2중단위 결과 요약

약물대사기반연구사업단

장내미생물에 의한

대사체 분석연구

중단위 요약 장내미생물에 의한 대사체 분석연구중단위 요약 장내미생물에 의한 대사체 분석연구중단위 요약 장내미생물에 의한 대사체 분석연구중단위 요약 장내미생물에 의한 대사체 분석연구2009-2011. / 2 ( )2009-2011. / 2 ( )2009-2011. / 2 ( )2009-2011. / 2 ( )


2222////29292929


제 중단위 연구과제제 중단위 연구과제제 중단위 연구과제제 중단위 연구과제< 2 >< 2 >< 2 >< 2 >

요약문요약문요약문요약문1.1.1.1. ···················································································································· 3

중과제 연구개발 내용 및 방법1-1. 2 ································································· 3

연구결과 고찰 및 결론1-2. ················································································· 9

연구개발 목표연구개발 목표연구개발 목표연구개발 목표2.2.2.2. ································································································· 10

연구내용2-1 ··········································································································· 11

기대성과2-2 ·········································································································· 11

표 세부과제별 연구목표와 내용. ·················································································12

연구내용 및 방법연구내용 및 방법연구내용 및 방법연구내용 및 방법3.3.3.3. ·························································································· 13

최종 연구개발 결과최종 연구개발 결과최종 연구개발 결과최종 연구개발 결과4.4.4.4. ······················································································ 14

제 세부 차년도< 2-1 > 1 ···············································································································14

차년도2 ··············································································································16

차년도3 ··························································································· 18

제 세부< 2-2 > 차년도1 ·························································································· 22

차년도2 ·························································································· 23

연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론5.5.5.5. ···················································································· 24

제 세부< 2-1 > ··········································································································· 24

제 세부< 2-2 > ··········································································································· 27

3333////29292929


요약문요약문요약문요약문1.1.1.1.

중과제 연구개발 내용 및 방법중과제 연구개발 내용 및 방법중과제 연구개발 내용 및 방법중과제 연구개발 내용 및 방법1-1. 21-1. 21-1. 21-1. 2

가 연구내용가 연구내용가 연구내용가 연구내용....

천연물 및 약물 대사체의 최신분석기법 활용 분석방법 개발 및 확보천연물 및 약물 대사체의 최신분석기법 활용 분석방법 개발 및 확보천연물 및 약물 대사체의 최신분석기법 활용 분석방법 개발 및 확보천연물 및 약물 대사체의 최신분석기법 활용 분석방법 개발 및 확보oooo

약물 및 대사체를 혈액 및 뇨 시료에서 분석하기 위하여 유기용매를 사용하-

여 최적의 정제과정을 확립하고 LC-MS/MS 분석기기의 최적조건을 설정하여

고감도 초정밀 분석법을 개발함.

- UPLC-QTOF/MS, 분석기기를 사용하여GC/MS, LC/MS/MS , 내인성 대사

체를 검출할 수 있는 방법을 확립하고 장내미생물에 의한 내인성 대사체 프로

파일 변화를 관찰함.

항생제처리 모델 대사체 구조확인 연구항생제처리 모델 대사체 구조확인 연구항생제처리 모델 대사체 구조확인 연구항생제처리 모델 대사체 구조확인 연구o rato rato rato rat

에 항생제 혼합물을 투여하여- Rat pseudo germ-free 모델을 유도하고rat

체내동태연구를 위하여 hesperidin, gisenoside Re, actaminophen,

geniposide, baicaline, 및 esculetin을 투여하고 혈액시료를 취하여 혈 중 농도

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프로파일로부터 체내동태 파라미터를 항생제를 투여하지 않은 대조군과 비교하

여 장내미생물이 약물 또는 천연물의 체내동태에 미치는 영향을 연구함.

혈액은 반감기를 고려하여 혈액시료 채취시간을 정하여 정맥에 을- cannulation

통하여 정해진 시간에 시료를 채취함.

뇨 시료는 대사체 연구를 위하여 사용하며 를 사용하여 시- metabolic cage 6

간 시간 간격으로 모델에 과, 12 germ-free mouse actaminophen geniposide

를 투여하여 체내동태 연구를 수행함

소장 를 사용한 의 독성연구 방법의소장 를 사용한 의 독성연구 방법의소장 를 사용한 의 독성연구 방법의소장 를 사용한 의 독성연구 방법의o precision-cut slice geniposide in vitroo precision-cut slice geniposide in vitroo precision-cut slice geniposide in vitroo precision-cut slice geniposide in vitro

확립확립확립확립

를 제조하여 화합물을 독성평가 연구에 활용함- Tissue precision-cut slice

에서 뚜께의 소장 를 배지에 넣고 배양 후- Vibrotome 250-300 um slice

등의 활성을 평가함alkaline phosphatase, Na-K-ATPase, LDH

분변으로부터 장내세균의 분리 및 배양분변으로부터 장내세균의 분리 및 배양분변으로부터 장내세균의 분리 및 배양분변으로부터 장내세균의 분리 및 배양oooo

제 과제에서 제공된 분변 인 에서 장내미생물을 배양하여 여 가- 1-2 (20 ) 500

지의 균주를 관찰함

배양된 균주를 등 가지 합성기질에 대하여 대사활성을- b-glucuronidase 21

측정 후 활성이 높은 균주를 선별하고 이 균주를 대량 배양하여 가지 효소, 21

의 활성을 재측정 후 여개의 균주를 선별함100 .

장내세균의 장내활성 분석장내세균의 장내활성 분석장내세균의 장내활성 분석장내세균의 장내활성 분석oooo

활성이 우수한 개의 균주- 7 (BL-3, BL-1, Gam-6, Gam-2, JY-6, A-44,

를 선별하여 가지 합성기질에 대하여 대사활성을 측정함L-BL-8) 21

가지 분리균주를 혐기성 배지에서 시간 배양 원심분리 초음파 처리하여- 4 24 , ,

조효소액을 제조함

조효소액을 혼합 하여- (BL-3: JY-6: A-44=1:10:10:5) microbial enzyme

를 제조하고 이 조효소액의 효소활성을 와 비교함mixture fecalase

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장내미생물 및 대사체 관련 구축장내미생물 및 대사체 관련 구축장내미생물 및 대사체 관련 구축장내미생물 및 대사체 관련 구축o DBo DBo DBo DB

사용자 편의를 고려하여 컨텐츠 및 디자인 함- Web Web

구축과 프로그래밍 언어와 관리시스템으로 를 사용- DB DB Javs ServerPages

함

서비스 시스템을 구축함-

데이터베이스의 범위를 설정하고 검색목록을 지정함-

프로그램의 개발 범위는 를 이용하고 웹상에서 제작하며 에 비의- Mysql DB , IP

존적인 방식을 택하며 기술을 사용하여 를 가능하게 하여 비용을, JAVA update

절약하며 이용자가 쉽게 접근할 수 있는 인터페이스를 사용하여 를 구축함DB

개발 도구로서 문서형식은 을 활용하며 폰트 모양 디자인을 향상- DB DHTML , ,

시키고 그래픽 에디터는 을 사용함, Photoshop

나 연구방법나 연구방법나 연구방법나 연구방법....

