University
Press.
Naguib, M. A., 2000. Antioxidant Activities of Astaxanthin and Related
Carotenoids. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 : 1150-
1154.
May, J. M. 1999. In Ascorbic Acid An Antioxidant For The Plasma
Membrane. Faseb Journal. Vol. 13. Hal. 995-1006.
Mezzomo, N., J. Martínez, S.R.S. Ferreira, J. 2009. Supercritical Fluids 51
(1) 10.
Mezzomo, Natália., Maestri, Bianca., Dos, Santos, R.L. 2011. Pink shrimp
(P. brasiliensis and P. paulensis) residue: Influence of extraction
method on carotenoid concentration. Science Direct Journal of
Talanta. 85 :1383-1391.
Munson, J.W., 1981, Phrarmaceutical Analysis: Modern Methods, Part A
and B, diterjemahkan oleh Harjana dan Soemadi, Airlangga
University Press, Surabaya.
No, H.K., Meyers, S.P.,Lee, K.S. 1989. Crawfish Chitosan as Coagulant in
Recovery of Organic Compounds from Seafood Processing Streams,
Jounal of Agricultural and Food Chemistry. 37 : 575-579
Nur, M. A. dan Adijuwana, H. A. 1989. Teknik Pemisahan dalam Analisis
Biologi. Bogor : Pusat Antar Universitas Ilmu Hayat IPB.
Palmer, MV and Ting, SS. 1995. Application for Supercritical Fluid
Technology in Food Processing. Food Chemistry. 52 : 345-352.
Palozza P, Krinsky NI. 1992. Antioxidant effects of carotenoids in vivo and
in vitro: An overview. Meth Enzymol. 213 : 403-420.
Perdigão N.B., F.C. Vasconcelos, I.H.A. Cintra, M. Ogawa. 1995. Boletim
Técnico Científico da CEPENE. 3 (1) 234.
Pratt, D.E. 1992. Natural Antioxidants from Plant Material. di dalam : M.T.
Huang, C.T. Ho, clan C.Y. Lee, editor. Phenolic Compounds in Food
and Their Effects on Health H. American Society, Washington DC.
61
Pu, J. 2008. Development of Stable Microencapsulated Astaxanthin
Powders Using Extracted Astaxanthin from Crawfish and Shrimp By
Products. Jiangnan : A Thesis From Departement of Food Science
Jiangnan University.
Pu, Jing. 2011. Optimization of Purification Conditions of Radish
(Raphanus Sativus L.) Anthocyanin-Rich Extracts Using Chitosan.
Science Direct Journal of LWT - Food Science and Technology. 44 :
2097-2103.
Rodriguez-Amaya DB & Kimura M. 2004. HarvestPlus Handbook for
Carotenoid Analysis. International Food Policy Research Institute,
Washington DC.
Saleha, S. dan Murniana. 2009. Aktivitas Antioksidan Astaxanthin dari
Limbah Kulit Udang. Aceh : Universitas Syiah Kuala.
Sachindra, N. M., Bhaskar, N., Mahendrakar, N. S. 2006. Recovery of
Carotenoid from Shrimp Waste in Organic Solvents. Science-Direct
Journal of Waste Management. 26 : 1092-1098.
Schwartz, S.J. 1994. Pigment Analysis. Introduction to the Chemical
Analysis of Foods. Boston : Jones and Bartlet.
Sitorus, Marham. 2010. Kimia Organik Umum. Yogyakarta : Graha Ilmu.
Sowmya, R. dan Sachindra, N. M. 2012. Evaluation of antioxidant activity
of carotenoid extract from shrimp processing byproduct by in vitro
assays and in membrane model system. Science Direct Journal of
Food Chemistry. 134 : 308-314.
Stahl, W., Sies, H. 2003. Antioxidant Activity of Carotenoids. Molecular
Asfects of Medicine. 24 : 345-351.
T. Storebakken, M. Sorensen, B. Bjerkeng, J. Harris, P. Monahan, H.
Stephen. 2004. Aquaculture. 231489
Widmer, E. Widmer,E., Zell,R., Lukác,T., Casadei,M.,S chönholzer,P., dan
Broger,E.A. 1981. Technische Verfahren zur Synthese von
Carotinoiden und verwandten Verbindungen aus Oxo-isophoron. I.
