2. laboratorijas darbs. spektrofotometrija
DESCRIPTION
Studiju kurss Bioloģija (biologiem). Bloks Šūnas bioloģija, bioķīmija, ģenētika. 2. laboratorijas darbs. Spektrofotometrija. Māris Lazdiņš [email protected] LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra. Kas ir gaisma?. - Kvantu plūsma. - Noteikta diapazona elektromagnetiskais starojums. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
1
2. laboratorijas darbs.
Spektrofotometrija.Spektrofotometrija.
Māris Lazdiņš [email protected]
LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra
Studiju kurss Bioloģija (biologiem)
Bloks Šūnas bioloģija, bioķīmija, ģenētika
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
2
- Kvantu plūsma.
- Noteikta diapazona elektromagnetiskais starojums.
Kas ir gaisma?Kas ir gaisma?
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
3
Kas ir gaisma?Kas ir gaisma?
Elektromagnetiskā starojuma viļņu garums - (nm).
C = 300 000 km/s
- attālums, kuru starojums veicis vienas svārstības laikā.
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
4
Kas ir gaisma?Kas ir gaisma?
Elektromagnetisko starojumu pēc tā- īpašībām un- mijiedarbības ar dzīvās un nedzīvās dabas objektiem
iedala vairākos diapazonos:
diapazons
10 km – 1 mm - radiodiapazons1 mm – 800 nm - infrasarkanais starojums800 nm – 350 nm - redzamā gaisma350 nm – 1 nm - ultravioletais starojums1 nm – 10 pm - rentgena starojums10 pm – 100 fm - starojums
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
5
Redzamā gaismaRedzamā gaisma
krāsa
760 nm – tumši sarkans660 nm – sarkans590 nm – oranžs560 nm – dzeltens500 nm – zaļš480 nm – gaiši zils450 nm – zils380 nm – violets
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
6
Kā mēra gaismas un vielas mijiedarbību?Kā mēra gaismas un vielas mijiedarbību?
Transmisija – (T = I2/I1)
Transmisijas % – T% = (I2/I1) 100
Transmisijas% parāda cik % starojuma izkļuvuši cauri videi.
I1 I2
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
7
Kā mēra gaismas un vielas mijiedarbību? Kā mēra gaismas un vielas mijiedarbību?
Turpinot pētījumus noskaidrojās, ka T ir atkarīga no:
- starojuma ceļa garuma;- vielas koncentrācijas šķīdumā;- izmantotā starojuma ;- konkrētai vielai raksturīga starojuma absorbcijas koeficienta pie noteikta starojuma .
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
8
Kā mēra gaismas un vielas mijiedarbību? Kā mēra gaismas un vielas mijiedarbību?
Sakarību apraksta Bera likums:
T=10-kcl
k – konkrētai vielai raksturīgs starojuma absorbcijas koeficients pie noteikta starojuma ;
c – vielas koncentrācija šķīdumā;l – starojuma ceļš cauri šķīdumam.
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
9
Kā mēra gaismas un vielas mijiedarbību? Kā mēra gaismas un vielas mijiedarbību?
Praksē bieži izmanto Lamberta – Bera likumu un mērvienības:
Absorbcija (A)Ekstinkcija (E)Optiskais blīvums (D; OD)
A = - lg(T) = kcl
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
10
Kādas iekārtas izmanto spektrofotometrijā?Kādas iekārtas izmanto spektrofotometrijā?
Spektrofotometrs (SF)
Starojuma avots
Kondensors Dispersijas sistēma
Optiskā sprauga
Kivete ar paraugu
Starojuma intensitātes mērītājs
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
11
Kādas iekārtas izmanto spektrofotometrijā?Kādas iekārtas izmanto spektrofotometrijā?
Fotoelektrokolorimetrs (FEK)
Starojuma avots
KondensorsOptiskie filtri
Kivete ar paraugu
Starojuma intensitātes mērītājs
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
12
Absorbcijas spektrsAbsorbcijas spektrs
Grafiks - absorbcijas (optiskā blīvuma) atkarība no viļņu garuma
(nm)
OD(o.v.)
400 450 500 550 600 650 700
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
13
Cilvēka acs jūtībaCilvēka acs jūtība
(nm)
%100
80
60
40
20
0
400 450 500 550 600 650 700
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
14
Absorbcijas spektrsAbsorbcijas spektrs
Grafiks - absorbcijas (optiskā blīvuma) atkarība no viļņu garuma
400 450 500 550 600 650 700 (nm)
OD(o.v.)
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
15
Absorbcijas spektrsAbsorbcijas spektrs
Grafiks - absorbcijas (optiskā blīvuma) atkarība no viļņu garuma
400 450 500 550 600 650 700
OD
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
16
Absorbcijas spektrsAbsorbcijas spektrs
Grafiks - absorbcijas (optiskā blīvuma) atkarība no viļņu garuma
400 450 500 550 600 650 700
OD
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
17
Absorbcijas spektrsAbsorbcijas spektrs
400 450 500 550 600 650 700
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
18
Pie darba ?Pie darba ?
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
19
Absorbcijas spektra noteikšanaAbsorbcijas spektra noteikšana
(nm) OD1 (o.v.) OD2 (o.v.)
400420440460480500520540
1. tabula
(nm) OD1 (o.v.) OD2 (o.v.)
560580600620640660680700
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
20
Absorbcijas spektra noteikšanaAbsorbcijas spektra noteikšana
400 450 500 550 600 650 700
OD
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
21
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
22
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
23
Ūdens un sausnas satura noteikšanaŪdens un sausnas satura noteikšana
2.1.