분석기기를 활용한 약물 및 대사체의 분석방법 확립분석기기를 활용한 약물 및 대사체의 분석방법 확립분석기기를 활용한 약물 및 대사체의 분석방법 확립분석기기를 활용한 약물 및 대사체의 분석방법 확립LC/MS/MSLC/MS/MSLC/MS/MSLC/MS/MS

및 대사체의 분석법 의 혈중 농도분석법을 방- Hesperetin : Hesperetin LC/MS

법으로 확립함. MSn 분석기법을 이용한 의 대사체 구조 규명hesperetin ;

를 사용하여 혈장 뇨 및 변에서LC/MSD trap ion trap mass spectrometer ,

약물과 대사체를 분석함

분석법 사용하여- Amaranth : LC/MSD iontrap mass spectrometer MSn으로

분석함

과 의 분석법 분석장비는- Esculetin esculin : Finnigan TSQ Quantum Ultra

와mass spectrometer (Thermo, San Jose, USA) UFLC-20AD XR

을 사용하여 모든 시료를 분석binary pump system(Shimadzu, Toko, Japan)

함 사용한. C 은olumn Kinetex C18 (2.0 × 100 mm, 2.6 um,

이며 는 이고Phenomenex, Torrance, USA) , flow rate 0.5 ml/min , Injection

은volume 2 μ 로 분석함 이동상은L . A (0.1 % formic acid in water) and

으로 을 사B (0.1 % formic acid in acetonitrile) gradient elution program

용함

및 의 분석법 는- Genipin geniposide : LC/MS Agirent 6460 Triple Quad

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를 사용함 은 에서LC/MS . Genipin negative ion mode ESI (electrospray

를 이용하여 분석ionization) source MRM (multiple reaction monitoring)

조건을 확립함 은 는. Genipin m/z 225.2 101.2, geniposide 433.4

내부표준물질인 은 의 로 검출225.1, luteolin m/z 285.2 133.1 MRM mode

함 분석용 컬럼으로는. BDS hypersil C18 column (2.1 mm * 250 mm, 5 μ

을 사용하고 이동상으로는 와L) 0.1% formic acid (solvent A) 90%

를 사용하였고 유속을 로 하여서acetonitrile (solvent B) 0.25 mL/min

에서 분석함gradient system .

아세트아미노펜의 분석법- : 표준 물질은 acetaminophen (APAP),

3-cysteinylacetaminophen (APAP-Cys), 3-methoxy acetaminophen

(APAP-OMe), 3-methoxy acetaminophen (APAP-OMe), acetaminophen

glutathione (APAP-Glth), 4-acetamidophenyl-beta-D-glucuronide

(APAP-Glc), 4-acetaminophen sulfate (APAP-Sul),

등이며 내3-(N-acetyl-L-cystein-S-yl) acetaminophen (APAP-NAC)

부표준물질로 acetaminophen-d4 (APAP-d4),

4-acetamidophenyl-beta-D-glucuronide-d3 (APAP-Glc-d3 등을 사용)

함 기기분석조건은 을 이용하여 로 분석하. API 3200 system LC-MS/MS™

고 이때 사용한, C 은olumn Capcell Pak C18 MG II (2.0 × 150 mm, 5 um,

이며 는Shiseido, Japan) , Column flow 300 μ 이고 주입량은L/mL , 5 μ 로L

분석함 이동상 조건은. A (0.1 % formic acid in 5 % acetonitrile) and B

으로 에서 분석함(0.1% formic acid in 95 % acetonitrile) gradient system .

분석물질 및 조건은MS/MS 혈장 및 뇨 중 와 그 대사체들을APAP

에서 분석하기 위하여 와 그 대사체들의electrospray ionization LC/MS APAP

이온화를 위한 조건을 확립하고 을 규명함MS/MS fragment pattern .

Pseudo germ-free rat modelPseudo germ-free rat modelPseudo germ-free rat modelPseudo germ-free rat model 및 모델에서 체내동태및 모델에서 체내동태및 모델에서 체내동태및 모델에서 체내동태Germ-free mouseGerm-free mouseGerm-free mouseGerm-free mouse

비교 연구비교 연구비교 연구비교 연구

- 의 확립Pseudo germ-free rat model : Sprague-Dawley(SD) rat

을 사용하여 실험기간동안 물과 사료는 자유로이 공급하고 사육(240±10 g) , ,

실내의 온도는 습도는 로 유지함 실험동물은 군으로23±2 °C, 55 ±10 % . 2

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나누고 한 군은 정상 대조군으로 정하고 대조군 은( ), Pseudo germ-free rats

정상 쥐에게 항생제 혼합액을 경구 투여하여 완성한 후 약물을 투여함.

수술방법 실험동물은 마취제를 복강 투여하여 마취한 후 수술대에 고정하고- : ,

좌측 쇄골 유첨근 위를 가량 절개하고 핀셋으로 경동맥을 분리하여 들어1cm

올린 후 위쪽과 아래쪽에 각각 봉합사를 걸쳐 놓음 튜브는 주사. SP-45 1 mL

기와 연결한 후 헤파린을 채워 준비함 바늘을 사용하여 혈관100 U/mL . 25G

에 구멍을 내고 준비된 튜브를 심장방향으로 삽입한 후 봉합사로 위쪽, SP-45

과 아래쪽을 걸쳐 둔 봉합사로 묶어서 고정함 고정된 튜브는 튜브 유. SP-45

도관을 통해 등 뒤쪽까지 뽑아내고 autoclavable low profile button/tether

에 연결하여 보호함assembly .

약물의 투여 항생제 처리 모델에- : rat hesperetin (40 mg/kg), ginsenosie

원료Re (50 mg/kg), geniposide (300 mg/kg), Baicalin (50 mg/kg), 아

세트아미노펜 과 용량으로 경구(200 mg/kg), Esculetin Esculin (40 mg/kg)

투여함 투여 후 시간별로 이상 채혈 후 원심분리하여. 200 L plasma 100μ

를 취함 는 전까지 에서 보관함 뇨 시L . plasma sample preparation -80 .μ ℃

료 역시 각 약물의 경구 투여 후 시간에 따라 채취 한 후 분석 전까지 보관함.

모델-Germ-free mouse : 아세트아미노펜 (200 mg/kg, 300 mg/kg 의 경우)

대조군 정착동물 무균동(SPF), (Gnotobiota), 물 군으로 나누(Germ-free) 3

어 을 경구 투여하여 채혈하고 시료 전처리 과정 후 분석하여 혈중농도를 비교

함 의 경우 일반 및 에 경구. Ginsenoside Re (50 mg/kg) germ-free mouse

투여하고 혈액 시료에서 모 약물 및 대사체를 정량 분석함.