62
Modifizierung der Kienzle-Mayer-Synthese von (3S,3'S)-Astaxanthin.
Jurnal Helv. Chim. Acta. 64 :2405-2418
Winarno F.G., Fardiaz S., Fardiaz D. 1973. Ekstraksi, Kromatografi, dan
Elektroforesis. Bogor : Fakultas Mekanisasi dan Teknologi Pertanian.
Yan, X., Chuda, Y., Suzuki, M., Nagata, T. 1999. Fucoxanthin as The
Major Antioxidant in Hijikia fusiformis, a Common Edible Seaweed.
Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 : 605-607.
Zeb, Alam dan Mehmood, Sultan. 2004. Carotenoid Contents from
Various Sources and Their Potential Helth Applications. Pakistan
Journal of Nutrition. 3 (3) : 199-204.
Dikukus selama 10 menit pada suhu 100°C.Dikeringkan hingga didapat massa yang stabil.Digiling sampai menjadi tepung.
Kulit Kepala dan Kulit udang yang telah dicuci
Tepung Kulit Udang
LAMPIRAN
Lampiran 1. Bagan Pembuatan Tepung Kulit Udang
Dicampur dengan 50 mL asetonDimaserasi selama 3 hari pada suhu ruang
5 gr tepung kulit udang
Ekstrak Astasantin
Dialirkan gas nitrogen selama 5 menitDipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 40o CDiukur absorbansinya pada panjang gelombang optimum dengan menggunakan spektrofotometer.
* Proses ekstraksi diulangi dengan waktu maserasi selama 5 dan 7 hari.
Dimurnikan dengan petroleum eter dalam corong pisah Ditambahkan dengan NaCl 1 %Diekstraksi kembali dan ditampung fasa organik
Fasa Organik
Ditambahkan Na2SO4 anhidratDisaring dan filtrat ditampung
Filtrat fasa Organik
Lampiran 2. Bagan ekstraksi Astasantin (Penentuan Waktu Optimum)
64
Dicampurkan dengan 40 mL asetonDimaserasi pada waktu optimum
5 gr tepung kulit udang
Ekstrak Astasantin
Dialirkan gas nitrogen selama 5 menitDipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 40o CDiukur absorbansinya pada panjang gelombang optimum dengan menggunakan spektrofotometer.
* Proses ekstraksi diulangi dengan volume aseton 45 mL
Dimurnikan dengan petroleum eter dalam corong pisah Ditambahkan dengan NaCl 1 %Diekstraksi kembali dan ditampung fasa organik
Fasa Organik
Ditambahkan Na2SO4 anhidratDisaring dan filtrat ditampung
Filtrat fasa Organik
Lampiran 3. Bagan ekstraksi Astasantin (Penentuan Rasio Pelarut Optimum)
65
Dilihat spektrumnya dengan spektrofotometer infra merah pada bilangan gelombang 750-4000 cm-1
Secuplikan larutan ekstrak Astasantin
Spektrum Infra Merah Ekstrak Astasantin
Lampiran 4. Bagan Karakterisasi Ekstrak Astasantin dengan
Spektrofotometer Infra Merah
66
Ekstrak Astasantin yang telah dihomogenisasi
Diambil 5 L ekstrak Astasantin dan diukur kadar Astasantin menggunakan KCKT pada suhu 40°C.
Dioven pada suhu 30oCDiencerkan dengan 1 mL n-heksana.Dihomogenisasi dengan homogeniser selama 5 menit.
Secuplikan ekstrak Astasantin
Lampiran 5. Bagan Pengujian Konsentrasi Ekstrak Astasantin dengan
KCKT
67
Larutan DPPH
Dilarutkan dengan metanol pro analisis hingga 50 mL.Ditempatkan dalam botol gelap.
