第2回バイオインフォマティクス実習・実践

東京医科歯科大学

統合教育機構

教養部 数学科

中林潤

今日の内容

• 次世代シーケンサーの概説

原理、データのフォーマット

• コンピュータの操作

GUIとCUI、ターミナル上でのコマンドの入力法

• Hisat2

マッピング用プログラムHisat2を使って、データベースにアクセス

し、参照ゲノムにマッピングする

• Integrative Genomics Viewer

マッピングされたSAMファイルからインデックス、カウントデータ

を作成、画面に表示する

カバー率 = (N × L) / G : 1塩基当りの断片数リード数 : Nリード数 : Lゲノム長 : G

…AGGTGCATGCCGCATCGATCGAGC…

AGGTGCATG

GCATGCCGCATGCATCGATCGAGC

paired endsingle end

ゲノム

リード

DNAを断片化して配列を読む→参照ゲノムにマッピング→配列を再構成する

カバー率が十分でないと正確な配列情報が得られない。

次世代シーケンスデータ

• 1行目：＠配列ID

• 2行目：塩基配列

• 3行目：+配列ID 説明

• 4行目：クオリティー値（シーケンスエラーの生じる確率）

＠Seq-ID

AGGTGCATCGATGCGCGAATAAT

+

!1’’*))++//?”AAA{{

FASTQファイルフォーマット

ATGC

EGFR

正常組織

非微小乳頭がん

微小乳頭がん

マッピングした配列の例（Whole Exome Sequencingの場合）

SRA Sequence Read Archive

raw sequence dataが登録されているデータベース

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra

• Graphical User Interface (GUI)

コンピュータのディスプレイ上で、アイコンや画像などを多用し、マウスなどのポインティングデバイスで直感的操作を可能とするユーザーインターフェース

• Character User Interface (CUI)

コマンドや情報を文字によって表示し、コンピュータの操作を行うユーザーインターフェース

PCの操作方法（GUIとCUI）

• CUI環境を提供するプログラム

•ターミナル上でコマンドを入力して、プログラムを実行する

•実行結果がターミナル上に文字で表示される

• Windows10ではUbuntu18.04、Macではターミナルを使う

ターミナル（端末）

ファイルの階層構造

C:

ユーザー

プログラムファイル

ユーザー名

Microsoft Office

IGV 2.8.2

R

ダウンロード

デスクトップ

ピクチャ

ｈisat2-2.2.0Documents

USER@DesktopPC X

$cd /mnt/c/Users/ユーザ名/Documents/hisat2-2.2.0

ｈg19

Hisat2の書式

USER@DesktopPC X

$ ./hisat2 -p CPU数 -x 参照ゲノム --sra-acc SRA_accession_number -S 出力ファイル名.sam

-x：参照ゲノムを指定--sra-acc：SRAデータベースのアクセション番号を指定-S：出力ファイル名 SAMフォーマットで出力-p：使用するCPU数

USER@DesktopPC X

$ ./hisat2 -p 4 -x ../hg19/genome --sra-acc SRR11619645 -S SRR11619645.sam

Hisat2の実行

http://www.broadinstitute.org/igv/

Integrative Genomics Viewer (IGV)

マッピングされた配列断片の可視化ツール

ゲノムを選択 hg19

トラック

リファレンスゲノム

Genomeの選択

igvtoolsのウインドウが開くCommandメニューを選択

IGV tools

• igvtoolsでsamファイルを染色体順にソートします。

コマンドメニューからSortを選択

Input fileからSRR11619645.samを選択

runボタンをクリック

SRR11619645.sorted.samファイルが出力されます。

SAM fileのソート

• igvtoolsでインデックスを作成

コマンドメニューからIndexを選択

Input fileからSRR11619645.sorted.samを選択

runボタンをクリック

SRR11619645.sorted.sam.saiファイルが出力されます

indexの作成

TDFファイルの作成

• igvtoolsでカウントデータを作成

コマンドメニューからCountを選択

Input fileからSRR11619645.sorted.samを選択

runボタンをクリック

SRR11619645.sorted.sam.tdfファイルが出力されます

fileメニューLoad from FileからSRR11619645.sorted.sam とSRR11619645.sorted.sam.tdfを選択してアップロード

fileのupload

遺伝子名PSMB4を入力

タグ：配列の断片

遺伝子を選択して表示

今日のまとめ

• Hisat2を使ってSRAデータベースから配列断片の情報を取得し、参照ゲノムにマッピングする

• Integrative Genomics ViewerでSAMファイルのソート、インデックスの作成、カウントファイルを作成する

•作成されたファイルをIGVにアップロードして可視化する

マッピングはNGS解析の第一歩

https://www.nasa.gov/audience/forstudents/5-8/features/nasa-knows/who-was-neil-armstrong-58.html

次回のための準備

•統計解析ソフトRのインストール

• BiocManagerパッケージのインストール

• edgeRパッケージのインストール

統計解析ソフトRのインストール

• Rはオープンソース・フリーソフトウェアの統計解析用プログラム言語およびその開発実行環境

•オークランド大学のRoss IhakaとRobert Clifford Gentlemanによって開発された

•現在はR Development Core Teamによってメンテナンスされている

Rのダウンロードとインストール

•日本のミラーサイト

https://cran.ism.ac.jp

https://ftp.yz.yamagata-u.ac.jp/pub/cran/

から自分のPCのOSに合った（Windows または Mac）インストーラーをダウンロードする

•ダウンロードしたインストーラーをダブルクリックして実行する

•途中の質問はすべてデフォルト状態でインストールする

各OSのインストーラへのリンク

Windowsの場合

baseをクリック

R-4.0.0が最新バージョン

インストーラーへのリンク

Windowsの場合

• RToolsのインストール

https://cran.r-project.org/bin/windows/Rtools/

rtools40-x86_64.exeをクリックしてダウンロード

RToolsへのリンク

Rtoolsをクリック

rtools40-x86_64.exe

インストーラーへのリンク

Macの場合 インストーラーへのリンク

XQuartzのインストール

• https://www.xquartz.org/

からインストーラーをダウンロード

ダウンロードしたインストーラーをダブルクリックして展開、実行する

インストーラーへのリンク

BiocManagerとedgeRのインストール

R X

>install.packages(“BiocManager”)>BiocManager::install(“edgeR”)

Gene Expression Omnibus

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/

入力欄にGSE143213と入力して検索

GSE143213

GSE143213_read_comut_bulk.txt.gzをクリックしてダウンロード

参考資料

•データの元論文

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7010798/pdf/41467_2020_Article_14442.pdf

•次回の実習で実行するRコマンド

https://qiita.com/junakabayashi/items/a3ba6b2c05691a5de38d

アンケートにご協力ください。

第2回実習簡易アンケート QRコード

https://www.yokohama-cu.ac.jp/amedrc/section/support/bioinfomatics2.html

先端医科学研究センター バイオインフォマティクス解析室のHPからアンケートにアクセス