시료의 전처리:

장내에서 직접 흡수되지 않는다고 알려졌고 미생물에 의해Geniposide:

으로 대사된 후 흡수되며 은 체내에서 대부분 대사되어genipin genipin

로 존재한다고 알려짐 따라서 혈장 중의 을 분석하고자genipin-sulfate . genipin

다음과 같은 전처리를 수행함 에. Plasma sample 100 L sulfatase 50 L,μ μ

넣은 후 에서 분 반응시킴ascrobic acid (125 mg/mL) 20 L 37°C 30 . 30μ

분후 내부표준물질 넣고(2 g/mL luteolin) 10 L ethyl acetate 0.5 mLμ μ

넣은 후 진행한 후 에서 분간 원심분리 시키고 상층액vortexing 13000 rpm 5

을 N2 를 이용하여 휘발시킴 남은 잔사에 을 가gas . 50 % methanol 100 Lμ

하여 용해한 후 를 이용하여 를 주입하여 분석함LC/MS 5 L .μ

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에 내부표준물질 이 포Esculetin, Esculin: Plasma 100 L (levafloxacine)μ

함된 을 와 를 가하여 혼합한acetonitrile 100 L 0.2 % ascorbic acid 10 Lμ μ

후 을 충분히 하여 혈장단백질을 제거한 후 원심분리하여 상층액vortexing

를 취한 후 를 에 주입함100 L 2 L LC-MS/MS .μ μ

아세트아미노펜 내부 표준물질로: APAP-d4 (acetaminophen-d4, 10 μ

g/mL), APAP-Glc-d3 (acetaminophen -glucuronide-d3, 의10 g/mL)μ

혼합액을 사용함 의 경우 에 내부표준물질 혼합액을. Plasma , 100 L 20 Lμ μ

씩 가하여 혼합한 후 을 씩 가하고 을 충분히 하여methanol 200 L vortexingμ

혈장단백질을 제거함 그 후 에서 분간 원심 분리하여 상층액을. 14000 rpm 10

취하여 질소가스 하에서 건조시키고 분석 전까지 에서 보관200 L -20μ ℃

함 분석을 실시하기 직전에. 50% methanol 100 으로 재조정함L . Urineμ

의 경우 에 내부표준물질 혼합액을 씩 가하여 혼합한 후, 100 L 20 Lμ μ

을 씩 가하고 을 충분히 하여 혈장단백질을 제거methanol 180 L vortexingμ

후 에서 분간 원심 분리한 후 상층액을 취하여 분석함14000 rpm 15 150 L .μ

연구연구연구연구o global metabolic profilingo global metabolic profilingo global metabolic profilingo global metabolic profiling

항생제 처리한 모델 뇨시료에서 로 여과하고- Ultrafree-MC filter

로 범위에서 분석 비교하여 다변량분석과UPLC-TOF-MS m/z 50-1200

검색으로 내인성 대사체를 추정함data .

방법을 사용한 장내미생물의 존재 여부에 따른 대-Global metabolic profiling

사체 변화를 관찰하기 위하여 에 의한 대사체 분석을 위한 시UPLC/QTOF-MS

료의 전처리 법 개발 및 에 의한 대사체 분석함LC/MS .

담즙산 그외 전구체 및 대사체 정량분석 장내미생물에 의한 담즙산 농도 변- , :

화를 뇨 시료를 효소가수반응하고 로 추출하여 로 분석함MTBE GC/MS .

소장 를 활용한 의 독성 연구소장 를 활용한 의 독성 연구소장 를 활용한 의 독성 연구소장 를 활용한 의 독성 연구o precision-cut slices Geniposideo precision-cut slices Geniposideo precision-cut slices Geniposideo precision-cut slices Geniposide

의 소장을 적출하여 기법을 활-SD rat precision-cut small intestine slices

용하여 소장의 절편을 배지에서 배양하여 와 을William E geniposide genipin

노출시킨 후 alkaline phosphatase, Na+/K+-ATPase, lactate

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의 활성을 측정하여 독성효과를 측정함dehydrogenase .

배지에서 와 의 분석법을 개발함-William E geniposide genipin HPLC .

연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론1-2.1-2.1-2.1-2.

○ 세부과제 장내 미생물에 의한 내인성 대사체의 변화 및 약물의2-1 :

변화를 검출하기 위하여 항생제 처리로 장내 미생물을 사멸pharmacokinetic

시킨 항생제 처리 쥐 을 유도하는 방법을 개발하였(pseudo germ-free rat)

음. 방법을 활용하여 생체시료에서 극미량 약물GC/MS, LC/MS, LC/MS/MS

또는 천연물과 그 대사체들을 분석할 수 있는 분석법을 개발하였고 또는, rat

항생제 처리 모델의 혈액 또는 뇨 시료에서 약물 또는 천연물의 대사mouse

체 구조를 동정하였으며 원물질과 대사체 각각에 대해 체내동태을 확인하였음, .

즉 및 아세트아미노펜 등을 각각hesperidin, baicalin, esculin, geniposide

정상 쥐와 항생제 처리 쥐 하여 경구 투여하여 각각(pseudo germ-free rat)

에 대해 대사체들을 확인하였고 원물질과 그대사체들 각각에 대해여 체내동태,

가 정상 쥐와 항생제 처리 쥐 에서 차이가 있음을(pseudo germ-free rat)

확인하였음 또한 내인성 대사체의 프로파일 변화를 확인할 수 있는. global

방법과 담즙산 및 그 전구체를 정량 분석할 수 있는metabolic profiling

분석법을 확립하고 장내미생물 활성과 관련하여 뇨 중 내인성 대사체GC-MS

프로파일의 변화와 담즙산의 뇨 중 농도 변화를 확인하였음 이를 통해서 확립.

된 방법으로 장내 미생물이 약물 및 천연물 대사 및 체내동태에 미치는 영향과

내인성 대사에 미치는 영향을 평가할 수 있음을 증명하였음 본 연구을 통해.

확립된 방법들은 향후 다양한 약물 및 천연물 대사에서 장내 미생물의 역할과

그 기전을 연구하는데 활용도가 높을 것으로 사료됨.

○ 세부과제2-2 : 약물대사 혼합효소의 제조는 식품 및 의약품의 대사활성 및 독

성에 분변효소가 미치는 영향을 파악하기 위하여 사람으로부터 분변효소를 채

취하는데 있어서 임상윤리위원회를 거치는 등 과정의 까다로움과 번거로움 그,

10101010////29292929


리고 분변효소의 낮은 활성 및 쉽게 실활되는 분변효소 를 대신할 수(fecalase)

있는 분변 인 으로부터 여종 이상의 균주를 분리하고 이들을 가지(20 ) 200 , 21

의 효소활성을 측정하고 효소활성이 특이하게 보이는 여개의 균주를 선별, 170

하고 이중에서 개만을 선별하여 제조한9 는intestinal microbial enzyme mix

-80o 에서 냉동보관한 분변 효소액C (fecalase) 효소활성이 주일 이내에1 50%

이상 소실되는 것에 반해 차년도에 제조한 혼합효소액의 효소활성은, 1 4-mix

주 동안에는 안정하였으며 주 보관 후에도 정도만 소실되었음1 , 2 15%

연구목표연구목표연구목표연구목표2.2.2.2.

식품첨가물 한약 천연물 신약 등 장내미생물총에 의해서 생성되는 대사체들o , ,

에 의한 독성평가를 위한 장내미생물의 대사활성을 평가하기 위한 in vitro 및

장내세균총 대사활성시스템 확립 대사체의 기기분석 방법 확립함in vivo , .