Untuk setiap pengujian larutan dibuat baru
7,9 mg DPPH
Lampiran 6. Bagan Pembuatan Larutan DPPH 0,4 mM Uji Aktivitas Antioksidan
68
Larutan Blanko
Dipipet ke dalam tabung reaksi yang telah ditara 5 mLDitambahkan metanol pro analisis hingga tanda batas dan dihomogenkan
Mulut tabung ditutup dengan aluminium foil
1 mL larutan DPPH 1mM
Lampiran 7. Bagan Pembuatan Larutan Blanko Uji Aktivitas Antioksidan
69
Mulut tabung ditutup dengan alumunium foilDiinkubasi dalam penangas air 37oC selama 30 menit
Larutan Induk
Dilarutkan ke dalam 5,0 mL metanol pro analisis
5 mg ekstrak
Dipipet ke dalam 5 buah tabung reaksi yang telah ditara 5 mL sebanyak 50, 100, 250, 500 dan 1000 LDitambahkan 1,0 mL larutan DPPHDitambahkan dengan metanol pro analisis sampai 5 mL.Dihomogenkan
5 L/mL 10 L/mL 50 L/mL25 L/mL 100 L/mL
Larutan Uji
Diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum (kisaran 500-530 nm) dengan menggunakan spektrofotometer cahaya tampak.
Lampiran 8. Bagan Pembuatan Larutan Uji Aktivitas Antioksidan
70
Larutan Induk
Dilarutkan ke dalam 5,0 mL metanol pro analisis
3 mg vitamin C
Dipipet ke dalam 5 buah tabung reaksi yang telah ditara 5 mL sebanyak 250, 200, 150, 100 dan 500 LDitambahkan 1,0 mL larutan DPPHDitambahkan dengan metanol pro analisis sampai 5 mL.Dihomogenkan
15 L/mL 14 L/mL 6 L/mL9 L/mL 3 L/mL
Larutan Kontrol
Lampiran 9. Pembuatan Larutan Kontrol Uji Aktivitas Antioksidan
Diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum (kisaran 500-530 nm) dengan menggunakan spektrofotometer cahaya tampak.
71
72
Lampiran 10. Spektra Infra Merah Hasil Ekstrak Astasantin
7501000
12501500
17502000
25003000
35004000
1/cm
0 20 40 60 80
100
%T
3369.64
2924.09
1712.79
1620.21
1463.97
1377.17
1220.94
1170.79
1049.28
960.55
916.19
840.96
astaxanthin (cair)
73
Lampiran 11. Hasil Analisis Puncak Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Untuk Standar Astasantin
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min
-50
0
50
100
150
200
250
mAU
13.6
24/2
9080
Puncak standar pada menit ke-13,624; dengan luas area sebesar 29,080
pada panjang gelombang 460 nm.
13.4 13.5 13.6 13.7 13.8 min
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
mAU
475nm470nm465nm460nm455nm450nm445nm
73
Lampiran 12. Hasil Analisis Puncak Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
untuk Ekstrak Astasantin
Puncak sampel pada menit ke-13,280; dengan luas area sebesar 52,582
pada panjang gelombang 460 nm
13.25 13.50 13.75 14.00 min
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5mAU
475nm470nm465nm460nm455nm450nm445nm
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min
-5
0
5
10
15
20
25
30
mAU
13.2
80/5
2582
74
76
Lampiran 13. Perhitungan Konsentrasi Ekstrak Astasantin dengan KCKT
Diketahui
Konsentrasi standar Astasantin : 13,5 ppm
Luas area puncak standar : 52,582
Luas area puncak sampel (ekstrak Astasantin) : 29,080
Ditanya
Berapa besar konsentrasi sampel (ekstrak Astasantin) yang didapatkan?