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
24
Proteīnu kvantitatīva noteikšanaProteīnu kvantitatīva noteikšana
2.2. Pamatā - krāsu reakcija
Bradfordas + proteīni => zils krāsojums reaģents (mērījumiem izdevīgs (brūns) = 590 nm - oranža gaisma)
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
25
Proteīnu kvantitatīva noteikšanaProteīnu kvantitatīva noteikšana
http://www.histosoft.com/services/background/ba/baback.html#ref
http://en.wikipedia.org/wiki/Bradford_protein_assay
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
26
Proteīnu kvantitatīva noteikšanaProteīnu kvantitatīva noteikšana
2.3. - reakcijas “kalibrēšana”
Reakciju veic ar zināmas koncentrācijas proteīnu (BSA)šķīdumiem, -
lai iegūtu OD sakarību ar proteīnu koncentrāciju.
0,1 mg/ml,0,3 mg/ml,0,5 mg/ml, 0,8 mg/ml.
Ar katras koncentrācijas šķīdumu veic 3 atkārtotas reakcijas / mērījumus.
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
27
Proteīnu kvantitatīva noteikšanaProteīnu kvantitatīva noteikšana
2.4. Reakcijas un mērījumu gaita:
1. Kivetē iepilda 2 ml Bradfordas reaktīva (2 reizes pa 1000 l).
Kivetes ņemt aiz rievotajām/matētajām malām!
Sekojiet, lai kivetes rievotās/matētās malas neievietotu gaismas ceļā!
Pārbaudiet vai FEK uzstādīts oraņžais filtrs.
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
28
Proteīnu kvantitatīva noteikšanaProteīnu kvantitatīva noteikšana
2.4. Reakcijas un mērījumu gaita:
2. Nospiežot pogu „R“, aparātu iestāda uz D = 0 (T% = 100).
Ieslēgt / izslēgt
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
29
Proteīnu kvantitatīva noteikšanaProteīnu kvantitatīva noteikšana
2.4. Reakcijas un mērījumu gaita:
3. Izņem kiveti un pievieno 20 l proteīnu šķīdumu.
4. Ar 1000 µl automātiskās pipetes palīdzību (iesūcot un izpūšot) samaisiet šķīdumus un ielieciet kiveti FEK.
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
30
Proteīnu kvantitatīva noteikšanaProteīnu kvantitatīva noteikšana
2.4. Reakcijas un mērījumu gaita:
5. Pēc 1 minūtes izdara mērījumu, nospiežot taustiņu „T“.
6. Rezultātu pierakstiet 3. tabulā.
T
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
31
Proteīnu kvantitatīva noteikšanaProteīnu kvantitatīva noteikšana
2.4. Reakcijas un mērījumu gaita:
Katrai reakcijai jālieto jauna kivete!
Katrai kivetei ar reaģentu individuāli jāiestāda OD = 0,00 (nospiežot kontroles (references) taustiņu “R”).
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
32
Proteīnu kvantitatīva noteikšanaProteīnu kvantitatīva noteikšana
2.3. - reakcijas “kalibrēšana”
3. tabulā jāieraksta reakcijā izmantoto proteīnu (BSA) masa.
0,1 mg/ml,0,3 mg/ml,0,5 mg/ml, 0,8 mg/ml.
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
33
Proteīnu kvantitatīva noteikšanaProteīnu kvantitatīva noteikšana
2.5. Reakcijas “kalibrēšanas” grafiks
Pēc iegūtajiem rezultātiem uz milimetru papīra konstruē graduācijas grafiku.
- uz X ass atliek proteīnu masu (g), kura ar 20 l BSA šķīduma tika ienesta reakcijā.
- uz Y ass atliek vidējo nomērīto optisko blīvumu (o.v.).
Vienības uz asīm izvēlieties tā, lai racionāli tiktu izmantots viss milimetru papīra laukums!
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
34
Proteīnu kvantitatīva noteikšanaProteīnu kvantitatīva noteikšana
2.5. Reakcijas “kalibrēšanas” grafiks
D(o.v.)
g BSA / 20 l šķīduma
.
..
. Grafikam jāsanāk lineāram!
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
35
Proteīnu kvantitatīva noteikšanaProteīnu kvantitatīva noteikšana
2.6. Proteīnu kvantitēšanas reakcijas analizējamo pārtikas produktu lizātiem.
Veic reakcijas un mērījumus ar pārtikas produkta lizātu.(2 atkārtojumus)
Rezultātus ieraksta 4. tabulā un aprēķina vidējo vērtību.
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
36
Proteīnu kvantitatīva noteikšanaProteīnu kvantitatīva noteikšana
2.6. Proteīnu kvantitēšanas reakcijas analizējamo pārtikas produktu lizātiem.
D(o.v.)
g BSA / 20 l šķīduma
.
..
.
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
37
Proteīnu kvantitatīva noteikšanaProteīnu kvantitatīva noteikšana
3.2. Proteīnu satura aprēķini produktos.
No grafika nolasītos rezultātus ieraksta arī 5. tabulā.
Tabulā apkopo arī grupas biedru rezultātus (proteīnu g / 20 l šķīduma, nevis OD !!! ).
Veic aprēķinus un izsaka:- proteīnu daudzumu (g) 100 g svaiga produkta;- % no sausnas masas.
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
38
Veiksmi darbāVeiksmi darbā
10.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
39
Uz nākošo nodarbību Uz nākošo nodarbību (mājas darbs)(mājas darbs)
Rezultātu apstrāde un secinājumi:
3.1. 3.2.
!