합성기질 및 천연성분의 대사활성에 대한 기질특이성을 분석하여o fecalase를

대신할 수 있는 약물대사효소계 의 제조(intestinal microbial enzyme mix)

2-12-12-12-1 연구내용연구내용연구내용연구내용

제 세부과제[ 2-1 ]

o 미생물세균총 대사활성 시스템 활용한 대사체 연구In-vitro

o 항생제 처리 모델 대사체 구조 확인 연구rat

o 천연물 및 약물 대사체의 최신 분석 기법 활용 분석 방법 개발 및 확보

11111111////29292929


제 세부과제[ 2-2 ]

o 건강한 한국인 분변으로부터 장내세균총을 분리하여 효소활성 분석

o 분리 장내미생물의 천연물 성분에 대한 대사활성 분석

o 효소활성을 대신 할 수 있는 의 제조Fecalase microbial enzyme mix

기대성과기대성과기대성과기대성과2-22-22-22-2

o 미생물 특이적인 독성 발현을 규명함으로써 안전성 평가에 기여

장내미생물의 분해 대사 작용에 의해 독성을 나타내는 식품 의약품등을 평가o , ,

하여 기반자료를 제공함으로써 안전관리 정책에 기여

식품 의약품 등의 장내 미생물응용 독성평가를 통한 과학적 규제 정책 지원o ,

12121212////29292929


구분구분구분구분 목표목표목표목표 연구 내용연구 내용연구 내용연구 내용

세부2-1

과제

장내미생물 연구를 위한o

모델 확보 및 식in vivo

품 의약품 함유성분의,

장내미생물대사체 분석방

법 및 분석

정상동물 항생물질처리군 및 무균동물에,서 대사체 분석 방법 및 체내동태 연구에 의한 장내미생물의 영향 연구

아세트아미노펜Hesperitin, baicalin, ,ginsenoside, Re, geniposide,

의 체내동태 파라미터esculetin, esculin비교에 의한 장내미생물 영향연구

아세트아미노펜은(geniposide,군에 투여하여 체내gnotobiote mouse

동태파리미터의 비교).

에서 아세트Peusdo germ-free model아미노펜 대사체 확인연구

장내미생물이 내인성대사체인 담즙산과담즙산 대사체 및 의 농도변화oxysterol에 미치는 영향 연구

세부2-2

과제

독성평가를 위한o

intestinal microbial

제조enzyme mix

사람의 장내세균총으로부터 미생물분리

장내세균총에서 등-glucuronidaseβ효소활성 분석

분리 장내미생물의 천연물 및 한약 읭o ,약품에서의 효소활성 분석

약물대사활성이 강한 균주 선별하여의 제intestinal microbial enzyme mix

조

13131313////29292929


연구내용 및 방법연구내용 및 방법연구내용 및 방법연구내용 및 방법3.3.3.3.

구분구분구분구분 연구 내용연구 내용연구 내용연구 내용 연구 방법연구 방법연구 방법연구 방법

세부1

항생제모델을 활용한 대사

체 분석연구

항생제모델을 활용한 대상물질의 투여

및 시료의 확보

천연물 약물 등의 고감도,

기기분석법 개발 및 응용

천연물 및 약물대사체의 최신LC/MS

분석기법을 활용한 분석방법의 개발

장내미생물총에 의해 대사

를 받아 독성을 유발하는 대

사경로의 확인 연구

MSn 분석기법을 이용하여 장내미생

물에

의해 생성된 대사체의 구조 규명

장내미생물에 의한 내인성대사체의 변

화 검출

세부2

분변으로부터 장내세균의

분리 및 배양

검체수집 분리균주의 동정 및 조 효,

소액의 조제

장내세균의 장내활성 분석 합성기질을 이용한 효소활성의 측정

14141414////29292929


최종 연구개발 결과최종 연구개발 결과최종 연구개발 결과최종 연구개발 결과4.4.4.4.

제 세부제 세부제 세부제 세부< 2-1 >< 2-1 >< 2-1 >< 2-1 >

차년도차년도차년도차년도: 1: 1: 1: 1

가 최신분석기법을 활용 약물대사체 분석법 개발 및 대사체 구조 확인가 최신분석기법을 활용 약물대사체 분석법 개발 및 대사체 구조 확인가 최신분석기법을 활용 약물대사체 분석법 개발 및 대사체 구조 확인가 최신분석기법을 활용 약물대사체 분석법 개발 및 대사체 구조 확인....

을 을 사용하여 배양 후 생성된 대사체는 각- Hesperitin rat liver microsome

각 과 대사체로 추정되는 대사체 확인하였다demethyltion hydroxylation .

MSn의 분석 결과 이 대사체는 이 된2-methoxyphenol group demethylation

대사체로 확인되었다.

분석법 에서 이온을 생성- Amaranth : ESI-MS positive ion mode m/z 539 하

였다. 을 규명하기 위해CID fragmentation pattern MSn의 분석결과 m/z 521

의 과 가 탈락된 과 이온이 생성되었다dehydroxylation sulfate m/z 457 375 .

나 항생제처리 동물모델에서 대사체 및 프로파일링 연구나 항생제처리 동물모델에서 대사체 및 프로파일링 연구나 항생제처리 동물모델에서 대사체 및 프로파일링 연구나 항생제처리 동물모델에서 대사체 및 프로파일링 연구....

항생체 처리 모델에서의 총 의 체내동태파라미터는 대조군의- hesperetin

가 항생제 처리군보다 약 배가량 높았다 는 정상군에서는AUC 3 . Cmax 578

항생제처리군에서는 로 정상군에서 더 높게 나타났다ng/mL, 198 ng/mL .

혈청시료 중 의 분석법을 확립하였다 내부표준물질을- hesperetin . terfenadine

으로 하고 에서 양호한 직선성을 나타내었다2-1000 ng/mL .

다 장내 미생물에 의한 내인성 변화검출을 위한 연구다 장내 미생물에 의한 내인성 변화검출을 위한 연구다 장내 미생물에 의한 내인성 변화검출을 위한 연구다 장내 미생물에 의한 내인성 변화검출을 위한 연구. global metabolic profiling. global metabolic profiling. global metabolic profiling. global metabolic profiling

항생제 처리 전 후의 뇨를 로 분석하여 의- rat UPLC-TOF-MS PLS-DA 3

차원 을 분석한 결과 뚜렷한 두 군의 이 구별되어 두 군score plot clustering

15151515////29292929


사이에 대사의 변화가 관찰되었다 이 의 분석결과 각 값에 해당. data base m/z

하는 물질로 추정되는 대사체를 검출할 수 있었다.

결과로부터 좀 더 신뢰성 있는 대사체 검출을 위하여 값을 고- PLS-DA VIP

찰하였을 때 그 값이 이상인 값을 분석하여 를 수행하고 추정 대사체, 1.3 HCA

를 확인한 결과 량이 항생제 전후에 감소하거나, amino acid, sterol, steroid

증가하여 이 대사체들이 영향을 받는 대사체 군임을 확인하였다.

라 및 의 에서의 독성 평가라 및 의 에서의 독성 평가라 및 의 에서의 독성 평가라 및 의 에서의 독성 평가. Geniposide Genipin precision-cut small intestine slice. Geniposide Genipin precision-cut small intestine slice. Geniposide Genipin precision-cut small intestine slice. Geniposide Genipin precision-cut small intestine slice

방법의 확립방법의 확립방법의 확립방법의 확립

을 이용한 독성평가 방법의 확립하기 위하여- Percision-cut small intestine

소장을 의 로 만들어 배지에서 배양하였다rat 250 m slice William E .μ

배양시간에 따른- Na+/K+ ATPase, NADPH oxidase, alkakine phosphatase

의 활성을 비교하여 에서 와 의 영향을 비교하였2 hr, 6 hr geniposide genipin

다.

는 에서 농도에서-Geniposide 6 hr 10-100 M Naμ +/K+ ATPase, alkakine

의 활성이 감소됨이 관찰되어 독성을 나타내는 것으로 확인하였다phosphatase .

이에 비해 은 에서 현저한 활성을 나타내지 않았다genipin 6 hr .

과 의-Genipin geniposide 분석법HLPC 을 개발하였다 내부표준물질은. methyl

으로 하고 는 로 은 로 추paraben geniposide n-butanol , genipin ethyl acetate

출하여 정량분석 하였다.