Jawab
Faktor respon = Luasarea puncak standarkonsentrasi standar
Faktor respon = 52,582
13,5 ppm
Faktor respon = 3,895 ppm-1
Konsentrasi sampel (ppm) = Luasarea puncak sampel
Faktor respon
Konsentrasi sampel (ppm) = 29,080
3,895 ppm⁻ ᶦKonsentrasi sampel (ppm) = 7,466 ppm
Lampiran 14. Hasil Uji Antioksidan pada ekstrak Astasantin dengan
DPPH
NamaSampel
C(ppm) A1 A2 Ā A
BlankoInhibisi
(%)IC50
(ppm)Sampel 5 0,799 0,797 0,798
0,799
0,125
338,500
10 0,783 0,788 0,786 1,690
25 0,779 0,779 0,779 2,503
50 0,776 0,764 0,770 3,630
100 0,685 0,668 0,677 15,332
Vitamin C 3 0,509 0,450 0,480 39,987
2,7976 0,259 0,269 0,264 66,959
9 0,041 0,042 0,042 94,806
14 0,033 0,037 0,035 95,620
15 0,030 0,028 0,029 96,370
Keterangan :
C (ppm) : konsentrasi (ppm)
A1 : absorbansi simplo
A2 : absorbansi duplo
Ā : absorbansi rata-rata
IC50 : Inhibisi konsentrasi 50
76
Lampiran 15. Perhitungan Aktivitas Antioksidan pada Metode DPPH
untuk Larutan Sampel Ekstrak Astasantin
Konsentrasi 5 ppm
Inhibisi(% )=(SerapanBlanko−SerapanSampel)Serapanblanko
×100 %
Inhibisi(%)=(0,799−0,798)0,799
×100%Inhibisi (% )=0,125%
Konsentrasi 10 ppm
Inhibisi(% )=(SerapanBlanko−SerapanSampel)Serapanblanko
×100 %
Inhibisi(%)=(0,799−0,786)
0,799×100%Inhibisi (% )=1,690 %
Konsentrasi 25 ppm
Inhibisi(% )=(SerapanBlanko−SerapanSampel)
Serapanblanko×100 %
Inhibisi(% )=(0,799−0,779)0,799
×100 %Inhibisi (% )=2,503 %
Konsentrasi 50 ppm
Inhibisi(% )=(SerapanBlanko−SerapanSampel)
Serapanblanko×100 %
Inhibisi (% )= (0,799−0,770 )0,799
×100 %Inhibisi (% )=3,630 %
Konsentrasi 100 ppm
Inhibisi(% )=(SerapanBlanko−SerapanS ampel)
Serapan blanko×100 %
Inhibisi(% )=(0,799−0,677)0,799
×100 %Inhibisi (% )=15,332 %
Lampiran 16. Perhitungan Aktivitas Antioksidan pada Metode DPPH
untuk Larutan Kontrol Asam Askorbat
Konsentrasi 3 ppm
Inhibisi(% )=(Ser apanBlanko−SerapanSampel)Serapanblanko
×100 %
Inhibisi(%)=(0,799−0,480)
0,799×100%Inhibisi (% )=39,987 %
Konsentrasi 6 ppm
777
79
Inhibisi(% )=(SerapanBlanko−SerapanSampel)
Serapanblanko×100 %
Inhibisi(% )=(0,799−0,264)0,799
×100 % Inhibisi (% )=66,959 %
Konsentrasi 9 ppm
Inhibisi(% )=(SerapanBlanko−SerapanSampel)
Serapanblanko×100 %
Inhibisi(% )=(0,799−0,042)0,799
×100 %Inhibisi (% )=94,806 %
Konsentrasi 14 ppm
Inhibisi(% )=(SerapanBlanko−SerapanSampel)
Serapanblanko×100 %
Inhibisi (% )= (0,799−0,035 )0,799
×100 %Inhibisi (% )=95,620 %
Konsentrasi 15 ppm
Inhibisi(% )=(SerapanBlanko−SerapanSampel)
Serapanblanko×100 %
Inhibisi(% )=(0,799−0,029)0,799
×100 %Inhibisi (% )=96,370 %
Lampiran 17. Perhitungan Nilai IC50 pada Metode DPPH
a. Ekstrak Astasantin
Persamaan regresi linier pada grafik : Y = 0,150x
50 = 0,150x
X = 50
0,150
IC50 = 338,500
a. Vitamin C
Persamaan regresi linier pada grafik : Y = 4,353x
50 = 4,353x
X = 50
4,353
80
IC50 = 2,797