16161616////29292929



가 항생제 투여에가 항생제 투여에가 항생제 투여에가 항생제 투여에.... 의한 의 대사변화를 위한 대사체의한 의 대사변화를 위한 대사체의한 의 대사변화를 위한 대사체의한 의 대사변화를 위한 대사체pseudo germ-free rat modelpseudo germ-free rat modelpseudo germ-free rat modelpseudo germ-free rat model

연구연구연구연구

으로 내인성 대사체의 변화 확인- Global metabolic profiling

장내 미생물이 존재하였을 때와 존재하지 않았을 때의 내인성 대사체의 변화를

살펴보기 위하여 을 진행하였고 변화를 보이는 대사global metabolic profiling ,

체들의 표준품을 이용하여 장내 미생물의 활성과 관련된 내인성 대사체 지표물

질을 확인하였다.

담즙산 그의 합성 전구체인 의 정량 분석- , oxystrol

장간순환에 의행 영향을 많이 받는 내인성 대사체인 담즙산과 그의 합성 전구

체인 을 정량 분석하여 장내 미생물의 존재 유무에 따른 담즙산의 농oxystrol

도변화를 확인하였다.

나나나나. Pseudo g. Pseudo g. Pseudo g. Pseudo germ-free rat modeerm-free rat modeerm-free rat modeerm-free rat mode의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구

장내 미생물의 특이 대사시스템이 약물의 독성 유발 기전 및 약동력학 특징에-

미치는 영향을 확인하기 위하여 등의 항, bacitracin, neomycin, streptomycin

생제를 투여하여 장내미생물을 제거한 pseudo germ free rat (antibiotics

항생제 처리군 을 완성하고 장내 미생물에 의한 약물의 독성기treated group, ) ,

전 및 약동력학 특징 규명을 위한 in vivo 으로 사용하고자 하였다 대system .

표적인 독성 약물인 아세트아미노펜을 정상 쥐와 쥐pseudo germ-free

항생제 처리군 에 경구 투여하고 모약물 및 대사(antibiotics treated group, )

체 약동력학적 변화를 관찰하여 장내 미생물이 아세트아미노펜의 대사 및 약동

력학적 특징에 미치는 영향 특히 독성 유발 대사체 변화에 미치는 영향을 확인,

하였다.

17171717////29292929


다다다다.... 에서의에서의에서의에서의Germ-free mouseGerm-free mouseGerm-free mouseGerm-free mouse 아세트아미노펜의 대사변화 연구아세트아미노펜의 대사변화 연구아세트아미노펜의 대사변화 연구아세트아미노펜의 대사변화 연구

장내 미생물의 특이 대사시스템이 약물의 독성 유발 기전 및 약동력학 특징에-

미치는 영향을 확인하기 위하여 에, germ free mouse acetaminophen 200

으로 경구 투여하고 모약물 및 대사체를 정량분석하였다mg/kg .

를 대조군 정착동물 무균동물 의 군- mouse (SPF), (Gnotobiota), (Germ free) 3

으로 나누어 acetaminophen(APAP) 200 mg/kg/10 mL 에 녹50% PEG400

인 용액을 경구투여하고 시간에 따라 채혈하여 를 취하여 분석하였다plasma .

라 장내 미생물 대사가 의 체내동태에 미치는 영향라 장내 미생물 대사가 의 체내동태에 미치는 영향라 장내 미생물 대사가 의 체내동태에 미치는 영향라 장내 미생물 대사가 의 체내동태에 미치는 영향. ginsenoside. ginsenoside. ginsenoside. ginsenoside

혈장 중 및 그 대사체들을 분석하기 위하여- Rat Ginsenoside Re

를 이용한 분석법을 개발하였다triple-quadrupole LC/MS/MS . Ginsenoside

는 은 는Re 945 475, Ginsenoside Rg1 799 637, Ginsenoside Rg2→ →

과 은 은783 475, Ginsenoside Rh1 F1 637 475, protopanaxatriol→ →

그리고 은 인 은 의475 391, internl standard digoxin 779 649 ion→ →

을 갖는 에서 를transition MRM (multiple reaction monitorite) mode peak

검출하였다 는 머무름 시간 분 은. Ginsenoside Re 4.5 , Ginsenoside Rg1 4.6

분, Ginsenoside 는 분Rg2 6.4 , 은 분Ginsenoside Rh1 6.6 , Ginsenoside F1

은 분 은 분 그리고 은 는 분에서7.0 , protopanaxatriol 9.9 , internl standard 5.0

이 검출되었고 방해 는 전혀 나타나지 않았으며 우수한peak , peak selectivity

를 나타내었다.

검량선 및 그 대사체들의 검량선은- Ginsenoside Re 5~1000 ng/ml의 범위

내에서 이루어졌으며 검량선 r2값이 이상으로 우수한 직선성을 나타내었0.997

다.

및 은 개의 농도- Intra- inter- day validation 3 (10, 100, 1000 ng/ml)에

서 일 동안 시행하였다 및 는5 . intra- inter- day accuracy 91.8 ~ 114%

18181818////29292929


이며 은 으로 나타내었으며 모, precision relative standard devidation (RSD)

두 이었다1.04 ~ 10.7% RSD .

와 그 대사체들에 대하여 를 진행하였다- Ginsenoside Re stability test . Shor

term (2 days in deep freezer), long term (2 weeks in deep freezer),

그리고 에 대하여 를 진autosampler stability (2 days in autosampler) test

행하였다 는 은 로. Accuracy 86 ~ 115%, precision 1.02 ~ 10.2% RSD

에는 이상이 없음을 확인하였다stability .

마 장내 미생물 대사가 의 대사에 미치는 영향 연구마 장내 미생물 대사가 의 대사에 미치는 영향 연구마 장내 미생물 대사가 의 대사에 미치는 영향 연구마 장내 미생물 대사가 의 대사에 미치는 영향 연구. baicalin. baicalin. baicalin. baicalin

항생제 처리군과 대조군에서 체내동태 비교연구- baicalin

항생제 처리군과 대조군에 각각 을 용량으로 경구투여하고baicalin 50 mg/kg

혈장 내의 의 농도를 측정하였다 을 경구투여 후 항생제 처리baicalin . Baicalin

군과 대조군의 혈중농도로부터 를 구하였baicalin pharmacokinetic parameter

다 그 결과 는 대조군이 항생제 처리군보다 배 높았고 도 유. AUC 1.4 Tmax

의성 있게 차이가 보였다 이 결과는 항생제 처리군이 장내미생물이 감소하여.

이 으로 대사되는 양이 감소함으로써 체내로의 흡수된baicalin baicalein

의 양이 감소되었고 따라서 체내의 의 양도 감소되었다고 볼baicalein baicalin

수 있다.


가 장내미생물 대사가 과 의 약동력학에 미치는 영향 연구가 장내미생물 대사가 과 의 약동력학에 미치는 영향 연구가 장내미생물 대사가 과 의 약동력학에 미치는 영향 연구가 장내미생물 대사가 과 의 약동력학에 미치는 영향 연구. esculetin esculin. esculetin esculin. esculetin esculin. esculetin esculin

과 의 혈장 중 농도를 방법으로 분석하고 분석법- Esculetin esculin LC/MS/MS

을 하여 분석법을 확립하였다 의 경구 투여validation . Esculetin(40 mg/kg)

후 대조군과 비교시 항생제 처리모델에서 의 에는 유의성 있는, esculetin AUC

차이가 없었다 체내동태파라미터 중. , k(hr-¹), t1/2 은 대조군에 비해 항생(hr)

19191919////29292929


제 처리모델에서 통계처리상 유의성 있는 차이가 나타났다.

의 투여 후 이 대사되어 이 검출되었다 또한- Esculin Esculin Esculetin .

혈장에서 모두 이 검출되었다Esculetin, Esculin unkown peak .

나 장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구나 장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구나 장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구나 장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구. geniposide. geniposide. geniposide. geniposide

를 이용한 혈장시료 중 와 의 정량분석법 개발- LC/MS/MS geniposide genipin

혈장 중 와 을 분석하기 위하여Rat geniposide genipin triple-quadrupole

를 이용한 분석법을 개발하였다 는 분자량이 로LC/MS/MS . Geniposide 388.14

에서 가 검출되었으며negative ion mode molecular ion m/z 433.4 MS/MS

에서는 이 주요 으로 검출되었고product ion spectrum m/z225.1 fragment ion

은 가 검출되었으며genipin molecular ion m/z 225.2 MS/MS product ion

에서는 가 주요 으로 검출되었다 따라서spectrum m/z 101.2 fragment ion .

는 은 내부표geniposide m/z 433.4 225.1, genipin m/z 225.2 101.2,

준물질인 은 은luteolin m/z 285.2 133.1, digoxin 825.2 779.2

을 이용한 방법으로 를 검출하였다transition MRM peak . Geiposide, Genipin

과 들은 각각의 머무름 시간 분 부근internal standard 2.36, 2.54, 2.79, 2.77

에서 검출되었고 위에서 기술한 검출조건에서 타 물질에 의한 영향은 없었으며

우수한 를 나타냈다selectivity .

치자 색소 원료 중 의 함량 측정- geniposdie

표준품 을 이용하여 치자 색소 원료 중Geniposide (Wako, Japan)

및 의 함량을 측정하였다 분석 결과geniposide genipin . LC/MS/MS ,

의 함량은 은 로 측정되었다geniposide 47% genipin 1.3% .

항생제 처리 쥐에서의 의 약동력학 연구- geniposide

정상쥐와 항생제 처리 쥐에 각각 치자 색소 원료 를* (300 mg/kg geniposide)

경구 투여한 후 혈장 중의 과 농도를 측정하였다genipin geniposide .

원료를 경구투여 후 효소 처리하여 항생제 처리군과 대조군의* Geniposide

20202020////29292929


혈중농도를 측정한 결과 와 는 비슷한 값을 보였다genipin AUC Cmax .

혈중농도를 측정한 결과 와 는 그래프상에서* Geniposide AUC Cmax

군이 높은 수치로 보이지만 통계적인 유의성은 없었다antibiotics-treated ,

정상쥐와 항생제 처리쥐에 각각 치자 색소 원료 를* (300mg/kg geniposide)

경구 투여한후 시간까지 를 수집하여 중의 와24 feces feces geniposide genipin

양을 측정하였다.

는 항생제 처리쥐에서 정상쥐보다 배정도 높았으며 유의성 있는* Geniposide 29

차이가 나타났다 이는 항생제 처리군이 장내미생물이 감소함으로써.

가 으로의 대사가 감소되었다고 볼 수 있다 은 정상geniposide genipin . Genipin

쥐에서 항생제 처리쥐보다 배 높았고 유의성 있는 차이는 없었다4 .

에서 의 약동력학 연구- Germ-free, gnotobiotic mouse geniposide

정상 그리고 에서mouse, germ-free mouse gnotobiotic mouse geniposide

를 각각 경구투여한 후 효소 처리하여 혈장 중 의 농도를 측정함genipin .

의 농도는 시간에서 최고 농도를 보이며 점차 감소하였다 정상쥐에Genipin 0.5 .

비해 와 에서 의 혈중 농도가 높germ-free mouse gnotobiotic mouse genipin

게 나타났다.

다 과 대사체의 동시 정량분석방법의 개발다 과 대사체의 동시 정량분석방법의 개발다 과 대사체의 동시 정량분석방법의 개발다 과 대사체의 동시 정량분석방법의 개발. Acetaminophen. Acetaminophen. Acetaminophen. Acetaminophen

를 이용하여 혈장 및 뇨 중 아세트아미노펜 및 가지 대사체에 대- LC/MS/MS 6

한 분석법을 확립하였으며 본 분석법을 이용하여 아세트아미노펜에 대한 약동

력학 연구를 수행하였다.

를 이용하여 아세트아미노펜 및 가지 대사체에 대한 분석법에 대- LC/MS/MS 6

하여 을 진행하였으며 모두 기준에 만족하였다validation .

라라라라. Pseudo germ-free rat model. Pseudo germ-free rat model. Pseudo germ-free rat model. Pseudo germ-free rat model의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구

정상쥐와 항생제 처리 쥐에 각각 아세트아미노펜을 투여한 후 혈장 중 아세트-

21212121////29292929


아미노펜 및 가지 대사체의 농도를 분석한 결과 두 그룹에서 아세트아미노펜6

과 아세트아미노펜 글루타치온 포합체의 값이 유의적인 차이를 보였으며AUC ,

항생제를 처리하여 만든 그룹에서 대조군에 비하여 두 가pseudo germ-free

지물질이 더 높게 나타났다.

뇨 중 아세트아미노펜 및 가지 대사체의 농도를 분석한 결과 두 그룹에서 모- 6

약물인 아세트아미노펜의 총 배설량에서 유의적인 차이를 보였으며 아세트아미,

노펜의 배설량이 그룹이 대조군에 비하여 더 적게 나타pseudo germ-free 났

다.

- 모약물인 아세트아미노펜의 뇨 중 배설량은 정상대조군에 비해 pseudo

군에서 더 작게 나타나는데 이는 동일 시간 동안에 혈중에 더 많은germ-free

아세트아미노펜이 남아있음을 나타내며 이는 혈중약물의 인, PK parameter

에서 확인하였다AUC data .

마마마마. Germ free-mouse model. Germ free-mouse model. Germ free-mouse model. Germ free-mouse model의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구

정상대조군 군 그리고 정착동물군 에서의 아- (SPF), germ-free (Gnotobiote)

세트아미노펜 및 대사체에 대한 분석을 진행했으며 이 세군에서 아세트아미노,

펜 및 그 대사체의 등 상의 유의적인 차이를 확인하였다AUC PK parameter .

바 항생제 투여에바 항생제 투여에바 항생제 투여에바 항생제 투여에.... 의한 의 대사변화를 위한 대사체의한 의 대사변화를 위한 대사체의한 의 대사변화를 위한 대사체의한 의 대사변화를 위한 대사체pseudo germ-free rat modelpseudo germ-free rat modelpseudo germ-free rat modelpseudo germ-free rat model

연구연구연구연구

- Global metabolic profiling 분석시스템의 안정화와 분석법의 재현성 확인

표본과 테스트믹스에 얻은 데이터에 대하여 다변량 분석과 추출이온 크로QC

마토그램 확인을 통해서 분석이 진행되는 동안 이온 강도와 머무름 시간에 유

의적인 차이가 나타나지 않을 확인하였다.

으로 내인성 대사체의 변화 확인- Global metabolic profiling

22222222////29292929


항생제 가지 을 경구 투여하여 확립한3 (neomycin, streptomycin, bacitracin)

에서 장내 미생물이 존재하였을 때와 존재하지pseudo germ-free rat model

않았을 때의 내인성 대사체의 변화를 살펴보기 위하여 global metabolic

을 진행하였고 변화를 보이는 대사체들에 대해서 와 조각profiling , extact mass

이온에 대한 정보를 확인하여 장내 미생물의 활성과 관련된 내인성 대사체 지

표물질을 확인하였다 아미노산 이소플라보노이드 리보플라빈 담즙산 등의 내. , , ,

인성 대사체들의 변화가 관찰되었다.

담즙산 그의 합성 전구체 및 대사체 정량 분석- ,

장간순환에 의행 영향을 많이 받는 내인성 대사체인 담즙산을 정량 분석하여

장내 미생물의 존재 유무에 따른 담즙산의 농도변화를 확인하였다.

제 세부제 세부제 세부제 세부< 2-2 >< 2-2 >< 2-2 >< 2-2 >


제 과제에서 제공된 분변 인 으로부터 장내 미생물 배양 여 가지1-2 (20 ) (500

균주 관찰됨)

배양된 여 균주를 가지 합성기질에 대하여 대사활성 측정 후 활성이100 21

높은 균주 선별하였음.

활성 높은 균주의 대량배양 및 활성 재측정 후 여개 선별 균주의 동정하, 100

였음.

활성 우수한 개 균주7 (BL-3, BL-1, Gam-6, Gam-2, JY-6, A-44,

를 선발하여 가지 합성기질에 대하여 대사활성 측정하였음L-BL-8) 21 .

가지 분리 균주를 혐기성배지에서 시간 배양 원심분리 초음파 처리하여4 24 , ,

조효소액 제조하였음.

조효소액을 혼합 하여(BL-3 : Gam-6 : JY-6 : A-44 = 1:10:10:5)

제조하였음microbial enzyme mix .

제조된 는 분변의 활성보다 약간 대사활성을 보였음microbial enzyme mix .

23232323////29292929



제 과제에서 제공된 분변 인 장내미생물 배양 여 가지 균주 관찰1-2 (20 ) (500

됨)

배양된 여 균주를 가지 합성기질에 대하여 대사 활성 측정 후 활성이 높70 21

은 균주 선별

활성 높은 균주의 대량배양 및 활성 재측정 후 여개 선별 균주의 동정, 51

활성 우수한 개 균주9 (PHS-BL-8, E-BL-8, K-BL-3, Y-BL-10,

를 선발하여 가지BH-GAM-9, JJ-BL-4, Hoon-BL-7, JY-6, A-44) 21

합성기질에 대하여 대사 활성 측정

분리 균주를 혐기성배지에서 시간 배양 원심분리 초음파 처리하여 조효소24 , ,

액 및 제조5-mix, 7-mix 9-mix

제조된 는 분변의 활성보다 높은 효소활성을 보였음microbial enzyme mix .

제조된 는 보다 안정하였으며 동결microbial enzyme mix(7-mix) fecalase ,

건조로 보관 시 활성 손실이 적었음.

제조된 는 천연기질 또는 추출물에 대하여 와 유사한 유전독7-mix fecalase

성을 보였음.

제조된 는 천연물 성분의 대사에도 높은 대사활성 나타내었음7-mix .

차년도에 제조된2 7-mix 약물대사 혼합효소액은 가지 효소활성을 비교분21

석한 결과 와 효소활성 패턴이 비스하나 효소활성은 도리어 높고, 1)fecalase ,

천연물에 미치는 돌연변이원성을 검색한 결과 유전독성을 나타내는 패턴이2)

유사하고, 3) 및baicalin, geniposide, wognoside, ginsenoside Rb1, rutin

등에 대한 대사활성을 조사한 결과 천연물의 대사활성이 비슷하고 안정성, 4)

이 높아 를 대신할 수 있을 것으로 판단됨(stability) fecalse .

24242424////29292929


연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론5.5.5.5.

제 세부제 세부제 세부제 세부< 2-1 >< 2-1 >< 2-1 >< 2-1 >

장내 미생물에 의한 내인성 대사체의 변화 및 약물의 변화- pharmacokinetic

를 검출하기 위하여 항생제 처리를 하여 장내 미생물을 사멸시킨 항생제 처리

쥐 을 유도하는 방법을 개발하였다(pseudo germ-free rat) .

또는 항생제 처리 모델에서 혈액 또는 뇨시료를 사용하여- Rat mouse

방법을 활용하여 생체시료 극미량 분석법을 개GC/MS, LC/MS, LC/MS/MS

발하고 대사체 구조의 동정에 활용하였다 또한 장내미생물 대사체 변화를 탐.

지하기 위하여 이나 다변량 분석법은 유용한 기법global metabolic profiling

인 것으로 사료된다.

장내 미생물에 의한 내인성 대사의 변화를 관찰하기 위하여 정상 쥐와-

항생제 처리 쥐 의 시료를 로pseudo germ-free rat( ) urine UPLC-TOF-MS

분석 한 후 연구를 이용하여 두 군에서 유의성 있는 차이를 보metabolomics

이는 대사체를 검출하였으며 그 결과 등과 같은 아미tryptophan, methionine

노산 대사체들과 이소플라보노이드나 리보플라빈과 같은 영양소 대사체들 담,

즙산과 그 전구체인 들oxysterol 이 장내 미생물에 의해 변화하는 것으로 관찰

되었다 따라서 장내미생물의 활성이 내인성 물질의 대사 프로파일에 중요한.

역할을 함을 확인하였다.

항생제 처리 전 후의 뇨시료에서 담즙산과 그 전구체인 의 농도- rat oxysterol

변화 및 대사 관련 효소 활성을 비교하였다 항생제 처리군에서 합성 전구체 중.

과 의 농도가 현저히 감소하였고 담즙산 중cholesterol 25-OH-cholesterol ,

의 농도도 감소하였다 반면 담즙산 대사체인deoxycholic acid . 5β

와 간 독성을 유발한다고 알려진-cholestane 3 ,7 ,12 -triolα α α

의 농도 증가가 뚜렷이 확인되었다 이와 관련하여chenodeoxycholic acid .

의cholesterol 7 -hydroxylase (cholesterol 7 -hydroxycholesterol)α α

활성은 증가하였고, 7 -dehydroxylase (cholic acid deoxycholic acid)α

와 의 활7 - dehydrogenase (chenodeoxycholic acid lithocholic acid)α

25252525////29292929


성은 감소하였음을 확인하였다 그러므로 이 결과로부터 항생물질 투여로 장내.

미생물이 없는 상태에서는 대사경로에 있는 대사과정에 변화가 생cholesterol

길 수 있음이 관찰되었으며 과 같은 간 독성을 유발 할chenodeoxycholic acid

수 있는 내인성 물질의 농도가 증가함으로써 간독성이 나타날 수 있음을 암시

해주고 있다.

의 항생제 처리군과 대조군에 각각 또는- Rat hesperidin 40 mg/kg baicalin

을 경구투여하고 혈장 농도를 분석하여 체내동태파라미터 및50 mg/kg AUC

Cmax를 비교하였을 때 두 물질 모두에서 공통적으로 대조군의 가 항생제, AUC

처리군에서 보다 높게 나타났다 이 결과로부터 항생제 처리군에서 장내미생물.

이 감소하여 배당체인 또는 의 대사가 감소되어 결국 흡수hesperidin, baicalin

되는 대사체의 량이 감소되기 때문인 것으로 사료된다 따라서 천연물 약물 한. , ,

약의 배당체는 장내미생물에 의해 대사에 영향을 미치므로 경구투여로 복용 시

미생물 대사가 고려되어야 함을 시사해 주고 있다 따라서 천연물 약물 등의. ,

주요 성분에 대해서는 미생물에 의한 대사 및 독성시험을 안전성 평가에 고려

되어야 할 것이다.

의 경구 투여 후 대조군과 비교시 항생제 처리모델에서- Esculetin(40 mg/kg) ,

의 에는유의성 있는 차이가 없었다 체내동태파라미터 중esculetin AUC . ,

k(hr-¹), t1/2 은 대조군에 비해 항생제 처리모델에서 통계처리상 유의성(hr)

있는 차이가 나타났다 의 경구 투여 후 대조군과 비교시. Esculin(40 mg/kg) ,

항생제 처리 모델에서 가 더 높게 측정되었다 체내동태파라미터 중AUC . ,

AUCINF, AUClast 에서 유의성 있는 차이가 나타났다 또한 이 대, CL/F . Esculin

사되어 이 검출되었다Esculetin .

을 사용한 대조군 및 항생제 처리군에 치자추출물- Rat (300 mg/kg

을 투여시 에 유의성 있는 차이가 나타나지 않았으나 분변시geniposide) AUC ,

료를 분석한 결과 항생체 처리군에서 의 양이 대조군에 비하여 현저geniposide

히 높게 나타남으로 미생물의 의한 에서 으로의 대사가 억제genposide genipin

된 것으로 나타났다 그러나 혈중에 가 검출되었으며 이는 장내에서. geniposide

의 형태로도 흡수가 되는 것을 나타냈다 항생제 처리군의geniposide .

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의 혈중 농도가 대조군에 비하여 높게 측정되었으나geniposide PK paramater

에서 통계적인 유의성은 나타나지 않았다 항생제 처리군에서는 미생물에 의한.

생성이 거의 억제되었음에도 불구하고 정상군과 항생제 처리군에서의genipin

프로파일이 유사하게 나타난 것은 정상군의 경우 가genipin geniposide

으로 대사된 후 이 위장관에 존재하는 등과 반응하여genipin genipin protein

혈중으로 흡수되지 못한 것으로 사료되었다.

- 혈장과 뇨 시료중의 아세트아미노펜과 종의 대사체를 로 분석하는6 LC-MS

방법을 확립하였다 정상 쥐와 에 의 아세트. psedo germ-free rat 200 mg/kg

아미노펜을 경구 투여하고 혈장과 뇨 시료를 채취하여 확립된 분석법LC-MS

으로 분석하였다 분석 결과 를 제외한 모든 포합체의 혈중 농도는. APAP-Sul

증가하는 경향을 보였으며 는 혈중 농도는 감소하였고 뇨 중 배설, APAP-Sul

도 감소하는 경향을 보였다 간에서 생성된 포합체 대사체들은 장내 미생물에.

의해 분해되어 에 의해 재 흡수되는 정도가 낮다 장enterohapatic circulation .

내미생물이 없는 상태에서는 장내미생물에 의한 대사체 분해가 진행되지 않으

므로 대사체들의 재 흡수율이 높아져서 혈중 대사체들의 농도가 증가되는 경향

을 보이는 것으로 사료된다 은 정상상태에서 의 대사체 중. APAP-Sul APAP

가장 높은 비율로 생성되기 때문에 의 포합반응효율은 의APAP sulfate APAP

체내동태에 큰 영향을 줄 것으로 사료된다 에서. Pseudo germ-free rat

의 혈 중 농도가 감소하는 경향을 보이는 것은 장내미생물의 활성APAP-Sul

결여로 간에서의 포합반응 효율이 영향을 받았다는 것을 암시하며 모약sulfate

물인 의 혈 중 농도 증가의 한 원인으로 사료된다APAP .

에서의 의 체내동태 연구에서는 가- Germ-free mouse APAP APAP-Glc

의 대사체 중 가장 높은 비율로 생성되었고 대사체들의 체내 동태 변화APAP ,

가 에 의한 재 흡수율의 변화 보다는 포합대사효율의enterohepatic circulation

변화에 기인하는 것으로 사료된다 이는 장내미생물의 활성 변화의 영향이 종간.

차이가 있음을 시사한다 에서 관찰되었던 포합 대사체의. Germ-free mouse

체내동태 변화는 에서 정상 와 유사하게 회복되는 경gnotobiota mouse mouse

향을 보였지만 완전하지 않았다 따라서 상태에서 정상상태로의 회. germ-free

복은 실험진행기간보다 더 오랜 기간이 필요하거나 완전하지 않을 것으로 사료,

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된다.

제 세부제 세부제 세부제 세부< 2-2 >< 2-2 >< 2-2 >< 2-2 >

본 연구과제의 목적은- 합성기질과 천연성분의 대사활성에 대한 기질 특이성을

분석하여 분변효소 를 대신할 수 있는 약물대사 혼합효소(fecalase)

를 제조하는데 있다(intestinal microbial enzyme mixture) .

약물대사 혼합효소의 제조는- 식품 및 의약품의 대사활성 및 독성에 분변효소

가 미치는 영향을 파하기 위하여 사람으로부터 분변효소를 채취하는데 있어서

임상윤리위원회를 거치는 등 과정의 까다로움과 번거로움 그리고 분변효소의,

낮은 활성 및 쉽게 변질되는 여러 문제를 해결하기 위할 뿐만 아니라 학술적인

목적으로도 그 가치가 높다고 보인다.

이에 대한 증거로- -80o 에서 냉동보관한 분변 효소액 의C (fecalase) β

에 대한 효소활성이 주일 이내에 이상 소실되는 것에-Glucuronidase 1 50%

반해 차년도에 제조한 혼합효소액의 효소활성은 주 내에는 안정하였, 1 4-mix 1

으며 주 보관 후에도 정도만 소실되었다, 2 15% .

따라서- , 약물대사 혼합효소를 제조하기 위하여 먼저 분변에 존재하는 다양한

미생물로부터 분변활성을 대표할 수 있는 균주들을 분리 대량배양 및 이로부, ,

터 조효소액을 얻는 것이 필요하다.

따라서 차년도 연구에서 사람의 신선한 분변 인 으로부터 여종- , 1, 2 (20 ) 1,000

이상의 균주를 분리하고 이들을 가지의 효소활성을 측정하고 효소활성이, 21 ,

특이하게 보이는 여개의 균주를 선별하였다170 .

- 분리된 균주는 그람 염색 혐기 호기적 배양조건 및, / 16S rRNA gene partial

분석을 하고 이를sequence , 로 비교 분석하여 동정하고NCBI Blast search ,

이들의 가지 효소활성을 측정한 후 대표적인 균주들을 선별하였다21 .

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균주로부터 조효소액의 제조조건 확립 안전성 및 보관방법에 의한 효소활성- ,

의 변화 등을 검토한 결과 균주액을 초음파로 분 처리한 후 여과하고 이를, 7 ,

동결건조한 경우 효소활성이 가장 안정된 것을 파악하였다.

선별균주들을 등 다양한 조합의- 4-mix, 5-mix, 7-mix, 9-mix 약물대사 혼

합효소액을 제조하고 이들의 효소활성을 분변효소 의 효소활성과 패, (fecalase)

턴을 비교하였다.

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2중단위 결과 요약

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